本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株多粘类芽孢杆菌及其在梨树病害防治中的应用。
背景技术：
梨是世界性主要水果之一。近几年我国梨树的栽培面积在90万公顷以上，产量稳定在1600万吨左右，均占世界的三分之二以上，梨产业的健康发展对我国甚至世界水果行业的发展至关重要。病害是限制梨产业健康发展的重要因素之一，我国梨树以炭疽病、轮纹病、腐烂病、黑星病等真菌病害为害为主。炭疽病为害叶片果实，2008年在梨果重要产地安徽省砀山县大爆发，病果率高达70%以上，果农损失惨重。近年来炭疽病造成南方梨产区发生早期落叶现象，严重影响梨树翌年的开花结果，炭疽病已成为我国梨产区重点防治对象。轮纹病为害枝干、叶片和果实，发生严重时枝干发病率达100%，病果率可达30％～50％，贮藏1个月后几乎全部烂掉。腐烂病为害枝干，具有发病率高、发生区域广、难以控制的特点，发病严重的梨园，树体病疤累累、枝干残缺不全，甚至造成大量死树或毁园。
我国农作物病害防治长期以喷施化学药剂为主，化学农药的长期使用使病原菌产生抗性，导致用药量持续加大，防效逐年降低，给生态环境和农产品质量安全带来严重负面影响。生物防治利用有益微生物控制病原微生物，对环境安全无污染，在绿色防控中发挥重要作用。目前除了黑星病外，我国梨树上登记的防治药剂极少，尤其生防微生物还未有登记。持续开发、挖掘高效生防微生物资源对保护环境和农业安全健康生产意义重大。
多粘类芽孢杆菌（paenibacilluspolymyxa）属于我国第一级免做安全鉴定的菌种，是ash等人于1994年从原来的芽孢杆菌属中重新划分归类的菌属，也是重要的植物根际促生菌。目前国内登记了13个多粘类芽孢杆菌的母药和杀菌剂产品，在大田作物和果蔬上广泛使用，可防治小麦赤霉病、水稻纹枯病、黄瓜角斑病、西瓜炭疽病、番茄青枯病等，还未在梨上登记使用。
本发明以梨树主要真菌病害为靶标，从生防微生物中筛选到具有较强拮抗活性的多粘类芽孢杆菌，初步制备了生防菌剂进行应用，为果树病害的生物防治提供新的资源。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一株具有广谱抗菌效果的多粘类芽孢杆菌，该菌株对多种梨树病原真菌表现显著的拮抗效果，可弥补目前公开的专利中对于梨树病害生物防治的不足，在生物农药技术领域具有广泛的应用前景。
本发明实现的技术步骤：
采用稀释涂布分离法从果树根际土壤中分离筛选获得生防菌株fx1，该菌株在固体平板上对梨炭疽病菌、轮纹病菌、腐烂病菌和黑斑病菌均表现较强的拮抗效果。采用菌落菌体形态观察、生理生化指标、16s和gyrb基因序列测定等方法，鉴定fx1为多粘类芽孢杆菌（paenibacilluspolymyxa）fx1。菌株于2020年9月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏编号为cgmccno.20680，其序列如seqidno:1所示。
所述菌株在na培养基上的菌落特征：表面光滑无褶皱，乳白色，不透明状，菌体呈杆状，革兰氏染色呈阴性，可产芽孢。
本发明所述的多粘类芽孢杆菌的应用，以该菌株为基础制备成生防菌剂，用于但不仅限于防治梨炭疽病、梨轮纹病、梨黑斑病、梨腐烂病等真菌病害。
本发明所述的菌剂获得方法：挑取固体培养基质上的多粘类芽孢杆菌（paenibacilluspolymyxa）fx1接种于液体nb培养基，在25-28℃、120-180rpm转速下培养24-36h，调节od600=1.0，以体积比1-2%的比例接入nb培养基扩大培养，相同条件下培养48-72h，加入质量浓度为0.2%的苯甲酸钠，获得生防菌剂。
进一步的，nb培养基的组成：蛋白胨5g/l，蔗糖10g/l，酵母粉1g/l，牛肉浸膏3g/l，加水定容后调节ph为7.0，于121℃高压蒸汽灭菌20-25min。
进一步的，所述的多粘类芽孢杆菌菌剂防治梨炭疽病和轮纹病、黑斑病，在梨树落花后7~10天进行喷施，根据天气和生长期10-15天一次，下雨后及时补喷，直到套袋前结束。优选的，喷施菌剂中的菌体浓度为1×108-1×109cfu/ml。
进一步的，所述的多粘类芽孢杆菌菌剂防治梨树腐烂病，将菌剂添加助剂、成膜剂等成分后做成凝胶剂，在春季、秋季涂抹在梨树腐烂病病疤处，促进病疤伤口愈合。
与现有技术比，本发明的有益效果是：
本发明提供的多粘类芽孢杆菌fx1是一种具有广谱拮抗活性的生防微生物资源，对梨树病害具有较好的防治效果，它的使用可以改善果园微环境，抑制病菌生长流行，可减少化学农药用量，保护生态环境安全，提高果实品质，具有良好的社会经济效益。
附图说明
图1为多粘类芽孢杆菌fx1在na平板上的菌落形态图；
图2为多粘类芽孢杆菌fx1在pda平板上拮抗梨树病原真菌的效果图；
其中图a为接种示意图，在直径9cm的pda平板培养皿中央接入直径5mm的病原真菌菌块，在皿的上、下、左侧接3μl培养好的fx1菌液，皿的右侧不接菌液，留作空白对照；图b、c、d、e分别为接种梨炭疽病菌（colletotrichumfructicola）、梨轮纹病菌（botryosphaeriadothidea）、梨黑斑病菌（alternariaalternata）、梨腐烂病菌（valsapyri）并培养5天后的拮抗效果图。
图3为多粘类芽孢杆菌fx1菌剂在室内对梨炭疽病的抑制作用；
其中图a为阴性清水对照，图b为接种梨炭疽病菌阳性对照，不喷施fx1菌剂，图c为接种炭疽病菌一天后喷施fx1菌剂，三图均为接种后7天的病斑扩展结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明。
实施例1：
以下结合具体实施方式对本发明进行详细说明，但并不限于本发明。若无特殊说明，下述实施例中所用技术方法均为常规方法；若无特殊说明，下述实施例中所用实验材料，均为常规化学试剂和生化试剂。
本发明提供了一株具有防治梨树真菌病害的多粘类芽孢杆菌，该菌株分离于江苏省丰县苹果园土壤中，采用稀释涂板的方法从土壤样品的水溶液中分离纯化生防细菌，采用平板拮抗实验的方法筛选高效拮抗菌株，发现fx1菌株拮抗效果较好，基于形态和16s基因测序结果将其命名为多粘类芽孢杆菌（paenibacilluspolymyxa）fx1，菌株于2020年9月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.20680。结合相关实验数据说明该菌株的形态、特征和应用效果。
1.菌株的培养条件如下：na固体培养基组成：蛋白胨5g/l，蔗糖10g/l，酵母粉1g/l，牛肉浸膏3g/l，琼脂粉15g/l，加水定容后调节ph为7.0，于121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后用于菌株划线培养。
2.菌落特征：在na培养基上表面光滑无褶皱，乳白色，不透明状，菌体呈杆状，革兰氏染色呈阴性，可产芽孢。
3.分子结构特征：采用引物对27f/1492r和up1/up2r对菌株的16s和gyrb基因进行pcr扩增及测序，将序列置于ncbi中进行blast比对，发现序列相似度最高的为多粘类芽孢杆菌（paenibacilluspolymyxa），相似度在99%以上，鉴定为多粘类芽孢杆菌。
4.利用fx1制备生防菌剂的方法：挑取固体培养基质上的多粘类芽孢杆菌（paenibacilluspolymyxa）fx1接种于液体nb培养基，在28℃、180rpm转速下培养24h，调节od600=1.0，以体积比1%的比例接入nb培养基扩大培养，相同条件下培养72h，加入质量浓度为0.2%的苯甲酸钠，获得生防菌剂。
nb培养基的组成：蛋白胨5g/l，蔗糖10g/l，酵母粉1g/l，牛肉浸膏3g/l，加水定容后调节ph为7.0，于121℃高压蒸汽灭菌20min。
5.利用上述制备的菌剂进行梨炭疽病、轮纹病的室内防效试验
试验地点在江苏省农业科学院植物保护研究所实验室。梨果实在超市购买，品种为库尔勒香梨。挑选大小均匀，表面无划痕和伤口的健康梨果实，表面用清水洗涤，再用75%的乙醇表面消毒在室温晾干。在梨果表面用无菌打孔器（孔径5mm）轻轻打一个伤口，将活化好的梨炭疽病菌、轮纹病菌接到伤口处，梨果实下面加水保持湿润，28℃条件下培养一天。一天后将fx1菌剂均匀喷布在接种的梨果表面，对照组在接入病原菌一天后，喷施nb菌液处理。阴性对照为不接病菌，喷施清水对照。再次保持培养7~10天后观察测量病斑直径，根据病斑面积大小计算防治效果。计算公式：防治效果=（对照组病斑面积-处理组病斑面积）/对照组病斑面积×100%。
试验结果如表1所示：
多粘类芽孢杆菌fx1对梨炭疽病、梨轮纹病的室内防治试验
表1的结果显示了fx1菌液处理后，梨果实表面的炭疽病病斑扩展面积很小，与对照组相比，防治效果在75%以上，轮纹病病斑的扩展也得到了很好的抑制，效果与炭疽病类似，说明fx1菌液在室内能很好地抑制梨果实炭疽病和轮纹病的发生。
6.利用上述菌剂进行梨炭疽病的田间防治试验
试验地点位于江苏省句容市丰源果品合作社。品种为丰水和幸水。棚架式栽培模式，常规管理。梨园内每间隔一列选取5株梨树作为试验处理组，共选取3列处理组喷施fx1菌剂，另外间隔选取3列喷施清水作为对照处理。药剂喷施时间为落花后10天，一直到套袋前，共喷施4次。雨后及时补喷一次。在成熟期时，每株处理的梨树随机选取100片叶、30个果实统计炭疽病病斑大小。按照0、1、3、5、7、9的分级标准统计病害级别数和病情指数。病情指数=（各级别病叶病果数×级别数）/（调查总叶果数×9）×100。防治效果=（对照组病情指数-处理组病情指数）/对照组病情指数×100%。
试验结果如表2所示：
多粘类芽孢杆菌fx1对梨炭疽病的田间防治试验
表2的结果显示了在田间喷施fx1菌液能有效的抑制梨炭疽病在叶片和果实上的发生率和病情指数，与对照相比，防治效果均达到85%以上。
7.生防菌剂对梨腐烂病的田间防治试验
实验地点位于江苏省徐州市丰县大沙河果园。品种为酥梨。梨园内老树较多，树势较弱，枝干上腐烂病疤较多。园内选取5株梨树作为实验处理组，在春季腐烂病发生盛期，每株梨树选取5~10个病斑较浅，发生时间较近的腐烂病病疤，用专用刮刀刮除病斑，将病斑刮除干净后涂抹fx1生防菌剂保护伤口。另外选择5株梨树作为空白对照，刮除病斑后涂抹清水清洗。在晚秋季节调查病疤愈合情况，统计病疤愈合率。
试验结果如表3所示：
表3的结果显示了fx1生防菌剂可以有效的促进田间梨腐烂病病疤的愈合，在刮除处理病涂抹fx1菌剂的45个病斑中，有41个可以愈合恢复生长，而对照组只有2个愈合，愈合率得到大大提高，说明fx1菌剂的治愈效果良好。
8.生防菌剂对梨黑斑病、轮纹病的田间防治试验
试验地点位于江苏省句容市丰源果品合作社。品种为丰水和幸水。棚架式栽培模式，常规管理。梨园内每间隔一列选取5株梨树作为试验处理组，共选取3列处理组喷施fx1菌剂，另外间隔选取3列喷施清水作为对照处理。药剂喷施时间为落花后15天，一直到套袋前，共喷施4次。雨后及时补喷一次。在果实采收后两周，每株梨树随机选取100片叶统计黑斑病和轮纹病病斑大小。按照0、1、3、5、7、9的分级标准统计病害级别数和病情指数。病情指数=（各级别病叶病果数×级别数）/（调查总叶果数×9）×100。防治效果=（对照组病情指数-处理组病情指数）/对照组病情指数×100%。
试验结果如表4所示：
表4的结果显示了fx1生防菌剂能有效的防治梨树叶片上的黑斑病和轮纹病，防治效果均接近90%，菌剂的田间表现良好。
上述试验表明，本发明提供的一株多粘类芽孢杆菌fx1及其生防菌剂可以有效的防治梨树主要的真菌病害，对于炭疽病、轮纹病等叶片和果实病害以及腐烂病等枝干病害均有良好的防效，在果树病害的生物防治方面有良好的应用前景。
以上试验仅为本发明的较佳事例，并不以限制本发明的技术扩展，凡在本发明精神和原则之内所做的修改、替换、改进等，均应包含在本发明保护范围之内。
序列表
<110>江苏省农业科学院
<120>一株多粘类芽孢杆菌及其在梨树病害防治中的应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1455
<212>dna
<213>多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)
<400>1
ggacgtcgtgctataatgcagtcgagcggggttgtgttagaagcttgcttctacataacc60
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acaccacgagagtttacaacacccgaagtcggtggggtaacccgcaagggagccagccgc1440
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1.一株多粘类芽孢杆菌（paenibacilluspolymyxa)fx1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.20680，保藏日期为2020年9月18日。
2.一种由权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌fx1制备的生防菌剂。
3.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于，生防菌剂的制备方法如下：将多粘类芽孢杆菌fx1接种于液体nb培养基内进行培养24-36h，调节od600=1.0，以体积比1-2%的比例接入液体nb培养基扩大培养48-72h，加入质量浓度为0.2%的苯甲酸钠，获得生防菌剂。
4.根据权利要求3所述的生防菌剂，其特征在于：培养的温度为25-28℃，转速为120-180rpm。
5.根据权利要求3所述的生防菌剂，其特征在于，nb培养基的制备工艺如下：将蛋白胨5g、蔗糖10g、酵母粉1g、牛肉浸膏3g，蒸馏水加至1000ml，调节ph为7.0，进行高压蒸汽灭菌，即可制备得到nb培养基。
6.根据权利要求5所述的生防菌剂，其特征在于，高压蒸汽灭菌的温度为121℃，灭菌时间为20-25min。
7.如权利要求2-6中任一项所述的生防菌剂在用于防治梨树的炭疽病、轮纹病、黑斑病、腐烂病中的应用。
技术总结