本发明属于生物技术领域，具体为一株吡蚜酮降解菌iurmf18及其应用。
背景技术：
化学农药作为减少损失、保障农业丰收的重要手段，在当代农业生产中发挥着重要的作用。但由于化学农药的长期不合理使用，使其在环境中的蓄积量越来越高，对生态环境造成了严重污染。其中，农产品中农药残留严重超标对人类身体安全健康构成直接威胁。
目前，国内外对农药的降解方法很多，在不同的降解方法中，生物降解是最重要的方法之一。微生物修复法是利用特定微生物体的代谢吸收、转化、清除或降解化学农药的有效成分，实现降解农药、环境净化的效果，具有高效经济、无二次污染等特点。由于其较高的应用价值，该技术在各类污染领域都有涉及，现阶段该技术已被国内外有关行业部门专家认为是生态环境保护领域最具有价值和生命力的处理技术，是未来农业污染修复的主要处理手段，也是有效解决化学农药污染土壤生态修复的处理手段。
吡蚜酮属于吡啶类(吡啶甲亚胺类)或三嗪酮类杀虫剂，是一株全新的非杀生性杀虫剂，对害虫具有触杀作用，同时还有内吸活性。在我国农业种植生产中广泛用于防治蔬菜、小麦、水稻、棉花、果树上的蚜虫科、飞虱科、粉虱科、叶蝉科等多种害虫。作用机理是蚜虫或飞虱一接触到吡蚜酮几乎立即产生口针阻塞效应，立刻停止取食，并最终饥饿致死，而且此过程是不可逆转的。吡蚜酮在植物体内既能在木质部输导也能在韧皮部输导；因此既可用作叶面喷雾，也可用于土壤处理。由于其良好的输导特性，在茎叶喷雾后新长出的枝叶也可以得到有效保护。吡蚜酮因其在田间控害效果优异、选择性强且不具有直接毒杀性等优点而备受人们的青睐，但最近美国环境保护署(epa)已经将吡蚜酮归为人类“可能”的致癌物，因此，找到一株能经济卫生降解吡蚜酮农药的方法迫在眉睫。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一株吡蚜酮降解菌iurmf18，及其对土壤和水体中吡蚜酮降解等方面的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一株吡蚜酮降解菌iurmf18；其中吡蚜酮降解菌iurmf18已于2020年6月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno:20853，分类命名为嗜盐鞘氨醇杆菌(sphingobacteriumthalpophilum)。
上述吡蚜酮降解菌iurmf18，对被吡蚜酮污染的环境具有修复作用，尤其对被吡蚜酮污染的土壤环境，以及被吡蚜酮污染的水体，具有修复作用。
上述吡蚜酮降解菌iurmf18对土壤中的废弃吡蚜酮具有降解作用，对水体中所含的吡蚜酮具有降解作用，可直接应用于农田的净化处理领域。
上述的该吡蚜酮降解菌iurmf18的筛选方法，步骤如下：
1)从被吡蚜酮污染的污泥中称取泥土，加入吡蚜酮降解菌iurmf18筛选液体培养基进行富集，在35-40℃、150-200r/min恒温摇床中培养4-10天；
2)吸取步骤1中所得的培养基加入新的吡蚜酮降解菌iurmf18筛选液体培养基进行传代，如此传代3-6次；
3)取步骤2中所得菌液在lb平板上划线分离，得到吡蚜酮降解菌iurmf18；
其中吡蚜酮降解菌iurmf18筛选培养基成分为：每1l去离子水中含有吡蚜酮农药100mg/l,氯化铵0.66g，磷酸氢二钾(k2hpo4)1.5g，磷酸二氢钾(kh2po4)0.5g，硫酸镁(mgso4)0.1g，磷酸氢二钾(k2hpo4)1.5g，氯化钠0.35g，ph7.0-7.2；
lb固体培养基成分为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，以去离子水补足体积至1l。
上述吡蚜酮降解菌iurmf18的优选筛选方法，步骤如下：
1)从被吡蚜酮污染的污泥中称取泥土5g，加入100ml吡蚜酮降解菌iurmf18筛选液体培养基进行富集，在35℃、180r/min恒温摇床中培养5-7天；
2)吸取步骤1中所得的培养基3ml加入新的吡蚜酮降解菌iurmf18筛选液体培养基进行传代，如此传代4-5次；
3)取步骤2中所得菌液在lb平板上划线分离，得到吡蚜酮降解菌iurmf18；
上述吡蚜酮降解菌iurmf18的干粉剂，为用使用扩大培养后的吡蚜酮降解菌iurmf18培养物，经过常规方法干燥而成。
所述吡蚜酮降解菌iurmf18是按照如下所述方法筛选获得：
一、从江苏常州武进区被吡蚜酮污染的污泥中称取泥土分离菌株，称取污泥5g，加入100ml吡蚜酮降解菌iurmf18筛选液体培养基进行富集，在35℃、180r/min恒温摇床中培养5-7天；然后吸取培养基3ml加入新的吡蚜酮降解菌iurmf18筛选液体培养基进行传代，如此传代4-5次，在lb平板上划线分离，经过上百次分离试验筛选，最终得到一批能在以吡蚜酮作为唯一碳源的培养基中生存的菌种；
所述吡蚜酮降解菌iurmf18筛选培养基成分为：每1l去离子水中含有吡蚜酮农药100mg/l,氯化铵0.66g，磷酸氢二钾(k2hpo4)1.5g，磷酸二氢钾(kh2po4)0.5g，硫酸镁(mgso4)0.1g，磷酸氢二钾(k2hpo4)1.5g，氯化钠0.35g，ph7.0-7.2；
所述lb固体培养基成分为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，以去离子水补足体积至1l。
二、分析分离得到的不同菌种对培养基中吡蚜酮的降解效率，筛选获得吡蚜酮降解效果最佳的菌株。
具体测定方法如下：
1、培养基制备
基础盐培养基：nh4cl0.66g，k2hpo41.5g，kh2po40.5g，mgso40.1g，k2hpo41.5g，nacl0.35g，ph7.0-7.2；121℃灭菌20min。
lb液体培养基：酵母粉5g，氯化钠10g，蛋白胨10g，去离子水1000ml，ph7.0，121℃灭菌20min。
2、吡蚜酮降解效率测定方法
2.1吡蚜酮标准曲线的绘制
取0.0256g吡蚜酮标准品，用色谱乙腈溶解，定容至50ml容量瓶中，制成500mg/l的母液。再用色谱纯乙腈稀释母液，逐级配置0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2mg/l浓度的系列标准溶液，利用高效液相色谱仪在波长298nm条件下，测定峰面积，作浓度-峰面积标准曲线。
2.2吡蚜酮降解率测定方法
取培养液，用高效液相色谱仪在波长298nm条件下，测定峰面积，利用吡蚜酮标准曲线所建立的线性回归方程计算出吡蚜酮浓度，进一步计算得出吡蚜酮降解率。所有实验均设置三个重复。
2.3通过吡蚜酮降解菌iurmf18对吡蚜酮的降解率，得出最优菌种
将吡蚜酮降解菌iurmf18菌株在lb液体培养基中培养，离心收集菌体，用无菌水重悬，并稀释至od600＝1，将所选菌株接种1ml到100.0ml含100mg/l吡蚜酮的基础液体无机盐培养基中，置于恒温摇床中35℃、180r/min培养，每6小时取样测定降解率。
其中，降解菌iurmf18对吡蚜酮的降解效果明显，且菌株生长良好，其30h对吡蚜酮的降解率为91.33％；
2.4吡蚜酮降解菌iurmf18对土壤中的废弃吡蚜酮的降解
将吡蚜酮降解菌iurmf18按1％的接种量接种于100g灭菌的土壤中，经测定，土壤中吡蚜酮的含量为58mg/kg，于35℃恒温条件下培养30h，测定吡蚜酮降解率为77.01％。
2.5吡蚜酮降解菌iurmf18对废水中的废弃吡蚜酮的降解
将吡蚜酮降解菌iurmf18按1％的接种量接种于100ml含吡蚜酮的废水中，经测定该废水的吡蚜酮的含量为58mg/l，于35℃、180r/min条件下培养30h，测定吡蚜酮降解率为：81.23％。
菌株鉴定
采用振荡破碎法获得吡蚜酮降解菌iurmf18基因组dna，通过pcr方法对菌株16srrna基因进行扩增并送至上海生物工程公司进行测序分析；用于扩增16srrna基因的上游引物序列为：5’agagtttgatcctggctcag3’，下游引物序列为5’ggttaccttgttacgactt3’。
pcr反应条件是：98℃预变性5min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸40s，反应设置30个循环，10℃保温5min。使用ncbi的blast功能在genebank数据库中进行序列比对，分析菌株的分类为：嗜盐鞘氨醇杆菌(s.thalpophilum)
吡蚜酮降解菌iurmf1816srrna基因序列见序列表。
本发明的有益效果为：
1、筛选出一株可以在吡蚜酮为唯一碳源的环境中存活的吡蚜酮降解菌iurmf18，经降解分析表明，该菌株可以在含100mg/l吡蚜酮筛选固体培养基和液体培养基中生长良好，具有很高的吡蚜酮降解特性。
2、该吡蚜酮降解菌iurmf18将在土壤中吡蚜酮降解、水体污染中吡蚜酮的降解、土壤中废弃吡蚜酮的降解和环境污染修复中具有应用前景。
3、本发明吡蚜酮降解菌iurmf18的应用，有利于避免因物理或化学方法降解吡蚜酮而造成的二次污染。
附图说明
图1为该吡蚜酮降解菌iurmf18单菌落形态图。
图2为将吡蚜酮降解菌iurmf18按1％的接种量接种于100ml的无菌msm中测得的吡蚜酮降解率。
图3为将吡蚜酮降解菌iurmf18按1％的接种量接种于100ml含吡蚜酮的废水中测得的吡蚜酮降解率。
图4为将吡蚜酮降解菌iurmf18按1％的接种量接种于100g灭菌的土壤中测得的吡蚜酮降解率。
具体实施方式
吡蚜酮降解菌iurmf18的筛选过程
(一)、主要材料
1、培养基
吡蚜酮筛选液体培养基成分：每1l去离子水中含有吡蚜酮农药100mg/l,氯化铵0.66g，磷酸氢二钾(k2hpo4)1.5g，磷酸二氢钾(kh2po4)0.5g，硫酸镁(mgso4)0.1g，磷酸氢二钾(k2hpo4)1.5g，氯化钠0.35g，ph7.0-7.2；
相对应的固体培养基则在1l液体培养基中添加琼脂粉15g配制成。
每1l的lb液体培养基成分：分别加入蛋白胨10克，酵母粉5克，nacl10克，配制的液体培养基用hcl或者naoh调节ph为7.0-7.2，然后再加入去离子水补足至1l。
相对应的lb固体培养基则在1l液体培养基中添加琼脂粉15g配制成。
2、仪器设备
flexcyclerpcr扩增仪，tanon-3500凝胶成像系统，北京市六一仪器厂电泳仪，灭菌锅，英衡电子天平，uv1900紫外可见分光光度计，恒温培养箱，eppendorf高速冷冻离心机，摇床，青岛海尔集团的低温冰箱。
(二)、吡蚜酮降解菌iurmf18的筛选过程
(1)从江苏常州武进区被吡蚜酮污染的污泥中称取泥土分离菌株，称取污泥5g，加入100ml吡蚜酮降解菌iurmf18筛选液体培养基进行富集，在35℃、180r/min恒温摇床中培养5-7天；然后吸取培养基3ml加入新的吡蚜酮降解菌iurmf18筛选液体培养基进行传代，如此传代4-5次，在lb平板上划线分离，经过上多次分离筛选，最终得到一些能在以吡蚜酮作为唯一碳源的培养基中生存的微生物；
所述吡蚜酮降解菌iurmf18筛选培养基成分为：每1l去离子水中含有吡蚜酮农药100mg/l，氯化铵0.66g，磷酸氢二钾(k2hpo4)1.5g，磷酸二氢钾(kh2po4)0.5g，硫酸镁(mgso4)0.1g，磷酸氢二钾(k2hpo4)1.5g，氯化钠0.35g，ph7.0-7.2；
所述lb固体培养基成分为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，以去离子水补足体积至1l。
(2)将培养物在lb平板上划线分离，置于35℃恒温培养箱中培养12-26小时，获得吡蚜酮降解菌iurmf18株iurmf18单菌落形态图(见图1)；
下面为具体实施例部分。
实施例1
将吡蚜酮降解菌iurmf18在lb液体培养基中培养，离心收集菌体，用无菌水重悬并稀释至od600＝1，将所选菌株接种1ml到含100.0mg/l吡蚜酮的基础液体无机盐培养基中，置于恒温摇床中180r/min，35℃培养30h，吡蚜酮降解菌iurmf18有明显的生长。
实施例2
将吡蚜酮降解菌iurmf18按1％的接种量接种于100ml的无菌msm中，添加吡蚜酮至终浓度100mg/l，于35℃、180r/min条件下培养30h，测定吡蚜酮降解率为90.67％(见图2)。
实施例3
将吡蚜酮降解菌iurmf18按1％的接种量接种于100ml含吡蚜酮的废水中，经测定该废水的吡蚜酮的含量为58mg/l，于35℃、180r/min条件下培养30h，测定吡蚜酮降解率为：81.23％(见图3)。
实施例4
将吡蚜酮降解菌iurmf18按1％的接种量接种于100g灭菌的土壤中，经测定，土壤中吡蚜酮的含量为58mg/kg，于35℃恒温条件下培养30h，测定吡蚜酮降解率为77.01％(见图4)。
实施例5
吡蚜酮降解菌iurmf18干粉剂的制备，吡蚜酮降解菌iurmf18扩大培养后，经过常规方法干燥制得。
序列表
<110>常州大学
江苏碧奥环保科技有限公司
河北慈心环保科技有限公司
<120>一株吡蚜酮降解菌iurmf18及其应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1425
<212>dna
<213>嗜盐鞘氨醇杆菌(sphingobacteriumthalpophilum)
<400>1
cagcatgggtacagtctaatacatgcaagtcggacgggatccattggtagcttgctatca60
atggtgagagtggagcacgggtgcgtaacgcgtgagcaacctgcctccatcagggggata120
gcctctcgaaagagagattaacaccgcataacataatgttccggcatcggacgattatta180
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agcaatgacgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaagccatgaaa1380
gttgggggtacctaaagcatgttaccgcaaggagcggtcaggtac1425
1.一株吡蚜酮降解菌iurmf18，其特征在于，该吡蚜酮降解菌iurmf18为嗜盐鞘氨醇杆菌（sphingobacteriumthalpophilum），其中该吡蚜酮降解菌iurmf18编号：iurmf18，保藏单位为：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为cgmccno.20853。
2.如权利要求1所述的吡蚜酮降解菌iurmf18的应用，其特征在于，所述吡蚜酮降解菌iurmf18，对被吡蚜酮污染的环境具有修复作用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述吡蚜酮降解菌iurmf18，对土壤中被废弃的吡蚜酮污染的环境，具有修复作用。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述吡蚜酮降解菌iurmf18，对被水体中的吡蚜酮污染的水环境，具有修复作用。
5.如权利要求1所述的吡蚜酮降解菌iurmf18的应用，其特征在于，所述吡蚜酮降解菌iurmf18对土壤中的废弃吡蚜酮具有降解作用。
6.如权利要求1所述的吡蚜酮降解菌iurmf18的应用，其特征在于，所述吡蚜酮降解菌iurmf18对水体中所含的吡蚜酮具有降解作用。
7.如权利要求1所述的该吡蚜酮降解菌iurmf18的筛选方法，其特征在于，步骤如下：
1）从使用过吡蚜酮农药的土壤中称取泥土，加入吡蚜酮降解菌iurmf18筛选液体培养基中进行富集，在35-40℃、150-200r/min恒温摇床中培养4-10天；
2）吸取步骤1中所得的培养物加入新的吡蚜酮降解菌iurmf18筛选液体培养基进行传代，如此传代3-6次；
3）取步骤2中所得的培养物在lb平板上划线分离，得到吡蚜酮降解菌iurmf18；
其中吡蚜酮降解菌iurmf18筛选培养基成分为：每1l去离子水中含有吡蚜酮农药100mg/l,氯化铵0.66g，磷酸氢二钾（k2hpo4）1.5g，磷酸二氢钾(kh2po4)0.5g，硫酸镁（mgso4）0.1g，磷酸氢二钾(k2hpo4)1.5g，氯化钠0.35g，ph7.0-7.2；
lb固体培养基成分为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，ph7.0-7.2，以去离子水补足体积至1l。
8.如权利要求7所述的该吡蚜酮降解菌iurmf18的筛选方法，其特征在于，步骤如下：
1）从被吡蚜酮污染的污泥中中称取泥土5克，加入100ml吡蚜酮降解菌iurmf18筛选液体培养基进行富集，在35℃、180r/min恒温摇床中培养5-7天；
2）吸取步骤1中所得的培养物3ml加入新的吡蚜酮降解菌iurmf18筛选液体培养基进行传代，如此传代4-5次；
3）取步骤2中所得的培养物在lb平板上划线分离，得到吡蚜酮降解菌iurmf18。
9.如权利要求1所述的该吡蚜酮降解菌iurmf18的干粉剂，其特征在于，所述干粉剂为用使用扩大培养后的吡蚜酮降解菌iurmf18培养物，经过常规方法干燥而成。
技术总结