本发明属于微生物应用技术领域，涉及一种用于水产饲料添加的菌株及其应用。
背景技术：
抗生素在水产养殖过程中对于促进鱼类生长、预防和治疗感染性疾病方面发挥重要作用，但是由抗生素过度使用引起的环境残留和人群健康风险也不容忽视。抗生素的过度使用不仅会破坏动物的免疫能力，还会使致病菌产生耐药性，致使动物再次感染后，对抗生素的需求量增加，形成一个恶性循环。与此同时，由于鱼类不能有效地代谢摄入的抗生素，据估计约有75％的抗生素会随着鱼类粪便排泄到水环境中。这些都使得抗生素的过度使用成为了目前水产养殖业亟需解决的难题，而益生菌便是一种很好的抗生素替代产品。
解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)为芽孢杆菌属，该菌为革兰氏阳性、兼性厌氧的杆状细菌，具有广泛的抗菌能力；在自然界中分布广泛，其最适生长温度为20～30℃，最适宜生长的ph为6.5～7，对环境的适应性很强。芽孢杆菌属细菌在饲料添加工业中已得到广泛应用，其有效性及安全性已得到充分证实，不产生具有毒性的代谢产物并且对抗菌药物极其敏感。
近年来，已有很多研究表明鱼肠道微生物能够促进宿主的健康及提高对饲料的消化能力。罗莉等人的研究发现，解淀粉芽孢杆菌在肠道中能够消耗大量氧气，使肠道处于厌氧环境，抑制有害微生物的增殖，并且还具有净化水质的作用。有证据表明解淀粉芽孢杆菌能够改善鱼类的营养摄取及饲料利用率，silva等通过研究发现，在给尼罗罗非鱼补充了5×106cfu/g和1×107cfu/g的含有解淀粉芽孢杆菌的基础饲料后，鱼的绒毛高度和肠道杯状细胞数量显著增加，表明该菌提高了鱼对营养物质的消化吸收能力。除此之外，ba还会分泌蛋白酶、淀粉酶来促进营养物质的消化和吸收。
正是由于ba独特的生理特性以及极高的安全性，受到了研究者们的较多关注。但是关于ba作为饲料添加剂的研究对象大多为禽畜类动物，因此目前发现的益生效果较明显的水产用ba菌株数量较少。而且由于不同解淀粉芽孢杆菌菌株之间的差异较大，筛选出合适的菌株也成为了制备益生菌添加剂的关键因素。
技术实现要素：
为解决目前抗生素过度使用而带来的危害，本发明旨在筛选出一株益生效果明显的ba菌株，并进一步探究其带来的益生效果，为该菌后续应用提供理论依据。
本发明筛选了一种能够代替抗生素的微生物菌剂。将此菌剂添加到鱼饲料中，以期提高鱼的消化能力、改善鱼的生长状况和改变鱼的肠道菌群，使有益菌增加、有害菌减少，进而提高鱼的免疫能力。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
本发明提供了一种用于水产饲料添加的菌株，所述菌株为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ba-hs，该菌株已于2020年8月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctccno：m2020389。
所述解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ba-hs为革兰氏阳性菌，呈短杆状(0.7～0.9μm×1.8～3.0μm)，具有运动性。该菌硝酸盐还原试验阳性，吲哚试验阴性，v-p试验阴性，甲基红试验阴性，且能够分泌具有较高酶活性的蛋白酶及淀粉酶。
所述解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ba-hs的dna序列如seqidno.1所示。
本发明还提供了所述解淀粉芽孢杆菌在制备水产饲料中的应用。
本发明还提供了一种筛选用于水产饲料添加的菌株的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)取样，然后涂布于lb培养基中进行培养。
(2)将初步培养的菌株进行纯化，具体操作为挑取单菌落划线于新的lb培养基上，经培养后可得到初步筛选的菌株。
步骤(1)中，所述取样主要来自上海及其周边省市，如江苏、浙江等地初步取样；所述取样地主要为农田、湖泊、居民家中水槽。
步骤(1)中，所述取样后还包括将获得的水样、土样稀释至合适浓度后再进行培养。
步骤(1)中，所述lb平板培养基的ph为5.2-8.4；优选地，为7.6。
步骤(1)中，所述lb平板培养基的组分包括：10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母粉、5g/l氯化钠和25g/l琼脂粉。
步骤(1)中，所述培养的温度为30-45℃；优选地，为35℃。
步骤(1)中，所述培养的时间为18-30h；优选地，为24h。
步骤(2)中，所述lb平板培养基的ph为5.2-8.4；优选地，为7.6。
步骤(2)中，所述lb平板培养基的组分包括：10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母粉、5g/l氯化钠和25g/l琼脂粉。
步骤(2)中，所述培养的温度为30-45℃；优选地，为35℃。
步骤(2)中，所述培养的时间为18-30h；优选地，为24h。
本发明还提供了一种用于水产饲料添加的解淀粉芽孢杆菌菌株生产的微生物菌剂。
其中，所述微生物菌剂的有效成分为解淀粉芽孢杆菌ba-hs菌体及其代谢产物。
本发明还提供了所述微生物菌剂的制备方法，步骤如下：
(1)将初步筛选的菌株划线接种于lb平板培养基进行扩增。
(2)将扩增后的菌株接种于奶粉选择培养基和淀粉选择培养基中，通过其水解圈大小的平均值和差异值进行再次筛选，将再次筛选出的四株菌株分别命名为ba-hs、ba-tl、ba-dx、ba-kz，并对其进行16srdna检测。
(3)将筛选出的菌株接种于lb液体培养基中进行放大培养，得到所述微生物菌剂。
步骤(1)中，所述菌株指从上海及其周边省市，如江苏、浙江等地初步取样，将样品进行初步筛选纯化后得到的25株菌株。
步骤(1)中，所述lb平板培养基的ph为5.2-8.4；优选地，为7.6。
步骤(1)中，所述lb平板培养基的组分包括：10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母粉、5g/l氯化钠和25g/l琼脂粉。
步骤(1)中，所述扩增的温度为30-45℃；优选地，为35℃。
步骤(1)中，所述扩增的时间为18-30h；优选地，为24h。
步骤(2)中，所述奶粉选择培养基的ph为5.2-8.4；优选地，为7.6。
步骤(2)中，所述奶粉选择培养基的配制过程：将10g胰蛋白胨、5g酵母粉、5g氯化钠和25g琼脂粉加蒸馏水定容至950ml，121℃灭菌15min后加入50ml经细菌滤器处理过的奶粉溶液。
步骤(2)中，所述淀粉选择培养基的ph为5.2-8.4；优选地，为7.6。
步骤(2)中，所述淀粉选择培养基的配制过程：将10g胰蛋白胨、5g酵母粉、5g氯化钠和25g琼脂粉加蒸馏水定容至950ml，121℃灭菌15min后加入50ml经细菌滤器处理过的淀粉溶液。
步骤(2)中，所述初步筛选出的四株菌株为蛋白酶和淀粉酶酶活都较高的ba-hs菌株，蛋白酶和淀粉酶酶活都较低的ba-dx菌株，淀粉酶酶活低、蛋白酶酶活高的ba-kz菌株以及淀粉酶酶活高而蛋白酶酶活低的ba-tl菌株。
步骤(3)中，所述lb液体培养基的ph为5.2-8.4；优选地，为7.6。
步骤(3)中，所述lb液体培养基的组分包括：10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母粉和5g/l氯化钠。
所述培养方式为摇床震荡培养。
所述摇床震荡的速率为180-220rpm；优选地，为200rpm。
所述培养的温度为30-45℃；优选地，为35℃。
所述培养的时间为12-20h；优选地，为18h。
在得到四种微生物菌剂后，本发明将其分别加入4份自制鱼饲料中，所述自制饲料的成分和营养含量表如下表1：
表1自制饲料的成分和营养含量表
对鲫鱼幼鱼喂养不同饲料，以检测该菌剂对鱼的益生效果。具体步骤如下：
(1)将鱼分配至4个实验组和1个ck组，实验组使用含菌剂的饲料，ck组使用不含菌剂的饲料。每天定时对5组鱼进行饲喂，并记录鱼的体重及体长。
(2)饲喂15天后，记录鱼的体长和体重，并取出其肠道内容物进行冻存。
(3)根据记录的数据计算出鱼的增重率和特定生长率。检测鱼肠道内微生物的蛋白酶及淀粉酶酶活，并将肠道内容物送至相关生物科技公司进行肠道菌群多样性检测。
所述步骤(1)中各组鱼除了饲喂的饲料各不相同以外，其余生长条件均一致。
本发明还提供了所述微生物菌剂在水产饲料中的应用。
由于所述微生物菌剂为解淀粉芽孢杆菌ba-hs菌体及其代谢产物，且通过实验发现ba-hs所分泌的蛋白酶、淀粉酶具有较强的酶活力，因此可将该微生物菌剂添加至鱼饲料中，提高鱼类对饲料的消化能力。还可将该菌直接添加至饲料中，在合适的发酵条件下获得发酵饲料。且该微生物菌剂还可用于家畜饲养，可将此菌剂添加至家畜饲料中促进家畜对饲料中营养物质的吸收。
在对鱼的益生效果进行检验后，本发明发现ba-hs对鱼的益生效果最为明显，故与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
所筛选出的解淀粉芽孢杆菌菌剂作为鱼饲料添加剂能够明显改善鱼的生长状况，改变鱼的肠道菌群，使得有益菌增加而有害菌减少，从而提高鱼的免疫能力。在“禁抗令”颁布后，找到一种能够代替抗生素的饲料添加剂成为了鱼类养殖业的一大难题，本发明中的微生物菌剂在改善肠道菌群多样性的同时，可提高鱼类对饲料的利用率，减少残余饲料排放到水环境中，而良好的水环境也能在一定程度上降低鱼的患病率。且本发明中的解淀粉芽孢杆菌培养条件简单，易于工业化生产，可以成为一种理想的鱼饲料添加剂。
附图说明
图1是菌株复苏培养时的菌落形态；
图2是菌种初筛时所测量的蛋白酶及淀粉酶水解圈大小；(其中a为蛋白酶、b为淀粉酶。4号菌株(ba-hs)的产淀粉酶能力较强，与其他组有显著性差异(p<0.05))
图3是饲喂含菌饲料后鱼的增重率；
图4是饲喂含菌饲料后鱼的特定生长率；
图5是饲喂含菌饲料后鲫鱼幼鱼的鱼体肥满度；(*代指ba-hs组的鱼体肥满度与对照组相比有显著差异(p<0.05))
图6是饲喂含菌饲料后鱼体内蛋白酶酶活(左)及淀粉酶酶活(右)；(****代表该实验组与ck组具有极大差异(p<0.0001))
图7是鲫鱼幼鱼增重率与其肠道酶活比较；
图8是otu水平的花瓣图分析；
图9是鱼肠道菌群属水平总丰度top30物种组成分析柱状图；
图10是ba-hs生理生化特性检测。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
蛋白酶、淀粉酶高产菌株的筛选及纯化，方法如下：
将待筛选的25株解淀粉芽孢杆菌菌株于lb平板培养基中进行复苏培养，将复苏后的菌株分别点种到奶粉选择培养基和淀粉选择培养基中，根据图2中所示的水解圈大小的平均值及差异值选择出四株菌株。所筛选出的四株菌株分别为平均值最高的菌株ba-hs(图2中对应4号)、平均值最小的菌株ba-dx(图2中对应21号)、差异值最大的菌株ba-kz(图2中对应25号)及差异值最小的菌株ba-tl(图2中对应7号)。对筛选出的四株菌株进行16srdna测序，四株菌株均为解淀粉芽孢杆菌。将四株菌株接种至lb液体培养基中，在36-38℃温度下，摇床震荡速率为190-210rpm，培养14-18个小时。
实施例2
鲫鱼的饲养及生长情况的记录，方法如下：
提取扩大培养后获得的四种菌液，将含菌量控制在1×106cfu/g，并添加25％的玉米油于菌液中混匀。将混匀后的四种菌液分别均匀喷洒在4份自制饲料(见表1)上，当天配制当天使用。4组实验组分别用四种喷洒过菌液的饲料饲喂，ck组用不添加菌液的饲料饲喂。观察鲫鱼生长状况，记录体重和体长。
实施例3
鲫鱼样本的采集及生长指标计算，其方法如下：
饲喂结束后，测量鲫鱼的体重及体长，并取出其肠道，对肠道内容物进行冻存。
鲫鱼增重率、特定生长率和鱼体肥满度的计算公式为：
增重率＝(结束总重-初始总重)/初始总重×100％
特定生长率＝(ln(结束均重)-ln(初始均重))/试验天数×100％
鱼体肥满度＝100×鱼体重(g)/体长(cm)3
研究结果显示，各组实验鱼的增重情况较对照组均有变化：在鱼饲料中添加ba-hs、ba-dx及ba-kz后，相比对照组增重率分别增加了49.7％、25.1％和12.9％(图3)。ba-hs的特定生长率较对照组增加了49.0％，ba-kz则增长了13.7％(图4)。根据图5，可知ba-hs对鱼体肥满度具有较显著影响(p<0.05)，且四组实验组相较对照组鱼体肥满度均有增加。综上，可知ba-hs对鱼生长情况影响较显著，但ba-tl组的鲫鱼增重情况和特定生长率变化与其他三个实验组差异较大。
实施例4
鲫鱼样本消化酶酶活测定，其方法如下：
将从各实验组鲫鱼肠道中分离出的肠道微生物的菌液进行10000r/min离心10min后，取上清液测定淀粉酶及蛋白酶酶活。蛋白酶活力测定：参照中华人民共和国专业标准gb/t23527-2009。蛋白酶活力单位(u)定义：ph为7.5，40℃下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量，以u/ml表示。淀粉酶活力测定：采用dns法。淀粉酶活力单位(u)定义：ph为5.5，60℃下，1min水解可溶性淀粉产生1μg葡萄糖所需的酶量，以u/ml表示。通过检测结果(图6)可发现，相比对照组在饲料中添加解淀粉芽孢杆菌喂养后鲫鱼肠道内消化酶酶活都具有显著性差异。ba-hs组的蛋白酶及淀粉酶酶活差异均较为显著，相较对照组分别增长了68.9％和205.9％，而分泌的蛋白酶和淀粉酶酶活差异值最小的ba-tl组也较对照组分别增长了50.5％和131.3％。ba-dx组相较对照组蛋白酶酶活增长了38.4％，但是淀粉酶酶活并未提高。而ba-kz相较对照组两种酶活酶活均未明显提高，考虑可能与该菌株自身酶活较低有关。而采用皮尔逊法计算鲫鱼肠道酶酶活与增重率之间的相关性，结果如图7，可发现蛋白酶酶活与增重率相关性为29.12％，淀粉酶酶活与增重率相关性为24.44％，可见增重率与蛋白酶酶活的相关性更高。
皮尔逊法的计算公式为：
其中，cov(xy)表示酶活与增重率之间的协方差，σx、σy分别表示酶活与增重率的标准差。
实施例5
鲫鱼肠道微生物多样性检测，其方法如下:
经过illuminamiseq高通量测序后，15份鲫鱼肠道样本去除嵌合体后共获得797471条优化序列，其平均长度从440.77bp至463.12bp。根据otu聚类分析结果，统计不同样本共有及特有的otu，绘制花瓣图(图8)。
结合鲫鱼幼鱼肠道菌群alpha多样性分析结果(表2)可知，实验组较对照组而言在ace、chao1、shannon上均有所增加，而单从simpson指数来看，ba-hs组和ba-kz组较其他三组而言有显著增加。总的来说，饲喂含菌饲料的鲫鱼肠道菌群多样性更高。
表2饲喂含菌饲料后鱼肠道菌群alpha多样性指数
对属水平总丰度top30的物种进行聚类，绘制的柱状图如图9所示。可明显看出在ba-hs中，生丝微菌属(hyphomicrobium)为优势菌属。在ba-dx、ba-kz和ba-tl中，醋酸杆菌属(cetobacterium)占据了绝对优势。将实验组与对照组比较，发现四个实验组中厚壁菌属(firmicutes)的相对丰度有所减少，且实验组较对照组总丰富度top30之外的菌种丰富度也有所提高，可证实饲喂含菌饲料后的确可提高鱼类肠道菌群多样性。
实施例6
对ba-hs进行生理生化特性检测，其方法如下:
取一内盛2ml无菌水试管，用接种针或接种环从平板上挑取已纯化1～3个菌落至无菌水中仔细研磨成0.5麦氏浊度的均一细菌悬液，滴加50～100μl菌悬液至试验的安瓿瓶中，接种后置于36℃培养箱中培养适宜时间。
表3ba-hs生理生化特性检测结果
根据表3中ba-hs生理生化特性检测结果显示，其o-f试验结果为阳性，说明ba-hs代谢类型为发酵型，可将有机物进行进一步分解，将其添加在饲料中可帮助宿主消化有机物。乙酰胺酶试验结果呈阳性说明ba-hs能够以乙酰胺为碳源，并且分解乙酰胺产生碱。硝酸盐还原试验和dna酶试验结果呈阳性、不利用柠檬酸盐以及精氨酸双水解酶试验呈阴性等特性均与解淀粉芽孢杆菌对应特性一致。
实施例7-66
为了探究ba-hs的最佳培养条件以及饲料成分中豆粕和鱼粉的最佳比例，本发明进行了正交实验，并将具有代表性的几种培养条件下培养的ba-hs添加至不同饲料配比的鱼饲料中，再次对鱼的增重率及特定生长率进行检测。具体实施条件如下：
表4
在对上述实施例结果进行分析后，本发明发现在ph为5.2-8.4的范围内，最适ph为7.6。而在30-45℃的范围内，该菌发挥最佳作用的温度为35℃。当饲料中豆粕与鱼粉的含量比分别为4/9、5/9和2/3时，5/9的配比更为适合。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
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<110>华东师范大学
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1.一种用于水产饲料添加的菌株，其特征在于，所述菌株为解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensba-hs，于2020年8月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2020389。
2.如权利要求1所述的菌株在制备水产饲料中的应用。
3.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂由如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensba-hs发酵而来。
4.一种微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将初步筛选的菌株划线接种于lb平板培养基进行扩增；
(2)将扩增后的菌株接种于奶粉选择培养基和淀粉选择培养基中，通过其水解圈大小的平均值和差异值进行再次筛选，将再次筛选出的四株菌株分别命名为ba-hs、ba-tl、ba-dx、ba-kz，并对其进行16srdna检测；
(3)将所述步骤(2)筛选出的菌株接种于lb液体培养基中进行放大培养，得到所述微生物菌剂。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述lb平板培养基的ph为5.2-8.4；和/或，所述lb平板培养基的组分包括：10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母粉、5g/l氯化钠和25g/l琼脂粉；和/或，所述扩增的温度为30-45℃；和/或，所述扩增的时间为18-30h。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述奶粉选择培养基的ph为5.2-8.4；和/或，所述奶粉选择培养基的配制过程：将10g胰蛋白胨、5g酵母粉、5g氯化钠和25g琼脂粉加蒸馏水定容至950ml，121℃灭菌15min后加入50ml经细菌滤器处理过的奶粉溶液；和/或，所述淀粉选择培养基的ph为5.2-8.4；和/或，所述淀粉选择培养基的配制过程：将10g胰蛋白胨、5g酵母粉、5g氯化钠和25g琼脂粉加蒸馏水定容至950ml，121℃灭菌15min后加入50ml经细菌滤器处理过的淀粉溶液。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述lb液体培养基的ph为5.2-8.4；和/或，所述lb液体培养基的组分包括：10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母粉和5g/l氯化钠；和/或，所述培养的方式为摇床震荡培养。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述微生物菌剂的有效成分为解淀粉芽孢杆菌ba-hs菌体及其代谢产物。
9.如权利要求4-8之任一项所述方法制备得到的微生物菌剂。
10.如权利要求3或9所述的微生物菌剂在水产饲料中的应用。
技术总结