本发明涉及一种屎肠球菌的发酵方法，属于屎肠球菌发酵技术。
背景技术：
乳酶生，英文名称为lactasin，别名表飞鸣，是一种白色或淡黄色粉末乳酸菌制剂助消化药，属于国家基本药物，其现行标准收载于1998年版的《卫生部药品标准》二部第六册生化药品第一分册中。乳酶生在现行标准中归类于生化药品，具有微生态活菌制品的特性，可以使肠内糖类酵解，产生乳酸从而抑制肠内产气。主要用于治疗消化不良、腹胀、小儿饮食不当等引起的腹泻等病症；也可以用于治疗维生素b缺乏症、幼儿湿疹以及不合理使用抗生素引起的肠内菌群失调紊乱症。其活性成分为屎肠球菌，属于动物肠道正常菌群之一，在肠道微生物菌群中占有一定的比例并且与其它肠道益生菌相互协作，共同维持宿主的正常生理功能。
目前世界各国的很多制药厂大多采用屎肠球菌为主要发酵菌株来生产乳酶生药剂，各个厂家发酵用的培养基种类繁多，没有统一标准，培养基中营养成分不能完全适合和满足该菌株的营养要求，因此导致该菌株发酵过程中出现生物量较低、质量不够稳定等问题。
发酵培养基各成分之间的比例直接影响发酵结束时菌体量的大小。常用的优化培养基组分之间比例的方法主要有正交试验、均匀设计和响应面法等，而其中响应面法(responsesurfacemethodology,rsm)为常用的统计优化方法。该方法是利用合理的试验设计进行试验并得到一些数据，之后采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，最后通过对回归方程的分析来寻找最佳的工艺参数，得以解决多变量问题的一种统计方法。
鉴于此，有必要提供一种屎肠球菌的发酵方法，以解决现有技术的不足。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种屎肠球菌的发酵方法。本发明确定了屎肠球菌发酵所需要的含糖牛肉汤培养基中碳源、氮源和氯化钠等成分的组成、生长ph值以及发酵培养温度等参数，可以显著提高屎肠球菌的生物量，为屎肠球菌工业化发酵生产乳酶生药剂提供了技术支持。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种屎肠球菌的发酵方法，包括如下步骤：
步骤1：菌种活化
制备含糖牛肉汤培养基，所述含糖牛肉汤培养基由牛肉膏、碳源、氮源和氯化钠组成，所述牛肉膏浓度为10g/l，所述碳源浓度为20g/l，所述氮源浓度为20g/l，所述氯化钠浓度为0g/100ml-4.0g/100ml，加蒸馏水定容，调节ph值为4.0-10.0，115℃灭菌20min后所得；
使用无菌接种环挑取-80℃保存的屎肠球菌菌株,接种于含糖牛肉汤培养基上，于温度为30℃-37℃培养至长出单菌落；
步骤2：生长曲线的绘制
挑取步骤1得到的单菌落，接种于含糖牛肉汤培养基中，于37℃静置培养12h，然后以1％v/v的接种量接种于100ml含糖牛肉汤培养基中，于37℃静置培养12h，每隔1h取样一次，取样12次，测定在600nm波长下的吸光值，绘制生长曲线；
步骤3：发酵培养
挑取步骤2在含糖牛肉汤培养基上长势优良的单菌落，接种于装有40ml含糖牛肉汤培养基中，于37℃静置培养12h，吸取种子培养液，以1％v/v的接种量转接到装有100ml与含糖牛肉汤培养基中，于37℃静置培养12h，即得到发酵液。
本发明的屎肠球菌的发酵方法的有益效果是：
本发明确定了屎肠球菌发酵所需要的含糖牛肉汤培养基中碳源、氮源和氯化钠等成分的组成、生长ph值以及发酵培养温度等参数，可以显著提高屎肠球菌的生物量，为屎肠球菌工业化发酵生产乳酶生药剂提供了技术支持。其中，本发明的步骤1中，屎肠球菌菌株购自中国食品药品检定研究院，批号为140623-200708。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤1中，所述碳源为乳糖、蔗糖、葡萄糖、糖蜜和淀粉中的任意一种。
采用上述进一步的有益效果是：本发明经过研究发现，不同的碳源对屎肠球菌生长存在不同的影响，其中屎肠球菌在以乳糖为碳源进行发酵时生长的最好，其生物量可以达到60.8mg/100ml，蔗糖次之；而在以淀粉为碳源的培养基中生长较差，其最终生物量仅仅达28.2mg/100ml。
更进一步，所述碳源为乳糖。
采用上述更进一步的有益效果是：本发明经过研究发现，采用乳糖作为碳源，生物量最大。
进一步，步骤1中，所述氮源为胰蛋白胨、玉米浆、尿素、氨水和硫酸铵中的任意一种。
采用上述进一步的有益效果是：本发明经过研究发现，不同的氮源中，对屎肠球菌发酵生长影响最佳的是胰蛋白胨，其最终生物量可达61.1mg/100ml，而其它的几种氮源对其生长影响作用几乎相差不大，最终生物量均达不到胰蛋白胨为氮源时的三分之一。
更进一步，所述氮源为胰蛋白胨。
采用上述更进一步的有益效果是：本发明经过研究发现，采用胰蛋白胨作为氮源，生物量最大。
进一步，步骤1中，所述氯化钠浓度为0.4g/100ml-0.5g/100ml。
采用上述进一步的有益效果是：本发明经过研究发现，培养基中的氯化钠在屎肠球菌发酵生长时具有一定的作用但不是决定性作用，在没有氯化钠添加的情况下其最终生物量仍可达到47.8mg/100ml，但在少量添加氯化钠的情况下，如0.5g/100ml时，其终生物量可达60.4mg/100ml，与无添加相比生物量提高了26.3％。
进一步，步骤1中，所述ph值为7.0-9.0。
采用上述进一步的有益效果是：本发明经过研究发现，培养基ph值对菌株发酵生长具有重要的影响，培养基ph值在7.0-9.0时菌体生长较快，环境ph值过酸及过碱均不利于屎肠球菌的生长，而最佳ph值为8.0，此时菌体最终生物量可达58.1mg/100ml。
进一步，步骤1中，所述温度为37℃。
采用上述进一步的有益效果是：本发明经过研究发现，温度对屎肠球菌的生长具有重要的作用，在20℃-37℃，菌体生长速度与温度呈正相关，而当温度超过37℃时菌体生长速度下降。本发明确定了屎肠球菌生长的最佳温度为37℃，此条件下其最终生物量可达61.2mg/100ml。
附图说明
图1为本发明的实验例1中，碳源对屎肠球菌生物量的影响图。
图2为本发明的实验例2中，氮源对屎肠球菌生物量的影响图。
图3为本发明的实验例3中，ph值对屎肠球菌生物量的影响图。
图4为本发明的实验例4中，温度对屎肠球菌生物量的影响图。
图5为本发明的实验例5中，氯化钠浓度对屎肠球菌生物量的影响图。
图6为本发明的实验例6中，工艺参数优化前后对屎肠球菌生物量的影响图。
图7为本发明的实验例7中，屎肠球菌的细胞显微镜图，放大倍数为1000倍。
图8为本发明的实验例7和对比例1的生物量的对比图。
图9为本发明的对比例1中，屎肠球菌的细胞显微镜图，放大倍数为1000倍。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例
本实施例的屎肠球菌的发酵方法，包括如下步骤：
步骤1：菌种活化
制备含糖牛肉汤培养基，所述含糖牛肉汤培养基由牛肉膏、碳源、氮源和氯化钠组成，所述牛肉膏浓度为10g/l，所述碳源浓度为20g/l，所述氮源浓度为20g/l，所述氯化钠浓度为0g/100ml-4.0g/100ml，加蒸馏水定容，调节ph值为4.0-10.0，115℃灭菌20min后所得；
使用无菌接种环挑取-80℃保存的屎肠球菌菌株,接种于含糖牛肉汤培养基上，于温度为30℃-37℃培养至长出单菌落；
步骤2：生长曲线的绘制
挑取步骤1得到的单菌落，接种于含糖牛肉汤培养基中，于37℃静置培养12h，然后以1％v/v的接种量接种于100ml含糖牛肉汤培养基中，于37℃静置培养12h，每隔1h取样一次，取样12次，测定在600nm波长下的吸光值，绘制生长曲线；
步骤3：发酵培养
挑取步骤2在含糖牛肉汤培养基上长势优良的单菌落，接种于装有40ml含糖牛肉汤培养基中，于37℃静置培养12h，吸取种子培养液，以1％v/v的接种量转接到装有100ml与含糖牛肉汤培养基中，于37℃静置培养12h，即得到发酵液。
取步骤3得到的发酵液100ml，于4℃，10000rpm离心15min后，收集湿菌体，用蒸馏水冲洗2次，再于4℃，10000rpm离心15min，得到湿菌体，将得到的湿菌体置于60℃下恒温干燥至恒重，用称量法测定其生物量。
实验例1：碳源对屎肠球菌生物量的影响
如图1所示，不同的碳源对屎肠球菌生长存在不同的影响，其中屎肠球菌在以乳糖为碳源进行发酵时生长的最好，其生物量可以达到60.8mg/100ml，蔗糖次之；而在以淀粉为碳源的培养基中生长较差，其最终生物量仅仅达28.2mg/100ml。
实验例2：氮源对屎肠球菌生物量的影响
如图2所示，不同的氮源中，对屎肠球菌发酵生长影响最佳的是胰蛋白胨，其最终生物量可达61.1mg/100ml，而其他的几种氮源对其生长影响作用几乎相差不大，最终生物量均达不到胰蛋白胨为氮源时的三分之一。
实验例3：ph值对屎肠球菌生物量的影响
如图3所示，培养基ph值对菌株发酵生长具有重要的影响，培养基ph值在7-9之间时菌体生长较快，环境ph值过酸及过碱均不利于屎肠球菌的生长，而最佳ph值为8.0，此时菌体最终生物量可达58.1mg/100ml。
实验例4：温度对屎肠球菌生物量的影响
如图4所示，温度对屎肠球菌的生长具有重要的作用，在20-37℃这个范围内，菌体生长速度与温度呈正相关，而当温度超过37℃时菌体生长速度下降，屎肠球菌生长的最佳温度为37℃，此条件下其最终生物量可达61.2mg/100ml。
实验例5：氯化钠浓度对屎肠球菌生物量的影响
如图5所示，培养基中的氯化钠在屎肠球菌发酵生长时具有一定的作用但不是决定性作用，在没有氯化钠添加的情况下其最终生物量仍可达到47.8mg/100ml，但在少量添加氯化钠的情况下，如0.5g/100ml时，其终生物量可达60.4mg/100ml，与无添加相比生物量提高了26.3％。
实验例6：响应面设计
为了确定发酵培养基中各种组分的配比及屎肠球菌培养温度，利用中心组合试验方法进行响应面试验设计，以ph值、温度、乳糖浓度和胰蛋白胨浓度四个因素的不同梯度为响应变量，以屎肠球菌菌体生物量(od600)为响应值，共进行30次试验以确定每个变量的影响因子。
如图6所示，根据响应面三维图对试验结果分析，各个编码所对应的真实值近似为ph值为8.2、温度为37℃、乳糖浓度为15g/l、胰蛋白胨浓度为25g/l和氯化钠浓度5g/l。经优化后屎肠球菌发酵12h其菌体浓度od600的理论值可以达到2.834。
实验例7
根据以上的优化结果进行了试验验证，具体而言，步骤1的含糖牛肉汤培养基由牛肉膏10g/l、乳糖15g/l、胰蛋白胨25g/l和氯化钠5g/l组成，加蒸馏水定容，调节ph值为8.2，115℃灭菌20min后所得，挑取-80℃保存的屎肠球菌菌株,接种于含糖牛肉汤培养基上，于温度为37℃培养至长出单菌落。挑取长势优良的单菌落，接种于装有40ml含糖牛肉汤培养基中，于37℃静置培养12h后，该屎肠球菌的细胞显微镜图，如图7所示。再于4℃，10000rpm离心15min获得菌体，恒温干燥称重结果，生物量达到98.7mg/100ml。如图8所示。
对比例1
本对比例1中，步骤1的含糖牛肉汤培养基由牛肉膏10g/l、乳糖20g/l和胰蛋白胨20g/l组成，加蒸馏水定容，调节ph值为8，115℃灭菌20min后所得，挑取-80℃保存的屎肠球菌菌株,接种于含糖牛肉汤培养基上，于温度为37℃培养至长出单菌落。挑取长势优良的单菌落，接种于装有40ml含糖牛肉汤培养基中，于37℃静置培养12h后，该屎肠球菌的细胞显微镜图，如图9所示。再于4℃，10000rpm离心15min获得菌体，恒温干燥称重结果，生物量达到63.7mg/100ml。如图8所示。
由实验例7和对比例1可知，采用本发明的培养基配方及培养条件，屎肠球菌的生物量提高了54.9％，提升效果显著。
对比例2
步骤1：菌种的复壮：在净化工作台中，从屎肠球菌种子管挑取一接种环的种子，接入已灭菌的液体培养基试管中，该液体培养基由牛肉膏10g/l、乳糖20g/l和胰蛋白胨20g/l组成，初始ph值为7.2-7.4，发酵培养温度为37℃。再取生长良好、无杂菌的试管培养液，接入已灭菌的牛奶培养基中，振摇均匀，放置恒温箱37℃培养48h。上述牛奶培养基是鲜牛奶脱脂后于115℃灭菌20min后所得，牛奶浓度为100％。取质量良好的牛奶培养试管，从中挑取一接种环的牛奶凝固块，于已灭菌的液体培养基的试管中，37℃培养16h-24h。
步骤2：分离与培养：在净化工作台中，将上述液体试管培养液依次稀释成10-7或10-8，然后吸出1ml稀释液放入已灭菌的平皿里，再倒入预先灭菌溶化好的、45℃的分离培养基20ml，摇匀，待凝固后置恒温箱内37℃培养48h，取出置4℃冰箱备用。
步骤3：发酵培养：取生长良好、无杂菌平皿1个，在净化工作台中，挑取一个透明圈较大的梭状菌落，接入一支已灭菌的液体培养基试管中，摇匀后置恒温箱内37℃培养16h-24h。
步骤4：生物量测定：将上述发酵液100ml于离心管中，于4℃，10000rpm离心15min，收集湿菌体，用蒸馏水冲洗2次，再于4℃，10000rpm离心15min，获得湿菌体，将获得的湿菌体置于60℃下恒温干燥至恒重，用称量法测定其生物量。
步骤5：测定结果：生物量为51mg/100ml。
由实验例7和对比例2可知，采用本发明的培养基配方及培养条件，屎肠球菌的生物量提高了93.53％，提升效果显著。
由此可见，本发明确定了屎肠球菌培养基中碳源、氮源和氯化钠等成分的组成、生长ph值以及发酵培养温度等参数，可以显著提高屎肠球菌的生物量，为屎肠球菌工业化发酵生产乳酶生药剂提供了技术支持。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种屎肠球菌的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：菌种活化
制备含糖牛肉汤培养基，所述含糖牛肉汤培养基由牛肉膏、碳源、氮源和氯化钠组成，所述牛肉膏浓度为10g/l，所述碳源浓度为20g/l，所述氮源浓度为20g/l，所述氯化钠浓度为0g/100ml-4.0g/100ml，加蒸馏水定容，调节ph值为4.0-10.0，115℃灭菌20min后所得；
使用无菌接种环挑取-80℃保存的屎肠球菌菌株,接种于含糖牛肉汤培养基上，于温度为30℃-37℃培养至长出单菌落；
步骤2：生长曲线的绘制
挑取步骤1得到的单菌落，接种于含糖牛肉汤培养基中，于37℃静置培养12h，然后以1％v/v的接种量接种于100ml含糖牛肉汤培养基中，于37℃静置培养12h，每隔1h取样一次，取样12次，测定在600nm波长下的吸光值，绘制生长曲线；
步骤3：发酵培养
挑取步骤2在含糖牛肉汤培养基上长势优良的单菌落，接种于装有40ml含糖牛肉汤培养基中，于37℃静置培养12h，吸取种子培养液，以1％v/v的接种量转接到装有100ml与含糖牛肉汤培养基中，于37℃静置培养12h，即得到发酵液。
2.根据权利要求1所述的屎肠球菌的发酵方法，其特征在于，步骤1中，所述碳源为乳糖、蔗糖、葡萄糖、糖蜜和淀粉中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的屎肠球菌的发酵方法，其特征在于，所述碳源为乳糖。
4.根据权利要求1所述的屎肠球菌的发酵方法，其特征在于，步骤1中，所述氮源为胰蛋白胨、玉米浆、尿素、氨水和硫酸铵中的任意一种。
5.根据权利要求4所述的屎肠球菌的发酵方法，其特征在于，所述氮源为胰蛋白胨。
6.根据权利要求1所述的屎肠球菌的发酵方法，其特征在于，步骤1中，所述氯化钠浓度为0.4g/100ml-0.5g/100ml。
7.根据权利要求1所述的屎肠球菌的发酵方法，其特征在于，步骤1中，所述ph值为7.0-9.0。
8.根据权利要求1-7任一项所述的屎肠球菌的发酵方法，其特征在于，步骤1中，所述温度为37℃。
技术总结