本说明书一个或多个实施例涉及微生物学及生物纳米硒制备技术领域，尤其涉及利用甲基营养型芽孢杆菌lw-6合成生物纳米硒的方法及用途。
背景技术：
硒是人及动植物体所必需的微量元素之一，是体内多种酶的组成部分，在生命中起着抵御疾病、延缓衰老、增强免疫等功能作用。有机硒作为谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心，在调节动植物抗氧化能力方面发挥着重要作用。而我国80％土地属于缺硒地带，土壤硒含量低，种植的农产品含硒量也低，因此造成我国人处于缺硒状况，解决问题的最好办法就是生产富硒农产品，而解决富硒农产品生产问题就必须使用富硒肥料，富硒菌剂，生物纳米硒是有机硒中安全性最好的，生物利用度高的硒产品。
早期应用的补硒制剂中，都是以亚硒酸钠/钾、硒酸钠/钾为添加成分，而这些无机的硒添加成分属于毒性极大的化学品，长期服用，会对肝脏造成极大的损伤，悖离了补硒的初衷，甚至补硒一度成了服毒的代名词，人们已不再热衷对硒的追求。
近年来，随着医学的认知水平和人民生活的大大提高，补硒又回到了人们生活的主题，于是微生物纳米硒应运而生。它极大的避免和消除了无机硒毒性大、易伤肝的不良后果，在医药用品、保健食品、饲料添加剂、微生物制剂和农业肥料方面得到了广范应用，并取得了非凡的成就。
技术实现要素：
本说明书实施例描述了一种利用甲基营养型芽孢杆菌lw-6合成生物纳米硒的方法及用途，可以高效地将无机硒转换为生物纳米硒。
第一方面，本说明书实施例提供了一种利用甲基营养型芽孢杆菌lw-6合成生物纳米硒的方法，以含有亚硒酸盐的培养基为发酵培养基，以甲基营养型芽孢杆菌lw-6为发酵菌，进行发酵，得到含有生物纳米硒的生物纳米硒母液；其中，所述甲基营养型芽孢杆菌lw-6的保藏编号为cgmccno.6793。
在一些实施例中，在所述发酵培养基中，亚硒酸盐的浓度为26mm，所述亚硒酸盐为亚硒酸钠。
在一些实施例中，第一方面所提供的方法包括以下步骤：
(1)活化甲基营养型芽孢杆菌lw-6；
(2)将活化后的甲基营养型芽孢杆菌lw-6接种于种子培养液体培养基，以制备种子液；
(3)将所述种子液接种到发酵培养基中，进行发酵；其中，
在发酵过程中，发酵温度为25-30℃，搅拌速度为260-280rpm，通气量为1：(0.3-0.6)，罐压为1.4-1.8f/cm2，发酵持续时间为48-72小时，得到生物纳米硒含量为1800mg/l的生物纳米硒母液；
在所述发酵培养基中，蛋白胨的初始浓度为10g/l，葡萄糖的初始浓度为5g/l，kh2p04的初始浓度为2g/l，mg2s04.7h20的初始浓度为lg/l，亚硒酸钠的初始浓度为4500毫克/升；所述发酵培养基的初始ph为7.0-7.2，初始体积为发酵罐体积的70％。
在一些实施例中，所述生物纳米硒母液为生物纳米硒锌母液，所述发酵培养基还含有初始浓度为1786毫克/升的七水硫酸锌。
在一些实施例中，在所述步骤(1)中，使用斜面培养基对甲基营养型芽孢杆菌lw-6进行活化；所述斜面培养基的配方为葡萄糖8g/l，酵母浸粉5g/l，工业盐10g/l，琼脂18-20g/l，胰蛋白胨10g/l，水补足余量，并将调整ph为7.0-7.2；在活化培养期间，培养温度为28℃，培养时间为36小时；
在所述步骤(2)中，将活化后的甲基营养型芽孢杆菌lw-6配置成108cfu/ml的菌悬液；将所述菌悬液按照1％的接种量接种于所述种子培养液体培养基中；
所述种子培养液体培养基的配方为葡萄糖8g/l，酵母浸粉5g/l，工业盐10g/l，胰蛋白胨10g/l，水补足余量；所述种子培养液体培养基的初始ph为7.0-7.2；在制备种子液期间，培养温度为28℃，按照150rpm转速进行振荡培养，培养时间为24h，以得到种子液；
在所述步骤(3)中，将所述种子液按照3％的接种量接种到发酵培养基中。
第二方面，本说明书实施例提供了一种生物纳米硒母液，其特征在于，通过第一方面所述的方法制备而成。
第三方面，本说明书实施例提供了第二方面提供的生物纳米硒母液在制备富硒锌复合微生物肥料中的用途；其中，将所述生物纳米硒母液喷淋到复合微生物肥料颗粒上，以制备富硒锌复合微生物肥料。
第四方面，本说明书实施例提供了第三方面提供的富硒锌复合微生物肥料在生产富硒作物中的用途；其中，当所述富硒锌复合微生物肥料中的生物纳米硒含量为90mg/kg时；
若所述作物为小麦，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为40kg/亩，可生产硒含量为279.01μg/kg的小麦；
若所述作物为水稻，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为40kg/亩，可生产硒含量为282.9μg/kg的水稻；
若所述作物为玉米，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为40kg/亩，可生产硒含量为217.4μg/kg的玉米；
若所述作物为大豆，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为40kg/亩，可生产硒含量为218.6μg/kg的大豆；
若所述作物为花生，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为40kg/亩，可生产硒含量为197.6μg/kg的花生；
若所述作物为谷子，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为40kg/亩，可生产硒含量为214.3μg/kg的谷子；
若所述作物为红薯，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为40kg/亩，可生产硒含量为45.3μg/kg的红薯；
若所述作物为番茄，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为80kg/亩，可生产硒含量为87.9μg/kg的番茄；
若所述作物为茄子，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为80kg/亩，可生产硒含量为66.1μg/kg的茄子；
若所述作物为黄瓜，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为80kg/亩，可生产硒含量为42.7μg/kg的黄瓜；
若所述作物为苹果，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为80kg/亩，可生产硒含量为39.2μg/kg的苹果；
若所述作物为猕猴桃，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为80kg/亩，可生产硒含量为138.8μg/kg的猕猴桃；
若所述作物为茶叶，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为80kg/亩，可生产硒含量为3382.7μg/kg的茶叶。
第五方面，本说明书实施例提供了第二方面提供的生物纳米硒母液在制备富硒锌微生物菌剂中的用途；其中，将所述生物纳米硒母液添加到水中，再加入辅料，搅拌，以制备富硒锌微生物菌剂；所述辅料包括黄腐酸钾。
第六方面，本说明书实施例提供了第五方面提供的富硒锌微生物菌剂在生产富硒作物中的用途；其中，当所述富硒锌微生物菌剂中的生物纳米硒含量为90mg/l时；
若所述作物为小麦，所述富硒锌微生物菌剂的用量为2l/亩，可生产硒含量为287.2μg/kg的小麦；
若所述作物为水稻，所述富硒锌微生物菌剂的用量为2l/亩，可生产硒含量为214.4μg/kg的水稻；
若所述作物为玉米，所述富硒锌微生物菌剂的用量为2l/亩，可生产硒含量为260.1μg/kg的玉米；
若所述作物为大豆，所述富硒锌微生物菌剂的用量为3l/亩，可生产硒含量为237.lμg/kg的大豆；
若所述作物为花生，所述富硒锌微生物菌剂的用量为3l/亩，可生产硒含量为238.lμg/kg的花生；
若所述作物为谷子，所述富硒锌微生物菌剂的用量为3l/亩，可生产硒含量为225.5μg/kg的谷子；
若所述作物为红薯，所述富硒锌微生物菌剂的用量为3l/亩，可生产硒含量为60.8μg/kg的红薯；
若所述作物为金针菇，所述富硒锌微生物菌剂的用量为1.5l/吨基质，可生产硒含量为435.5μg/kg的金针菇；
若所述作物为香菇，所述富硒锌微生物菌剂的用量为1.5l/吨基质，可生产硒含量为1977.4μg/kg的香菇；
若所述作物为木耳，所述富硒锌微生物菌剂的用量为1.5l/吨基质，可生产硒含量为2853.2μg/kg的木耳；
若所述作物为番茄，所述富硒锌微生物菌剂的用量为4l/亩，可生产硒含量为97.9μg/kg的番茄；
若所述作物为茄子，所述富硒锌微生物菌剂的用量为4l/亩，可生产硒含量为76.2μg/kg的茄子；
若所述作物为黄瓜，所述富硒锌微生物菌剂的用量为4l/亩，可生产硒含量为49.7μg/kg的黄瓜；
若所述作物为苹果，所述富硒锌微生物菌剂的用量为5l/亩，可生产硒含量为37.3μg/kg的苹果；
若所述作物为猕猴桃，所述富硒锌微生物菌剂的用量为5l/亩，可生产硒含量为168.8μg/kg的猕猴桃；
若所述作物为茶叶，所述富硒锌微生物菌剂的用量为4l/亩，可生产硒含量为3438.6μg/kg的茶叶。
本说明书实施例利用甲基营养型芽孢杆菌lw-6合成生物纳米硒锌，对硒的转化率比枯草芽孢杆菌等其他菌株的转化率提高15％-20％；并且制备的生物纳米硒锌，可以在富硒锌肥料中应用；具有环境友好，产率高，安全高效等特点，生产获得的生物纳米硒锌用于富硒锌肥料，施肥后，作物、瓜果、蔬菜、富硒锌效果显著。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1示出了本说明书实施例提供的甲基营养型芽孢杆菌lw-6的分子进化树。
图2为本说明书实施例提供的甲基营养型芽孢杆菌lw-6对不同亚硒酸钠浓度的耐受性。
图3a为本说明书实施例提供的甲基营养型芽孢杆菌lw-6在不同亚硒酸钠浓度下的生物纳米硒产量；
图3b为本说明书实施例提供的甲基营养型芽孢杆菌lw-6在不同亚硒酸钠浓度下的生物纳米硒转化率；
图4为本说明书实施例提供的甲基营养型芽孢杆菌lw-6转化生成的纳米硒颗粒纯化后透射电子显微镜(tem)照片。
具体实施方式
生物纳米硒作为植物健康激活剂，具有提高植物体内生物酶的活性，增加作物抗逆性，促进植物健康生长等特点。适用于谷物、蔬菜、茶叶、水果等多种不同的作物上富硒。生产富硒农产品、富硒畜禽产品，保健品，此外硒还有阻挡作物对重金属的吸收，促进人体、动物体内重金属的排出，前者可用于重金属严重污染的土壤，后者可以减少重金属在人和动物体内的积累。
生物纳米硒通过合成微生物技术，构建基因工程菌，在合适的条件下，促进工程菌的大量繁殖，然后添加相关底物亚硒酸钠等，通过微生物的发酵，使生物发酵技术和生物有机硒经过纳米技术融合，形成能够被植物高效利用的生物有机纳米硒，解决了长期困扰硒元素不能参与植物生长的重大难题，其毒性是无机硒的二十分之一，产品效能大幅度提高。对促进农产品质量安全、减少农产品对农药化肥的使用量、改善农产品品质、生态农业健康发展具有重要的作用。产品使用后能显著促进作物增产，可大幅度提高作物的品质和风味。如谷物糯性、水果甜度和口感。将纳米硒吸附在生物相容性的天然多糖上，应用于水稻种植，稻谷产量提高8-15％，硒含量提高了3-10倍，大米中营养物质总抗氧化能力提高了30-60％，在茶叶种植过程中使用纳米硒，可提高茶叶抗氧化性，减少茶叶苦涩成分，在鹰嘴桃的种植过程中使用纳米硒，可显著提高果实成熟度，并提前转色，经检测硒含量可达到富硒水果标准。纳米硒毒性低，吸收利用率高、高效抗氧化等独特的生物学效应，可提高农产品产量，增强植物的抗氧化性、提升农产品品质和风味，大幅度减少农药使用。增产效果明显，果实品质显著提高。实验表明：生物纳米硒产品在番茄应用以后，在植株生长过程中叶片更挺拔厚绿，长势更好。番茄果实转色更早，果型更好，大小更均匀，成熟的番茄香气浓郁口感好。经检测收获的番茄硒含量提升0.03％以上，可以让小番茄做到硒含量从零到富硒的状态。芹菜叶面施用纳米硒后，芹菜叶绿素、可溶性糖、蛋白质和胡萝卜素等指标的含量分别增加了26.1％、70.4％、37.1％、61.4％。
锌是植物体和人体必需的微量元素之一，在植物体和人体发育过程中起到非常重要的作用。常被人们誉为“生命之花”和“智力之源”，人体缺锌会降低人体免疫力，影响正常新陈代谢的进行，导致多种疾病的发生。植物缺锌也会导致多种生理性病害，严重影响作物的产量和品质的提升。而目前植物和人体补锌主要以无机锌为主，无机锌吸收利用率低，与钙、镁等阳离子容易发生拮抗作用，尤其在植物体内运输传导过程中，容易与阴离子发生反应，形成不溶物，导致吸收效率降低。而利用微生物转化，合成的生物纳米硒锌，其锌元素与氨基酸等小分子形成稳定的螯合物。从而使得植物和人体更容易吸收。提高锌元素的利用率。
本说明书提供了一种利用甲基营养型芽孢杆菌lw-6生物合成纳米硒锌的方法及用途。
在展开介绍本说明实施例提供的方案之前，做如下说明。
应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。
实施例1，菌种分离鉴定
本申请的发明人从土壤中分离纯化，并通过基因诱变技术改进，得到一株可耐受较高浓度亚硒酸钠的甲基营养型芽孢杆菌lw-6(bacillusmethylotrophilus)菌株，甲基营养型芽孢杆菌lw-6现己保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编为100101，保藏编号为cgmccno.6793，保藏日期为2012年11月7日。
其中，鉴定过程如下。
1.1，pcr扩增16srdna、gyra基因序列并测序：
将菌株lw-6接种于lb固体培养基培养24h，取0.2ml灭菌pcr管，加入10μlddh2o，无菌牙签挑取单个菌落到pcr管中搅拌混匀。
1.2，构建pcr反应体系：
16srdna扩增：
以seqidno：1所示的8f(具体序列：5'-cgggatccagagtttgatcctggctcagaacgaacgct-3')及seqidno：2所示的1506r(具体序列：5'-cgggatcctacggctaccttgttacgacttcacccc-3')为引物，pcr扩增获得16srdna基因序列。pcr反应体系为：ddh20，18.5μl；10×buffer，2.5μl，dntpmix，2μl；8f，0.5μl；1506r，0.5μl；菌液，0.5μl；rtaqdna聚合酶，0.5μl。
pcr反应条件为：94℃，l0min；94℃，40s，56℃，40s，72℃，1min，共30个循环；72℃，10min；4℃保存。
gyra扩增；以seqidno：3所示的p
pcr反应条件为:95℃，5min；94℃，1min；55
将pcr扩增获得的dna片段进行纯化，并测序，测序结果用dnaman软件拼接。将测得的16srdna序列(seqidno：5所示，具体为actccgtcggacttcagagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaag6cgactctctggtctgtaactgacgct6aggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccga4gtcggtgaggtaaccttttaggagccagccgccgaaggtgggacagatgattggggtgaagtcg)，以及gyra基因序列(如seqidn0：6所示，具体为：acagtccgccagtttgcccggcagattggaaatctcaagcgcacttttgcggcgggtcaattcccgcgcttttttcgctgccatccgcgctcttgcggccattaaacctttttcaacgattttgcgggctgagtccggattttcaagaaggaatgtttccagcgcagaagaaaacagcgtatcagtgatcgttctcgcttcggagttgccgagcttcgttttcgtctgcccttcgaattgcggatcagggtgcttaattgaaataatggcagtcagcccttccctcacatcatccccgcttaaattcggatcattttctttgaaaatcccttttcttcttgcatagtcgtttataacacgggtcagaccggttttaaatccggcttcgtgcgt6ccgccttcgtatgtgttgatattatttgtgaaagaataaatattgcttgtatagctgtcgttgtattgcaatgcaacttcaaccgttatgccgtctttctcgccttcgatataaatcggctcttcatgaacgacttctttggaacggtttaagtactcaacatagcttttgattccgccttcgtagtggtactcgtttttccgttcttgtccttcacgtttgtcttcaatcgtgatgtttacaccttttgtcaggaaggccaattcccggacacggtttgaaagcaggtcatagtcgtattcggttgtttctttgaaaatttccggatccggaacgaagtgcgtaatcgttccggtcttatcagtatcaccgatcacttcaagatcggccacaggtacaccgcgctcgtacgcctgatagtgggatttttccgtcacgatgaaccgtaacgtcaagagtggtcgacaaggcgtt)，应用blast程序与genbank数据库(http:www.ncbi.blm.nih.gov/blast.cgi)中已有的细菌的16srdna序列、gyra基因进行相似性比较分析，结果显示16srdna序列与bacillussubtilispy79的一致性达到99％，gyra基因序列与bacillussubtilisd12-5的一致性达到100％，lw-6菌株16srdna进化树如图1所示。由此确定lw-6菌株为甲基营养型芽孢杆菌，定名为甲基营养型芽孢杆菌lw-6(bacillusmethylotrophilus)，并保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号:cgmccno.6793。
实施例2，甲基营养型芽孢杆菌lw-6对亚硒酸钠的耐受浓度。
2.1，制备固体lb不同浓度含硒培养基(每升培养基含nacl10g，胰蛋白腺10g，酵母提取物5g，琼脂15g，去离子水1l)，121℃高压灭菌20min。配制1m的亚硒酸钠母液，过滤灭菌，加入亚硒酸钠溶液，使培养基中亚硒酸钠含量分别0mm、10mm、25mm、35mm、55mm、70mm、80mm。
2.2，将甲基营养型芽孢杆菌lw-6菌株挑取单菌落接种于5mllb液体培养基中摇培8h(150rpm，28℃)。取摇培得到的菌液，稀释为od600＝0.8的母液备用；将母液分别稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，分别在含硒平板上滴加2.5μl不同浓度的菌液，每个浓度6个重复，28℃培养48h，观察菌落生长及颜色变化，结果如图2所示。其中，如果细菌生长收到抑制，则菌落比较稀疏，颜色比较淡。
从结果可以看出10mm、25mm、35mm的亚硒酸钠对甲基营养型芽孢杆菌lw-6生长没有明显抑制作用；55mm和70mm的亚硒酸钠对甲基营养型芽孢杆菌lw-6有较明显抑制作用；80mm的亚硒酸钠存在时，甲基营养型芽孢杆菌lw-6不生长，由此得到甲基营养型芽孢杆菌lw-6对亚硒酸钠耐受浓度为70mm，即12.11g/l。
实施例3甲基营养型芽孢杆菌lw-6对亚硒酸钠的转化效率。
3.1，制备不同浓度含硒液体lb培养基，取5ml分装于试管中，121℃高压灭菌20min。配制1m的亚硒酸钠溶液，过滤除菌。向lb培养基加入不同量的亚硒酸钠溶液，使培养亚硒酸钠含量分别0mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm，每个浓度梯度3个重复。
3.2，将甲基营养型芽孢杆菌lw-6菌株挑取单菌落接种于5mllb液体培养基中摇培8h(150rpm，28℃)。取培养得到的菌液，稀释至od600＝0.8。将稀释好的菌液按照0.1％接种量接种于lb培养基(含有亚硒酸钠)中，摇培48小时。
关于如何测定步骤3.2中摇培48小时得到的菌液中的生物纳米硒的含量，可以有如下两种方式。
方式1，用蒸馏水配置1m的na2s溶液(现配现用)；取1ml由不含亚硒酸盐的培养液培养得到的菌液与不同量的纳米硒悬浮液于1.5ml离心管内，12000r/min，离心5min，去上清，清洗3次，然后加入1ml的1mna2s溶液，混匀后充分反应l小时，再12000r/min离心2min；然后取上清液在500nm处测定吸光度。并根据测定结果，制作纳米硒吸光度标准曲线。然后，测定步骤3.2中摇培48小时得到的菌液的吸光度，并利用纳米硒吸光度标准曲线，得到每个样品中的生物纳米硒含量。其中，每个样品具有三个重复，即每个样品测定3次。
方式2，测定步骤3.2中摇培48小时得到的菌液中的亚硒酸离子的量，即测定经过发酵后，剩余的无机硒的含量。具体可以采用国家标准dbs42/010-2018记载的方法测定无机硒的含量。然后，根据剩余的无机硒的含量和无机硒的加入量，可以计算出微生物转化的生物纳米硒的量。
图3a示出了不同亚硒酸钠浓度下的生物纳米硒的产量。
图3b示出了不同亚硒酸钠浓度下的生物纳米硒的转化率，其中该转化率使通过上述方式2测定生物纳米硒的量，并计算得到的。
由图3a、图3b可知，甲基营养型芽孢杆菌lw-6菌株在较低浓度下可将亚硒酸钠较大程度地转化为生物纳米硒。其中，转换得到的生物纳米硒为微生物代谢过程中的小分子肽等有机物质结合在一起的纳米尺寸的单质硒，其更有利于植物吸收，而且更安全。通过3a、图3b所示的产量以及转换率，可以推算出，在液体培养基中的亚硒酸钠含量为26mm时，甲基营养型芽孢杆菌lw-6合成纳米硒的产量达到最高，为1800mg/l，对亚硒酸钠的转化率为88.3％。
实施例4，生物纳米硒特征分析
4.1，活化甲基营养型芽孢杆菌lw-6，转接0.1％的菌液(od600＝0.8)于灭菌后的含lb的液体培养基的锥形瓶中，加入1m亚硒酸钠母液，使得亚硒酸钠终浓度为5mm，置于摇床内，28℃,150rpm，培养时间为48h。
4.2，将摇培48h后的红色菌液取出，在常温下4000r/min离心10分钟，去上清，用生理盐水重悬浮沉淀，离心冲洗3遍，取约20μl的菌与纳米硒的红色混合液，滴加在碳支持膜铜网上，用滤纸吸去多余水分，晾干，在透射电镜下(tem，jem-1230japan)观察，并利用能谱分析仪(edx)对该生物纳米颗粒进行分析。
结果如图4所示，在透射电镜下，甲基营养型芽孢杆菌lw-6细胞膜上可见球形纳米硒颗粒，粒径约150nm左右。通过edx能谱分析红色箭头所指的纳米颗粒，硒的特定吸收峰分别出现在1.37，11.22和12.49kev处，说明甲基营养型芽孢杆菌lw-6菌株将亚硒酸钠转化后形成的纳米颗粒是纳米硒。
实施例5，生物纳米硒锌发酵工艺
5.1，菌种活化
用斜面培养基对菌株进行活化培养，培养基配方为:葡萄糖8g/l，酵母浸粉5g/l，工业盐10g/l，琼脂18-20g/l，胰蛋白胨10g/l，水补足到1l，调节ph为7.0-7.2；将甲基营养型芽孢杆菌lw-6接种于斜面培养基上，28℃培养36小时。
5.2，种子液的制备
种子培养液体培养基配方为：葡萄糖8g/l，酵母浸粉5g/l，工业盐10g/l，胰蛋白胨10g/l，水补足到1l，调节ph为7.0-7.2。将活化好的甲基营养型芽孢杆菌lw-6用无菌生理盐水配制成108cfu/ml的菌悬液，以1％的接种量接种于液体培养基中，28℃摇床震荡培养，转速为150rpm，培养时间为24h。
5.3，发酵罐发酵
发酵罐发酵培养液体发酵培养基配方为:蛋白栋10g/l，葡萄糖5g/l，kh2p042g/l，mg2s04.7h20lg/l，亚硒酸钠4500毫克/升，七水硫酸锌1786毫克/升，ph7.0-7.2；控制培养基体积为发酵罐体积的70％，将种子液按照3％的接种量接入发酵罐，控制发酵温度为28℃，搅拌速度为280rpm，通气量为1：(0.3-0.6)，罐压1.4-1.8f/cm2，发酵48-72小时。
5.4，发酵液得到1800mg/l生物纳米硒锌母液。
发酵液下罐，进行生物纳米硒含量测定，获得生物纳米硒含量为1800mg/l生物纳米硒母液。其中，锌不经微生物转化，其在生物纳米硒母液中认为初加入时的无机锌状态。其中，生物纳米硒母液也可以称为生物纳米硒锌母液。
实施例6，生物纳米硒母液在液体肥料中的应用
在搅拌釜中，将生物纳米硒含量为1800mg/l的生物纳米硒锌母液添加到纯净水中，加入黄腐酸钾等辅料，充分搅拌均匀，配制成含硒量90mg/l、含锌量20mg/l的富硒锌微生物菌剂。
将富硒微生物菌剂在富硒小麦、水稻、玉米等粮食作物，富硒大豆、花生、谷子、红薯等杂粮，在富硒金针菇、香菇、木耳等食用菌中施用，富硒番茄、茄子、黄瓜等，富硒苹果、弥猴桃等水果以及富硒茶叶中的用量分别为2l/亩、3l/亩、1.5l/吨基质、4l/亩、5l/亩、4l/亩，各个作物的硒含量分别为小麦287.2μg/kg、水稻214.4μg/kg、玉米260.1μg/kg、大豆237.lμg/kg、花生238.lμg/kg、谷子225.5μg/kg、红薯60.8μg/kg、金针菇435.5μg/kg、香菇1977.4μg/kg、木耳2853.2μg/kg、番茄97.9μg/kg、茄子76.2μg/kg、黄瓜49.7μg/kg、苹果37.3μg/kg、弥猴桃168.8μg/kg、茶叶3438.6μg/kg。
实施例7，生物纳米硒母液在固体肥料中的应用
在混合机中，将生物纳米硒含量为1800mg/l的生物纳米硒锌母液喷淋到复合微生物肥料颗粒上，加工而成富硒锌复合微生物肥料，其纳米硒含量为90mg/kg，锌含量20mg/kg。
富硒复合微生物肥料在富硒小麦、水稻、玉米等粮食作物，富硒大豆、花生、谷子、红薯等杂粮，富硒番茄、茄子、黄瓜等黄瓜，富硒苹果、弥猴桃等水果，富硒茶叶中的用量分别为40kg/亩、40kg/亩、80kg/亩、80kg/亩各个作物的硒含量分别为小麦279.01μg/kg、水稻282.9μg/kg、玉米217.4μg/kg、大豆218.6μg/kg、花生197.6μg/kg、谷子214.3μg/kg、红薯45.3μg/kg、番茄87.9μg/kg、茄子66.lμg/kg、黄瓜42.7μg/kg、苹果39.2μg/kg、弥猴桃138.8μg/kg、茶叶3382.7μg/kg。
本说明书实施例利用甲基营养型芽孢杆菌lw-6合成生物纳米硒锌，在富硒锌肥料中应用。釆用生物发酵工艺制备生物纳米硒锌，具有环境友好,产率高，安全高效等特点，生产获得的生物纳米硒锌用于富硒锌肥料，施肥后，作物、瓜果、蔬菜、富硒锌效果显著。
本说明书实施例利用甲基营养型芽孢杆菌lw-6合成生物纳米硒锌，对硒的转化率比枯草芽孢杆菌等其他菌株的转化率提高15％-20％。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110>西安恒田生物科技有限公司
<120>利用甲基营养型芽孢杆菌lw-6合成生物纳米硒的方法及用途
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>38
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
cgggatccagagtttgatcctggctcagaacgaacgct38
<210>2
<211>36
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
cgggatcctacggctaccttgttacgacttcacccc36
<210>3
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
cagtcaggaaatgcgtacgtcctt24
<210>4
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
caaggtaatgctccaggcattgct24
<210>5
<211>1455
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
actccgtcggacttcagagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacg60
ggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggct120
aataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccac180
ttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacg240
atgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactc300
ctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgcc360
gcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccg420
ttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgcca480
gcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctc540
gcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattgga600
aactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcg660
tagagatgtggaggaacaccagtggcgaagcgactctctggtctgtaactgacgctagga720
gcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatga780
gtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccg840
cctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcg900
gtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctc960
tgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttg1020
tcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatct1080
tagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaagg1140
tggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgg1200
acagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagtt1260
cggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagc1320
atgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagttt1380
gtaacacccgagtcggtgaggtaaccttttaggagccagccgccgaaggtgggacagatg1440
attggggtgaagtcg1455
<210>6
<211>867
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
acagtccgccagtttgcccggcagattggaaatctcaagcgcacttttgcggcgggtcaa60
ttcccgcgcttttttcgctgccatccgcgctcttgcggccattaaacctttttcaacgat120
tttgcgggctgagtccggattttcaagaaggaatgtttccagcgcagaagaaaacagcgt180
atcagtgatcgttctcgcttcggagttgccgagcttcgttttcgtctgcccttcgaattg240
cggatcagggtgcttaattgaaataatggcagtcagcccttccctcacatcatccccgct300
taaattcggatcattttctttgaaaatcccttttcttcttgcatagtcgtttataacacg360
ggtcagaccggttttaaatccggcttcgtgcgtccgccttcgtatgtgttgatattattt420
gtgaaagaataaatattgcttgtatagctgtcgttgtattgcaatgcaacttcaaccgtt480
atgccgtctttctcgccttcgatataaatcggctcttcatgaacgacttctttggaacgg540
tttaagtactcaacatagcttttgattccgccttcgtagtggtactcgtttttccgttct600
tgtccttcacgtttgtcttcaatcgtgatgtttacaccttttgtcaggaaggccaattcc660
cggacacggtttgaaagcaggtcatagtcgtattcggttgtttctttgaaaatttccgga720
tccggaacgaagtgcgtaatcgttccggtcttatcagtatcaccgatcacttcaagatcg780
gccacaggtacaccgcgctcgtacgcctgatagtgggatttttccgtcacgatgaaccgt840
aacgtcaagagtggtcgacaaggcgtt867
1.一种利用甲基营养型芽孢杆菌lw-6合成生物纳米硒的方法，其特征在于，以含有亚硒酸盐的培养基为发酵培养基，以甲基营养型芽孢杆菌lw-6为发酵菌，进行发酵，得到含有生物纳米硒的生物纳米硒母液；其中，所述甲基营养型芽孢杆菌lw-6的保藏编号为cgmccno.6793。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述发酵培养基中，所述亚硒酸盐为亚硒酸钠，且亚硒酸盐的浓度为26mm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)活化甲基营养型芽孢杆菌lw-6；
(2)将活化后的甲基营养型芽孢杆菌lw-6接种于种子培养液体培养基，以制备种子液；
(3)将所述种子液接种到发酵培养基中，进行发酵；其中，
在发酵过程中，发酵温度为25-30℃，搅拌速度为260-280rpm，通气量为1：(0.3-0.6)，罐压为1.4-1.8f/cm2，发酵持续时间为48-72小时，得到生物纳米硒含量为1800mg/l的生物纳米硒母液；
在所述发酵培养基中，蛋白胨的初始浓度为10g/l，葡萄糖的初始浓度为5g/l，kh2p04的初始浓度为2g/l，mg2s04.7h20的初始浓度为lg/l，亚硒酸钠的初始浓度为4500毫克/升；所述发酵培养基的初始ph为7.0-7.2，初始体积为发酵罐体积的70％。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述生物纳米硒母液为生物纳米硒锌母液，所述发酵培养基还含有初始浓度为1786毫克/升的七水硫酸锌。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，使用斜面培养基对甲基营养型芽孢杆菌lw-6进行活化；所述斜面培养基的配方为葡萄糖8g/l，酵母浸粉5g/l，工业盐10g/l，琼脂18-20g/l，胰蛋白胨10g/l，水补足余量，并将调整ph为7.0-7.2；在活化培养期间，培养温度为28℃，培养时间为36小时；
在所述步骤(2)中，将活化后的甲基营养型芽孢杆菌lw-6配置成108cfu/ml的菌悬液；将所述菌悬液按照1％的接种量接种于所述种子培养液体培养基中；
所述种子培养液体培养基的配方为葡萄糖8g/l，酵母浸粉5g/l，工业盐10g/l，胰蛋白胨10g/l，水补足余量；所述种子培养液体培养基的初始ph为7.0-7.2；在制备种子液期间，培养温度为28℃，按照150rpm转速进行振荡培养，培养时间为24h，以得到种子液；
在所述步骤(3)中，将所述种子液按照3％的接种量接种到发酵培养基中。
6.一种生物纳米硒母液，其特征在于，通过权利要求1-5任一项所述的方法制备而成。
7.权利要求6所述的生物纳米硒母液在制备富硒锌复合微生物肥料中的用途；其中，将所述生物纳米硒母液喷淋到复合微生物肥料颗粒上，以制备富硒锌复合微生物肥料。
8.权利要求7所述的富硒锌复合微生物肥料在生产富硒作物中的用途；其中，当所述富硒锌复合微生物肥料中的生物纳米硒含量为90mg/kg时；
若所述作物为小麦，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为40kg/亩，可生产硒含量为279.01μg/kg的小麦；
若所述作物为水稻，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为40kg/亩，可生产硒含量为282.9μg/kg的水稻；
若所述作物为玉米，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为40kg/亩，可生产硒含量为217.4μg/kg的玉米；
若所述作物为大豆，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为40kg/亩，可生产硒含量为218.6μg/kg的大豆；
若所述作物为花生，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为40kg/亩，可生产硒含量为197.6μg/kg的花生；
若所述作物为谷子，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为40kg/亩，可生产硒含量为214.3μg/kg的谷子；
若所述作物为红薯，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为40kg/亩，可生产硒含量为45.3μg/kg的红薯；
若所述作物为番茄，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为80kg/亩，可生产硒含量为87.9μg/kg的番茄；
若所述作物为茄子，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为80kg/亩，可生产硒含量为66.1μg/kg的茄子；
若所述作物为黄瓜，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为80kg/亩，可生产硒含量为42.7μg/kg的黄瓜；
若所述作物为苹果，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为80kg/亩，可生产硒含量为39.2μg/kg的苹果；
若所述作物为猕猴桃，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为80kg/亩，可生产硒含量为138.8μg/kg的猕猴桃；
若所述作物为茶叶，所述富硒锌复合微生物肥料的用量为80kg/亩，可生产硒含量为3382.7μg/kg的茶叶。
9.权利要求6所述的生物纳米硒母液在制备富硒锌微生物菌剂中的用途；其中，将所述生物纳米硒母液添加到水中，再加入辅料，搅拌，以制备富硒锌微生物菌剂；所述辅料包括黄腐酸钾。
10.权利要求9所述的富硒锌微生物菌剂在生产富硒作物中的用途；其中，当所述富硒锌微生物菌剂中的生物纳米硒含量为90mg/l时；
若所述作物为小麦，所述富硒锌微生物菌剂的用量为2l/亩，可生产硒含量为287.2μg/kg的小麦；
若所述作物为水稻，所述富硒锌微生物菌剂的用量为2l/亩，可生产硒含量为214.4μg/kg的水稻；
若所述作物为玉米，所述富硒锌微生物菌剂的用量为2l/亩，可生产硒含量为260.1μg/kg的玉米；
若所述作物为大豆，所述富硒锌微生物菌剂的用量为3l/亩，可生产硒含量为237.lμg/kg的大豆；
若所述作物为花生，所述富硒锌微生物菌剂的用量为3l/亩，可生产硒含量为238.lμg/kg的花生；
若所述作物为谷子，所述富硒锌微生物菌剂的用量为3l/亩，可生产硒含量为225.5μg/kg的谷子；
若所述作物为红薯，所述富硒锌微生物菌剂的用量为3l/亩，可生产硒含量为60.8μg/kg的红薯；
若所述作物为金针菇，所述富硒锌微生物菌剂的用量为1.5l/吨基质，可生产硒含量为435.5μg/kg的金针菇；
若所述作物为香菇，所述富硒锌微生物菌剂的用量为1.5l/吨基质，可生产硒含量为1977.4μg/kg的香菇；
若所述作物为木耳，所述富硒锌微生物菌剂的用量为1.5l/吨基质，可生产硒含量为2853.2μg/kg的木耳；
若所述作物为番茄，所述富硒锌微生物菌剂的用量为4l/亩，可生产硒含量为97.9μg/kg的番茄；
若所述作物为茄子，所述富硒锌微生物菌剂的用量为4l/亩，可生产硒含量为76.2μg/kg的茄子；
若所述作物为黄瓜，所述富硒锌微生物菌剂的用量为4l/亩，可生产硒含量为49.7μg/kg的黄瓜；
若所述作物为苹果，所述富硒锌微生物菌剂的用量为5l/亩，可生产硒含量为37.3μg/kg的苹果；
若所述作物为猕猴桃，所述富硒锌微生物菌剂的用量为5l/亩，可生产硒含量为168.8μg/kg的猕猴桃；
若所述作物为茶叶，所述富硒锌微生物菌剂的用量为4l/亩，可生产硒含量为3438.6μg/kg的茶叶。
技术总结