本发明涉及受污染场地生物降解处理技术领域，尤其是涉及一株降解氯乙烯类有机物的菌株及其在氯乙烯类有机物污染土壤或地下水修复中的应用。
背景技术：
三氯乙烯(tce)是无色透明液体，可代替苯和汽油作为溶剂，被广泛用于工业生产中。tce在环境中易发生迁移，可通过挥发、容器泄漏和废水排放等途径进入环境，成为土壤和地下水有机污染中最普遍的污染物。三氯乙烯不仅污染环境，对人体健康也有很大的影响，具有“三致”作用，被生态环境部与国家卫生健康委员会列入了《有毒有害水污染物名录(第一批)》。三氯乙烯降解产物二氯乙烯(dce)和氯乙烯(vc)也都是有毒致癌物质，威胁人类健康。
微生物降解法是指将毒害污染物转化为毒害较小、甚至无毒害的代谢产物的降解方法，与传统的物理或者化学降解方法相比，对环境不造成二次污染，因此成为处理氯乙烯类污染的主要方式。
tce既可以通过好氧共代谢途径降解，又可以在适宜条件下被厌氧生物降解。由于土壤和地下水环境通常是厌氧条件，研究表明厌氧还原脱氯对于高氯代溶剂是主导的生物化学过程。目前，已知能够降解氯乙烯类污染物的厌氧混合菌群或菌株，大部分只能将三氯乙烯降解成二氯乙烯，甚至会产生毒害更严重的氯乙烯。只有dehalococcoidesmccartyi的菌株可以完全降解三氯乙烯、二氯乙烯和氯乙烯至乙烯。
技术实现要素：
本发明的第一个目的在于提供一株降解氯乙烯类有机物的菌株，为氯乙烯类污染场地的修复提供高效的生物菌剂，为降解土壤中氯乙烯类污染物提供新的种质资源。
本发明的第二个目的在于提供一种降解氯乙烯类有机物的菌株在氯乙烯类有机物污染土壤或地下水修复中的应用，可高效降解土壤或地下水中氯乙烯类污染物。
为了解决上述第一个技术问题，本发明提供了一株降解氯乙烯类有机物的菌株，该菌株命名为geo，经分子生物学鉴定属于脱卤拟球菌属(dehalococcoidesmccartyi)，于2019年7月23日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc18288。
优选地，该菌株为严格厌氧菌，无鞭毛不可运动及圆盘状细菌，直径在0.3-1微米，厚度为0.1-0.2微米。
为了解决上述第二个技术问题，本发明还提供了一种降解氯乙烯类有机物的菌株在氯乙烯类有机物污染土壤或地下水修复中的应用，所述氯乙烯类有机物为三氯乙烯、1,1-二氯乙烯、反-1,2-二氯乙烯、顺-1,2-二氯乙烯和氯乙烯中的一种或两种或两种以上。
优选地，所述菌株的接种量为103～105个/ml。
与现有技术相比，本发明菌株存在如下有益效果：
(1)本发明菌株geo能够将有害的三氯乙烯、1,1-二氯乙烯、反-1,2-二氯乙烯、顺-1,2-二氯乙烯和氯乙烯经过脱氯，完全降解为无毒害的乙烯，同时在降解过程中不会累积产生二氯乙烯和氯乙烯等对有害的中间体；
(2)本发明菌株geo的vcra基因表达蛋白能以268nmol/min/mg的速率完成氯乙烯的脱氯反应，比目前报道的其它菌株快两倍。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
下面结合附图和具体实施方式对本发明的降解氯乙烯类有机物的菌株及其在氯乙烯类有机物污染土壤或地下水修复中的应用作进一步的详细描述。
图1为本发明dehalococcoidesmccartyigeo菌株对氯乙烯类污染土壤的降解效果示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件能够以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一株降解氯乙烯类有机物的菌株，该菌株命名为geo，经分子生物学鉴定属于脱卤拟球菌属(dehalococcoidesmccartyi)，于2019年7月23日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc18288。
该菌株为严格厌氧菌，无鞭毛不可运动及圆盘状细菌，直径在0.3-1微米，厚度为0.1-0.2微米。
本发明还提供了一种降解氯乙烯类有机物的菌株在氯乙烯类有机物污染土壤或地下水修复中的应用，所述氯乙烯类有机物为三氯乙烯、1,1-二氯乙烯、反-1,2-二氯乙烯、顺-1,2-二氯乙烯和氯乙烯中的一种或两种或两种以上。
所述菌株的接种量为103～105个/ml。
实施例1本发明菌株geo的富集培养、纯化、筛选及鉴定
(1)液体培养基制备：
去离子水1000ml、1gnacl、0.5gmgcl2·6h2o、0.2gkh2po4、0.3gnh4cl、0.3gkcl、0.015gcacl2·2h2o、30mmnahco3、1.5mgfecl2·4h2o、0.1mgmncl2·4h2o、0.2mmna2s，厌氧处理，ph＝7.2-7.4，121℃灭菌20min。
随后加入10mm乙酸，0.33atm氢气和0.65mm三氯乙烯。
(2)菌株的富集培养、纯化：
从厌氧活性污泥中取得污泥样品，在液体培养基中加入10mm乙酸，0.33atm氢气和0.65mm三氯乙烯，经3个月避光静置恒温30℃培养后，经检测获得能够完全降解至乙烯的初代培养物。经过至少三代的富集培养获得无沉积物混合菌液。
(3)菌株的分离与纯化
将富集的培养液继续30代连续稀释培养，随后混凝培养获得单一菌落。在富集筛选培养过程中，通过对氯乙烯降解的检测确保菌株的生物降解活性。
(4)菌种鉴定
从菌株中提取基因组dna,利用16srdna对菌株进行序列分析：
16srdna利用通用引物27f(5’-agtttgatcmtggctcag-3’)和1492r(5’-ggttaccttgttacgactt-3＇)进行pcr扩增。
从菌株中提取基因组dna,利用vcra对菌株进行定量检测：
vcra基因利用vcra11f(5’-gtatggtccgccacatgattc-3’)和vcra11r(5’-tcttctggagtaccctcccattt-3’)进行实时荧光定量pcr扩增。
通过与ncbigenbank数据库进行对比，16srdna与脱卤拟球菌相似度最高，达到99.9％，初步确定菌株为脱卤拟球菌，并将其命名为dehalococcoidesmccartyistraingeo。
实施例2菌株geo在氯乙烯类污染土壤修复中的应用
菌悬液制备：将菌株转接至加入10mm乙酸、0.33atm氢气和0.65mm三氯乙烯的液体培养基，避光静置恒温30℃培养14d。将培养的菌液10,000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤3次后制成菌悬液。
本试验所采用的污染土壤采集于新加坡某河口处地下15-20cm处，采集回来的土壤以20％的体积比例加入液体培养液形成土壤混合液，在160ml厌氧培养瓶中加入100ml土壤混合液和10mm乳酸，去除土壤混合液溶解氧后按105个/ml菌株geo接种量进行接种，ph7.2-7.4,恒温30℃避光静置，培养12d。每两天取气相样品100μl，检测代谢产物。
菌株geo对污染土壤降解效果如图1所示，菌株geo对三氯乙烯污染土壤具有很好的降解效果，实验8d，土壤中三氯乙烯降解率达到100％，实验12d，降解三氯乙烯过程中产生的中间产物氯乙烯也全部降解完毕。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一株降解氯乙烯类有机物的菌株，其特征在于，该菌株命名为geo，经分子生物学鉴定属于脱卤拟球菌属(dehalococcoidesmccartyi)，于2019年7月23日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc18288。
2.根据权利要求1所述的降解氯乙烯类有机物的菌株，其特征在于，该菌株为严格厌氧菌，呈圆盘型。
3.一种如权利要求1所述的降解氯乙烯类有机物的菌株在氯乙烯类有机物污染土壤或地下水修复中的应用。
4.根据权利要求3所述的降解氯乙烯类有机物的菌株在氯乙烯类有机物污染土壤或地下水修复中的应用，其特征在于，所述氯乙烯类有机物为三氯乙烯、1,1-二氯乙烯、反-1,2-二氯乙烯、顺-1,2-二氯乙烯和氯乙烯中的一种或两种或两种以上。
5.根据权利要求3至4任一项所述的降解氯乙烯类有机物的菌株在氯乙烯类有机物污染土壤或地下水修复中的应用，其特征在于，所述菌株的接种量为103～105个/ml。
技术总结