本发明属于代谢工程领域，涉及一种氨基双去甲氧基姜黄素高产菌株构建及其发酵优化方法；尤其涉及一种以对氨基肉桂酸为底物合成氨基双去甲氧基姜黄素的高产菌株构建方法以及发酵条件优化。
背景技术：
姜黄素类化合物是中药姜黄中具有药理作用的主要活性成分，根据其结构的不同，主要分为三种：姜黄素(curcumin，c21h20o6)、去甲氧基姜黄素(demethoxycurcumin，c20h18o5)以及双去甲氧基姜黄素(bisdemethoxycurcumin，c19h16o4)。姜黄素类化合物具有良好的抗炎、抗肿瘤、抗氧化以及抗心脑血管活性，另一方面姜黄素在食品工业中也被广泛用作于食品添加色素。因此该类化合物具有广阔的应用前景。
根据前期课题组的研究，一种氨基双去甲氧基姜黄素(nh2-bisdemethoxycurcumin，nbmc)具有更高于天然双去甲氧基姜黄素的抗炎能力。该化合物在此之前没有相关报道，因此不能使用天然的植物提取方法来获得。目前关于姜黄素类化合物的微生物发酵方法已逐渐成为该类化合物获取的主要研究对象，具有一定的研究基础。而氨基双去甲氧基姜黄素的获取，在一定程度上也为后续获得氨基姜黄素等其他衍生产物提供了可能。
本发明是以对氨基肉桂酸为底物，通过对合成途径进行模块划分及优化，使其获得较高的氨基双去甲氧基姜黄素的产量，并通过发酵条件的优化进一步提升了最终的产量，为后续的的大规模工业化生产提供了研究基础。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种氨基双去甲氧基姜黄素高产菌株构建及其发酵优化方法；本发明提供了一株高产氨基双去甲氧基姜黄素的大肠杆菌工程菌，并通过发酵条件的优化进一步提高菌株的产量，为其工业化生产奠定了基础。
本发明的目的是通过以下技术手段实现的。
第一方面，本发明提供一种以对氨基肉桂酸为底物合成氨基双去甲氧基姜黄素的大肠杆菌工程菌，在大肠杆菌mg1655(de3)中表达了合成途径中所需的关键酶：4-香豆酰辅酶a连接酶4cl、二聚酮合酶dcs、姜黄素合成酶curs3以及乙酰辅酶a羧化酶accbc和dtsr1。
编码所述4-香豆酰辅酶a连接酶4cl的核苷酸序列如seqidno.1所示，编码所述二聚酮合酶dcs的核苷酸序列如seqidno.2所示，编码所述姜黄素合成酶curs3的核苷酸序列如seqidno.3所示，编码所述乙酰辅酶a羧化酶accbc和dtsr1的核苷酸序列分别如seqidno.4和seqidno.5所示。
作为本发明的一个实施方案，通过同时使用3个载体对所述5条基因进行共表达。所述载体在以下4个拷贝数不同、抗性不同的载体中随机组合：prsfduet-1(拷贝数>100，kan)、petduet-1(拷贝数～40，amp)、pcdfduet-1(拷贝数20-40，spe)和pacycduet(拷贝数10-12，chl)。
作为本发明的一个实施方案，4-香豆酰辅酶a连接酶基因4cl单独在一个质粒上；二聚酮合酶基因dcs和姜黄素合成酶基因curs3在同一个质粒上；乙酰辅酶a羧化酶基因accbc和dtsr1在同一个质粒上。
作为本发明的一个实施方案，4-香豆酰辅酶a连接酶基因4cl单独在pcdfduet-1质粒或pacycduet质粒上。
第二方面，本发明提供了一种所述的大肠杆菌工程菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：
(1)对所述关键酶的5条基因进行大肠杆菌密码子优化并全合成；
(2)通过酶切酶连方法构建4cl表达质粒：pcdf-4cl和pacyc-4cl；
(3)通过酶切酶连方法构建dcs和curs3表达质粒：prsf-dcs-curs3、pet-dcs-curs3、pcdf-dcs-curs3和pacyc-dcs-curs3；
(4)通过酶切酶连方法构建accbc和dtsr1表达质粒：prsf-accbc-dtsr1、pet-accbc-dtsr1、pcdf-accbc-dtsr1和pacyc-accbc-dtsr1；
(5)分别取步骤(2)、(3)、(4)中的表达质粒，按不同抗性进行组合，各组合分别电转化入mg1655(de3)感受态细胞中；
(6)对应重组质粒的抗性，对长出的菌落进行筛选，并进一步利用pcr验证重组菌株的正确性。
作为本发明的一个实施方案，步骤(5)中，所述组合包括：pacyc-4cl、pet-dcs-curs3和pcdf-accbc-dtsr1的组合，pacyc-4cl、pet-dcs-curs3和prsf-accbc-dtsr1的组合，pcdf-4cl、pet-dcs-curs3和pacyc-accbc-dtsr1的组合，pcdf-4cl、pet-dcs-curs3和prsf-accbc-dtsr1的组合，pcdf-4cl、prsf-dcs-curs3和pacyc-accbc-dtsr1的组合，pcdf-4cl、prsf-dcs-curs3和pet-accbc-dtsr1的组合，pcdf-4cl、pacyc-dcs-curs3和pet-accbc-dtsr1的组合，pacyc-4cl、pcdf-dcs-curs3和pet-accbc-dtsr1的组合，pacyc-4cl、pcdf-dcs-curs3和prsf-accbc-dtsr1的组合，pacyc-4cl、prsf-dcs-curs3和pcdf-accbc-dtsr1的组合，以及pacyc-4cl、prsf-dcs-curs3和pet-accbc-dtsr1的组合。
作为本发明的一个实施方案，取pacyc-4cl、prsf-dcs-curs3和pcdf-accbc-dtsr1的组合电转化入mg1655(de3)感受态细胞中，获得重组菌株。
作为本发明的一个实施方案，所述方法还包括对构建得到的重组菌进行氨基双去甲氧基姜黄素的检测，筛选出产量最优的工程菌。
第三方面，本发明提供一种利用所述大肠杆菌工程菌发酵生产氨基双去甲氧基姜黄素的方法，将所述大肠杆菌工程菌接种到100mllb培养基中，在37℃、220rpm条件下培养至od600≈0.6时，加入终浓度0.5mm的iptg和0.5mm的对氨基肉桂酸，在25℃、220rpm条件下继续培养36h。
第五方面，本发明对构建得到的12株重组菌进行氨基双去甲氧基姜黄素的检测，筛选出产量最优的工程菌。该菌株为大肠埃希氏菌escherichiacolihxje109，保藏编号为cgmccno.20984。
第六方面，利用所述的产量最优工程菌，对其进行发酵条件优化，发酵生产氨基双去甲氧基姜黄素；具体步骤为：将上述工程菌接种到1llb培养基中，在37℃、220rpm条件下培养至od600≈0.6时，加入终浓度0.5mm的iptg，在25℃、220rpm条件下诱导5h。将菌液在5000rpm离心15min后，弃上清，将得到的菌体重悬至100ml含有0.5mm对氨基肉桂酸的新鲜lb培养基中，25℃继续培养48h。
本发明中的大肠埃希氏菌escherichiacolihxje109，已经于2020年11月2日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为cgmccno.20984。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明以大肠杆菌mg1655为出发菌株，利用合成生物学手段将利用对氨基肉桂酸表达氨基双去甲氧基姜黄素的异源途径构建在mg1655(de3)菌株体内，并对途径进行了模块划分，通过调控各个模块的拷贝数并进行随机组合优化，最终筛出产量较高的组合；
2)本发明再通过发酵条件的优化，使得获得的菌株在以对氨基肉桂酸为底物发酵48h时，氨基双去甲氧基姜黄素的产量达到33mg/l。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1：氨基双去甲氧基姜黄素合成路径的构建及模块划分示意图；
图2：模块化优化氨基双去甲氧基姜黄素产量；
图3：重组质粒示意图；
图4：重组菌株hxje109pcr验证琼脂糖凝胶电泳图；
图5：优化发酵条件前后氨基双去甲氧基姜黄素产量比较。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1、氨基双去甲氧基姜黄素合成路径的构建及模块划分
在姜黄素的生物合成途径中，二聚酮合酶dcs和姜黄素合成酶curs可以利用两分子的香豆酰辅酶a和一分子的丙二酰辅酶a为底物合成一分子的双去甲氧基姜黄素。本发明拟采用对氨基肉桂酸作为喂养底物，以期获得氨基双去甲氧基姜黄素。因此，本发明将整个生物合成路径规划成三个模块(图1)。模块ⅰ包含了来自拟南芥的4-香豆酰辅酶a连接酶基因4cl，该基因编码的4cl蛋白可将底物对氨基肉桂酸转化为氨基肉桂酰辅酶a。模块ⅱ包含来自姜黄的二聚酮合酶基因dcs和姜黄素合成酶基因curs3，该模块是姜黄素合成的核心模块。模块ⅲ包含了来自谷氨酸棒状杆菌的乙酰辅酶a羧化酶基因(包含两个基因，分别为accbc和dtsr1)，该酶可以将乙酰辅酶a转化为丙二酰辅酶a，以期提高胞内丙二酰辅酶a的含量。
在本发明的模块优化体系中，共选择了四个拷贝数不同的质粒，包括prsfduet(拷贝数>100，kan)、petduet(拷贝数～40，amp)、pcdfduet(拷贝数20-40，spe)和pacycduet(拷贝数10-12，chl)。每个质粒上分别包含两个多克隆位点，每个多克隆位点前均含有一个t7启动子。最终本发明通过改变各模块的质粒拷贝数来调节各模块之间的代谢平衡，并通过对目的产物的检测筛选出产量最高的组合模式。
本发明总共涉及11种组合方式，详见图2。通过对所产生的工程菌进行发酵验证及氨基双去甲氧基姜黄素产量检测，各菌株的产量见图2。最终得到了产量最高的模块组合：模块ⅰ在质粒pacycduet上，模块ⅱ在prsfduet上，模块ⅲ在pcdfduet上。
实施例2、模块工程菌的构建
将以上五条基因进行大肠杆菌密码子优化并全合成。模块ⅰ的构建：将4cl与经ndei和xhoi酶切处理过的pacycduet载体进行连接，构成质粒4cl-pacyc。模块ⅱ的构建：将dcs和curs3连接到经bamhi和hindiii，ndei和xhoi酶切处理过的prsfduet载体进行连接，得到质粒dcs-curs3-prsf。模块ⅲ的构建：参照模块ⅱ的构建，构建质粒accbc-dtsr1-pcdf。各质粒示意图详见图3。将这三个重组质粒共同电转入mg1655(de3)感受态中，并在含有50μg/ml壮观霉素、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml氯霉素的lb固体平板上进行筛选。将长出的单克隆进行pcr验证，以确保阳性克隆的正确性(图4)。将最终筛选得到的重组菌株命名为hxje109。
其中，lb固体培养基配方为：10g/ltryptone，5g/lyeastextract，5g/lnacl，15g/lagar。
大肠杆菌mg1655(de3)的获得方法参照文献nielsendr,yoonsh,yuancj,pratherkl.metabolicengineeringofacetoinandmeso-2,3-butanediolbiosynthesisine.coli.biotechnolj.2010mar；5(3):274-84.
实施例3、发酵产生氨基双去甲氧基姜黄素的方法
将实施例2中获得的重组菌株hxje109接种于lb液体培养基中，在37℃下过夜培养后，以1:100的接种比例接种于100ml新鲜lb液体培养基中。于37℃、220rpm条件下培养至od600≈0.6时，加入终浓度为0.5mm的iptg和0.5mm的对氨基肉桂酸，转至25℃、220rpm继续培养48h。取500μl发酵液，加入500μl甲醇，混合均匀后对菌体进行超声破碎。12000rpm离心5min，取上清进行hplc检测。使用4.6μm×250mm的agilenttcc18反相柱，以0.1％甲酸水为a相，纯甲醇为b相，流速1ml/min，按以下条件进行洗脱：0min，10％b；9min，100％b；15min，100％b。检测波长为450nm。最终计算得出重组菌hxje109中氨基双去甲氧基姜黄素的产量为3.07mg/l。
其中，lb液体培养基配方为：10g/ltryptone，5g/lyeastextract，5g/lnacl。
实施例4、发酵条件优化的方法
将实施例2中获得的重组菌株hxje109接种于lb液体培养基中，在37℃下过夜培养后，以1:100的接种比例接种于1l新鲜lb液体培养基中。于37℃、220rpm条件下培养至od600≈0.6时，加入终浓度为0.5mm的iptg，转至25℃、220rpm继续培养5h。5000rpm离心15min后，弃上清，将得到的菌体重悬至100ml新鲜lb液体培养基中，并加入终浓度为0.5mm的对氨基肉桂酸。在25℃、220rpm条件下继续培养48h后，取500μl发酵液，加入500μl甲醇，混合均匀后对菌体进行超声破碎。并按照实施例3中的检测方法对发酵液中氨基双去甲氧基姜黄素的含量进行测定，发现使用该种发酵方式，最终可以得到33.58mg/l的产量，相比优化前提升了10倍(图5)。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110>上海交通大学
<120>氨基双去甲氧基姜黄素高产菌株构建及其发酵优化方法
<130>kag45583
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1686
<212>dna
<213>拟南芥(arabidopisisthaliana)
<400>1
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<213>姜黄(curcumalonga)
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1.一种以对氨基肉桂酸为底物合成氨基双去甲氧基姜黄素的大肠杆菌工程菌，其特征在于，在大肠杆菌mg1655(de3)中表达了合成途径中所需的关键酶：4-香豆酰辅酶a连接酶4cl、二聚酮合酶dcs、姜黄素合成酶curs3以及乙酰辅酶a羧化酶accbc和dtsr1。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，编码所述4-香豆酰辅酶a连接酶4cl的核苷酸序列如seqidno.1所示，编码所述二聚酮合酶dcs的核苷酸序列如seqidno.2所示，编码所述姜黄素合成酶curs3的核苷酸序列如seqidno.3所示，编码所述乙酰辅酶a羧化酶accbc和dtsr1的核苷酸序列分别如seqidno.4和seqidno.5所示。
3.根据权利要求1和2所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，同时使用3个载体对所述5条基因进行共表达；所述载体在以下4个拷贝数不同、抗性不同的载体中随机组合：prsfduet-1(拷贝数>100，kan)、petduet-1(拷贝数～40，amp)、pcdfduet-1(拷贝数20-40，spe)和pacycduet(拷贝数10-12，chl)。
4.根据权利要求3所述大肠杆菌工程菌，其特征在于，4-香豆酰辅酶a连接酶基因4cl单独在一个质粒上；二聚酮合酶基因dcs和姜黄素合成酶基因curs3在同一个质粒上；乙酰辅酶a羧化酶基因accbc和dtsr1在同一个质粒上。
5.根据权利要求4所述大肠杆菌工程菌，其特征在于，4-香豆酰辅酶a连接酶基因4cl单独在pcdfduet-1质粒或pacycduet质粒上。
6.一种如权利要求1-5中任一项所述的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)对所述关键酶的5条基因进行大肠杆菌密码子优化并全合成；
(2)通过酶切酶连方法构建4cl表达质粒：pcdf-4cl和pacyc-4cl；
(3)通过酶切酶连方法构建dcs和curs3表达质粒：prsf-dcs-curs3、pet-dcs-curs3、pcdf-dcs-curs3和pacyc-dcs-curs3；
(4)通过酶切酶连方法构建accbc和dtsr1表达质粒：prsf-accbc-dtsr1、pet-accbc-dtsr1、pcdf-accbc-dtsr1和pacyc-accbc-dtsr1；
(5)分别取步骤(2)、(3)、(4)中的表达质粒，按不同抗性进行组合，各组合分别电转化入mg1655(de3)感受态细胞中；
(6)对应重组质粒的抗性，对长出的菌落进行筛选，并进一步利用pcr验证重组菌株的正确性。
7.根据权利要求6所述的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述组合包括：pacyc-4cl、pet-dcs-curs3和pcdf-accbc-dtsr1的组合，pacyc-4cl、pet-dcs-curs3和prsf-accbc-dtsr1的组合，pcdf-4cl、pet-dcs-curs3和pacyc-accbc-dtsr1的组合，pcdf-4cl、pet-dcs-curs3和prsf-accbc-dtsr1的组合，pcdf-4cl、prsf-dcs-curs3和pacyc-accbc-dtsr1的组合，pcdf-4cl、prsf-dcs-curs3和pet-accbc-dtsr1的组合，pcdf-4cl、pacyc-dcs-curs3和pet-accbc-dtsr1的组合，pacyc-4cl、pcdf-dcs-curs3和pet-accbc-dtsr1的组合，pacyc-4cl、pcdf-dcs-curs3和prsf-accbc-dtsr1的组合，pacyc-4cl、prsf-dcs-curs3和pcdf-accbc-dtsr1的组合，以及pacyc-4cl、prsf-dcs-curs3和pet-accbc-dtsr1的组合。
8.一种利用如权利要求1-5中任一项所述的大肠杆菌工程菌发酵生产氨基双去甲氧基姜黄素的方法，其特征在于，将所述大肠杆菌工程菌接种到含有100mllb培养基的500ml平底三角摇瓶中，在37℃、220rpm条件下培养至od600≈0.6时，加入终浓度0.5mm的iptg和0.5mm的对氨基肉桂酸，在25℃、220rpm条件下继续培养36h。
9.一株大肠埃希氏菌escherichiacolihxje109，保藏编号为cgmccno.20984。
10.一种利用如权利要求9所述的大肠杆菌工程菌发酵生产氨基双去甲氧基姜黄素的方法，其特征在于，将所述大肠杆菌工程菌接种到1llb培养基中，在37℃、220rpm条件下培养至od600≈0.6时，加入终浓度0.5mm的iptg，在25℃、220rpm条件下诱导5h；将菌液在5000rpm离心15min后，弃上清，将得到的菌体重悬至100ml含有0.5mm对氨基肉桂酸的新鲜lb培养基中，25℃继续培养48h。
技术总结