本发明涉及微生物医药领域，具体涉及一种含有荧光素酶基因的质粒和稳定表达荧光素酶的耐万古霉素的肠球菌(vancomycin-resistantenterococcus，vre)的构建方法，该方法构建获得的菌株，以及该菌株在筛选杀菌方法或者筛选药物以及制备感染动物模型等方面的用途。
背景技术：
：在人类的病原体中，粪肠球菌(e.faecalis)是婴儿胃肠道主要的革兰氏阳性菌，并长期定植于成年人的胃肠道中。粪肠球菌是核心微生物群的主要成员之一，可在免疫功能低下的宿主或具有潜在健康状况的宿主中引起机会性疾病。随着抗生素的广泛应用，多重耐药性肠球菌(multidrugresistant，mdr)已成为导致院内感染的重要原因。根据美国疾病控制和预防中心在2019年发布的《抗生素耐药威胁报告(2019年)》，耐万古霉素的肠球菌(vancomycin-resistantenterococcus，vre)被列为严重抗生素耐药威胁之一。粪肠球菌中，vre可达三分之一，当感染vre时，患者的病死率可达到10％。临床上，vre感染主要用采用单一或联合抗生素进行治疗。据报道，替加环素在复杂的腹腔内或皮肤/软组织感染中对某些vre具有灭菌作用。此外，美国传染病学会(idsa)在2009年发布的指南特别建议使用利奈唑胺和喹奴普汀/达福普汀治疗vre感染。然而，有研究发现，尽管达到抗生素停药的条件，vre在胃肠道定植后，仍可以高密度持续数月。最近，许多研究报道vre可通过粪便移植被有效清除，但细菌清除的机制尚不清楚。因此迫切需要对vre定植和治疗的机制进行分析，从而需要构建体外和体内研究的模型。生物发光是生物体内在酶的作用下发光的现象。生物发光现象广泛存在细菌、昆虫等生物体中。利用萤光素酶基因(luciferasgenecassette，lux)基因标记细胞的生物发光技术具有操作简便、结果直观、不依赖底物、对机体损伤小等优点。该技术已广泛应用于肿瘤生长监测和转移示踪、基因治疗、目标基因表达的检测等多个领域。技术实现要素：本发明构建包含萤光素酶基因luxa/b/c/d/e基因簇的质粒，该质粒可以在大肠杆菌中完成构建过程，其启动子能够被vre识别。通过电转化，将该质粒转化至vre中，筛选表达荧光素酶的vre，并将其应用于选择合适的杀菌方法或药物以及制备感染动物模型等方面。因此，本发明提供一种质粒，所述质粒包括荧光素酶基因簇luxa/b/c/d/e，该质粒能够在vre中启动luxa/b/c/d/e基因的表达，质粒为可用于革兰氏阳性菌的质粒。优选的，所述质粒包括能在革兰氏阳性菌表达的氯霉素耐药基因，可用于转化成功菌株的筛选。更优选的，起始质粒为pnz8148，该质粒能在革兰氏阳性菌中复制并表达基因。本发明还提供一种基因修饰的耐万古霉素的肠球菌(vancomycin-resistantenterococcus，vre)，所述vre能稳定表达荧光素酶。本发明还提供一种上述基因修饰的vre的构建方法，所述构建方法包括：(1)制备上述包含luxa/b/c/d/e基因簇的质粒。(2)制备电转化感受态vre；(3)将步骤(1)获得的包含luxa/b/c/d/e基因簇的质粒电转化感受态vre，挑选阳性菌落。优选的，所述步骤(1)包括：(a)通过pcr从pbav1k-t5-lux质粒中扩增5kbluxa/b/c/d/e基因片段，通过限制性内切核酸酶将pnz8148线性化，然后，使用hifidna组装酶混合物将luxa/b/c/d/e克隆到线性化的pnz8148中，以生成pnz8148-lux。(b)将质粒电转化至大肠杆菌感受态细胞；(c)筛选氯霉素阳性大肠杆菌；(d)从阳性大肠杆菌中提取pnz8148-lux质粒。步骤(a)luxa/b/c/d/e基因簇扩增时采用高保真酶，其退火温度低于推荐温度1-3℃。本发明还提供一种上述基因修饰的vre在筛选杀菌方法中的应用。本发明还提供一种上述基因修饰的vre在筛选药物中的应用。本发明还提供一种上述基因修饰的vre在制备动物模型中的应用。所述动物模型可以是细菌定位研究模型、抗生素杀菌效果验证模型等。本发明还提供一种杀菌方法的评估方法，所述评估方法包括利用上述基因修饰的vre对杀菌方法进行评估。本发明还提供一种药物筛选方法，所述药物筛选方法包括利用上述基因修饰的vre对药物，例如抗生素进行筛选，以寻找对vre敏感、有效的抗生素。所述评估方法可以是体内或者体外的评估方法。所述评估方法不是治疗方法。该评估方法用来评估候选杀菌方法，对候选杀菌方法的杀菌效果进行检测和比较，以确定哪些杀菌方法可以作为杀灭vre，哪些不能，或者，比较不同杀菌方法的杀菌程度，即杀菌效果不是必然的，只是一种可能性。本发明还提供一种动物模型的制备方法，所述制备方法包括将上述基因修饰的vre注入动物体内。所述动物模型可以是造烧伤模型、手术模型、感染模型等。所述体内注入方式可以是鼻饲、灌胃、腹腔注射、尾静脉注射等。所述菌株在动物体内富集浓度不低于108cfu/ml。本发明还提供一种vre的杀菌方法，所述杀菌方法包括利用紫外照射或者84消毒液对携带vre的物品进行杀菌。所述携带vre的物品包括医疗器械，医疗材料等医疗物品，例如手术床，手术器械，医用床，医用床单等等，或者携带vre的食品或土壤等等。所述杀菌方法包括紫外照射30min以上，或者以10％的84消毒液对物品进行消毒。本发明的良好技术效果包括：1、本发明使用电转化方法制备感受态细胞，操作简便易得，而且转化效率高，转化后细菌稳定表达荧光素酶概率接近100％。pnz8148质粒at含量较高，使用限制酶切方法得到线性质粒方法效率更高。更为优选的，luxa/b/c/d/e基因簇扩增时采用高保真酶，其退火温度低于推荐温度1-3℃时，扩增效率最高。使用gibson连接方法，可提高连接效率。2、首次利用电转化方法将含荧光素酶的质粒转化至vre，从而获得生物发光的vre，能更加方便的观察vre的各种性能，包括生长，体内分布等。3、利用表达萤光素酶的vre可以便捷，快速、直观的筛选合适的药物，例如各种抗生素，为患者快速找到合适的抗生素或者其他治疗药物，可以帮助患者早日康复。4、利用表达萤光素酶的vre筛选到适合的杀菌方法，如紫外线和84消毒液等，可以有效的对医疗物品进行杀菌，防止院内感染；5、可视化观察不同的理化措施对于vre的杀菌效果，对临床合理进行环境杀菌，为采取接触预防、患者隔离、环境清洁等更多干预措施提供依据，对于预防控制院内感染具有重要的意义；6、可视化追踪vre在实验动物体内的分布情况，对于优化抗菌药物使用方案，具有重要的指导意义。以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。附图说明图1：pnz8148-luxa/b/c/d/e质粒构建策略图，其中1a为pnz8148-luxa/b/c/d/e质粒构建示意图。1b为筛选出将pnz8148-luxa/b/c/d/e质粒成功转化到大肠杆菌的示意图。图1c为筛选成功将pnz8148-luxa/b/c/d/e质粒转化至vre的示意图。图2：v583和v583-lux的荧光强度。图3：不同浓度的v583表达荧光素酶的luminescence荧光强度。图4：不同稀释浓度的v583在动物成像仪中荧光强度的检测图5：不同处理方式对稳定表达荧光素酶的v583杀菌效果的验证图6：不同抗生素的杀菌效果评估，其中从左至右依次为对照组h2o，van,tig,line,tig van,van line,tig line,van tig line。图7：pnz8148-luxa/b/c/d/e用于制备感染动物模型。具体实施方式下面通过制备例和实验例对本发明进行详细说明，以使本发明的特征和优点更清楚。但应该指出，制备和检测实验例用于理解本发明的构思，本发明的范围并不仅仅局限于本文中所列出的制备例和实验例。下述制备例和实验例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。1、试验材料：大肠杆菌mc1061、质粒小提试剂盒购于天根生化科技有限公司。胶回收试剂盒购于德国qiagen公司。高保真dna聚合酶q5、高保真dna连接酶、psti/spel限制性内切酶均购于美国neb公司。2、检测仪器：veritas微孔板光度计(turnerbiosystems)、nanodroptmone超微量紫外分光光度计(thermo)、ivisluminalt小动物活体成像仪(珀金埃尔默)。3、v583收集与准备v583(美国第一个分离出的vre)经全自动微生物分析仪(美国bd)进行细菌鉴定和药敏试验，鉴定为氯霉素敏感的v583(药敏结果的判断参照美国临床实验室标准化研究所的推荐标准)。4、统计学分析：利用graphpadprism7.’l0软件进行统计分析，采用kolmogorov-simrnov对荧光值数据进行正态性检验。表达荧光素酶的v583荧光信号检测数据为偏态分布，荧光值用中位数表示，两组间采用wilcoxon秩和检验。不同浓达荧光素酶的v583光信号检测数据为偏态分布，荧光值用均值表示，采用onewayanova检验。以p＜0.05为差异有统计学意义。实施例1含有荧光素酶基因的质粒构建1.luxa/b/c/d/e基因簇扩增：(1)、设计lux基因簇的引物对luxf：cactcaccatgggtactgcagattcaattgtgagcggataac(seqidno.1)；luxr：aaagcttgagctctctagaattaactatcaaacgcttcgg(seqidno.2)。(2)、luxa/b/c/d/e基因簇pcr扩增表1：luxa/b/c/d/e基因簇扩增pcr反应体系配置好上述反应体系后进行pcr反应，pcr程序设置如表2：表2：pcr程序设置程序进行至4℃时，取出反应产物，关闭pcr仪后进行后续pcr产物鉴定。同时，经梯度pcr检测发现，其退火温度低于推荐温度1-3℃时(例如59-61℃)，扩增效率最高，确定使用60℃退火。(3)、琼脂糖凝胶电泳：1)配制适当浓度(1.5％)琼脂糖凝胶：称取1.5g琼脂糖(genestar)称重后溶至100mltae中，微波炉加热至琼脂糖完全溶解，溶液澄清透明。冷却40-50℃，加入10μl核酸染料(genestar)。混匀后倾倒至组装好的胶槽内，室温静置30分钟。2)组装电泳装置后上样：胶孔中加入dnaladder(genestar)及pcr产物(如有需要，加入0.66μl10×loadingbuffer)各6μl，恒压120v电泳10分钟。紫外凝胶成像仪下观查pcr条带是否阳性，并将阳性条带位置与dnaladder比对，条带分子量与目标dna(5000bp左右)一致，鉴定为阳性。(4)、pcr产物测序并分析：pcr产物凝胶回收：收集正确大小的dna：用洁净刀片在紫外灯下切取目的dna片段后称重，将切取的凝胶收集至1.5ml离心管。利用dna凝胶回收与纯化试剂盒。按100μg凝胶加入300μl溶胶缓冲液，50℃震荡孵育，观察胶完全融化后加入异丙醇(每100μg凝胶加入100μl异丙醇)。将600μl上述液体转移至离心柱内，12000rpm离心1分钟，弃套管内废液，再将离心柱插入套管内，若液体有剩余，则将剩余液体加入同一离心柱内重复此步骤。离心柱内加500μl清洗液，12000rpm离心1分钟，弃套管内废液。小心取出离心柱，插入新的离心管，12000rpm离心1分钟后打开盖子，室温静置两分钟去除残留的异丙醇h2o。将离心柱置入一个新的1.5ml离心管内，并加入50μl无核酸酶水，室温放置2分钟后12000rpm离心1分钟，收集回收的dna。将回收的dna标记后送往测序公司(华大基因)进行一代测序。测序结果与pbav1k-t5-lux质粒进行对比分析，测序结果表明扩增的片段为lux基因基团，进行后续实验。2.pnz8148mcs-1双酶切：pnz8148是大小为4707bp的革兰氏阳性菌质粒，该质粒带有氯霉素耐药基因(chloramphenicolresistancegene，cmr)、pnz8148复制起始位点(pnz8148ori)、pnz8148(pnz8148rep)调节因子。该质粒的3321/3281bp处具有psti和spei限制性内切酶的单一酶切位点，采用psti/spei酶切的方法获得线性化的pnz8148质粒。其示意图如图1a所示。pnz8148质粒psti/spei酶切体系如表3所示。表3：pnz8148mcs-1质粒psti/spei酶切体系3.将上述酶切片段胶回收后与扩增的luxa/b/c/d/e基因簇使用gibson连接方法连接：将上述两个线性化片段经鉴定和凝胶回收后，使用2×nebuilderhifidnaassembly连接酶连接，连接成功的环状质粒产物命名为pnz8148-lux，示意图如图1b。pnz8148mcs-1psti/spei酶切位点连接luxa/b/c/d/e基因簇体系如表4：表4：pnz8148mcs-1psti/spei酶切位点连接luxa/b/c/d/e基因簇体系(20μl)4.产物转化至大肠杆菌感受态细胞：连接后产物电转化至大肠杆菌mc1061感受态细胞，阳性细菌筛选后，扩增细菌，提取质粒并进行一代测序鉴定，鉴定测序正确后的质粒命名为pnz8148-lux。含有pnz8148-lux的大肠杆菌收集并保存至-70℃冰箱。实施例2含有荧光素酶的v583荧光素基因表达和荧光稳定性检测。1.v583电转化感受态制备挑取v583单个菌落接种于液体bhi培养基，37℃静置培养过夜。取过夜培养的v583菌液以1:10的比例接种于新鲜的bhi培养基中，37℃静置培养至od600＝0.3～0.4。取出对数期菌液，冰浴30min后，4℃，4000rcf离心收集菌体，菌体分别用预冷的无菌双蒸水和预冷的1％蔗糖溶液洗涤两后，即为v583感受态细胞。2.pnz8148-lux质粒电转化：分别取5μlpnz8148-lux质粒加入到100μlv583感受态细胞中，混匀后冰浴10分钟。将上述混合物转移至预冷的0.1cm电击杯(美国伯乐)中，在电场强度：22.5kv/mm；电阻：200ω；电容：25μf进行电转化。电击结束后，立即向电击杯中加入950μl，37℃预热的bhi培养基，于37℃静置培养1h后涂布于含25μg/ml氯霉素的哥伦比亚血平板培养基。37℃培养24h，挑取阳性菌落进行鉴定。通过酶标仪确认成功的转化，并在promegaglomax光度计上读取阳性菌株的相对光单位(rlu)。转入pnz8148-lux质粒的菌株的rlu为8242(6900，9387)，明显高于v583菌株107.5(96，127.8)(参见图2)。荧光素酶阳性菌株命名为v583-lux。转化后细菌稳定表达荧光素酶概率接近100％，而利用其他质粒，例如pbbr1不能成功的在v583中表达荧光素酶。实施例3：不同浓度表达荧光素酶的v583荧光素酶强度检测挑取表达荧光素酶的v583单菌落菌株，37℃培养4小时后，使用nanodroptmone超微量紫外分光光度计检测细菌od值。通过稀释方法，调整菌株的浓度直od600＝1。将所得od600＝1的菌株按照1：2稀释9个梯度，在酶标仪上检测luminesence值，结果如图3所示，luminesence值随菌落浓度降低而降低，其降低趋势符合对数方式降低形式。当菌株od值为0.125-1之间(细菌处于对数生长期)时，luminesence值随菌落浓度降低而降低，其降低趋势符合线性降低形式。当菌株浓度为9.75ⅹ107cfu/ml其荧光强度为105.实施例4：不同稀释浓度的v583在动物成像仪中荧光强度的检测将倍比稀释的菌液置于96孔板中检测荧光，当菌株浓度低于6.25×107cfu/ml时，如图4所示，其荧光在小动物成像仪中不能被检测到，因此建议所述菌株在动物体内富集浓度不低于108cfu/ml。依据上述结果，以及小动物成像仪中检测到荧光的最低值，可以计算出制备动物感染模型时，接种细菌的最适浓度。实施例5：不同处理方式对稳定表达荧光素酶的v583杀菌效果的验证采用了不同物理化学方法处理。物理方法：用接种环(1μl)对稳定表达荧光素酶的v583进行三区划线，37℃敷箱中培养2h，紫外照射30min。化学方法：使用酒精(75％)、84消毒液(10％)分别浸泡细菌接种环(1ul)30min，分别挑取1μl稳定表达荧光素酶的v583进行三区划线。上述处理后的稳定表达荧光素酶的v583平板37℃培养8h后，使用小动物成像仪观察稳定表达荧光素酶的v583荧光。结果如图5所示，紫外线可以完全杀灭v583，84消毒液也有一定的消毒作用。实施例6：稳定表达荧光素酶的v583用于筛选抗生素我们设计了不同抗生素杀菌方案。首先模拟感染环境的酸碱度、氧气含量，是否含有细胞因子等，可以模拟痰液、血液、尿液、粪便等环境。检测不同的抗生素浓度在特定的对于该菌的杀菌作用。优选不同抗生素使用浓度。对于多重耐药菌，我们依据临床上的耐药菌治疗方案，选择特定条件下联合使用抗生素时不同的抗生素比例。由于可以使用酶标仪检测v583-lux的浓度，因此它可以为快速检测抗生素的作用提供方便的工具。我们测试了不同抗生素的功能杀菌作用。将万古霉素(van)，利奈唑胺(line)，替加环素(tig)以及其混合物以最终浓度25ug/ml添加到生长的v583-lux中。然后将v583-lux在37℃的条件下培养3小时，用酶标仪检测rlu。结果显示3小时时v583lux对万古霉素的耐药性和对其他两种抗生素的敏感性(参见图6和表5)。表5：不同抗生素的杀菌效果评估v583-luxvantiglinetig vantig linevan tig lineod600nm(mean)1.7401.5330.2430.3300.3970.2900.287od600nm(sd)0.0500.0610.0310.0260.0350.0440.025rlu(mean)5574.6674361.000265.333305.000350.000353.000380.333rlu(sd)239.195285.79515.14423.30214.17714.1775.859如表中数据所示，vre对万古霉素具有耐药性，而替加环素和利奈唑胺以及抗生素组合可以有效杀灭vre。我们还检测了培养3小时v583-lux的od600和经抗生素处理的细菌的绝对计数，作为对照以确定荧光强度是否可以代表抗生素的杀菌作用。结果表明三种计算方法在检测不同抗生素杀菌效果中的趋势一致。实施例6：pnz8148-luxa/b/c/d/e用于制备感染动物模型依据实例中推荐的建立动物感染模型的浓度，将v583稀释成相应的浓度。通过腹腔注射等方式感染模型动物。在小动物成像仪上观察细菌播散路径或定植位置。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。序列表<110>首都医科大学附属北京地坛医院<120>一种表达荧光素酶的vre及其用途<130>1<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cactcaccatgggtactgcagattcaattgtgagcggataac42<210>2<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2aaagcttgagctctctagaattaactatcaaacgcttcgg40当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种质粒，其特征在于，所述质粒包括荧光素酶基因簇luxa/b/c/d/e，该质粒能够在耐万古霉素的肠球菌(vancomycin-resistantenterococcus，vre)中启动luxa/b/c/d/e基因的表达，所述质粒为可用于革兰氏阳性菌的质粒。
2.一种基因修饰的耐万古霉素的肠球菌(vancomycin-resistantenterococcus，vre)，其特征在于，所述基因修饰的vre能稳定表达荧光素酶。
3.一种基因修饰的vre的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
(1)制备包含luxa/b/c/d/e基因簇的质粒；
(2)制备电转化感受态vre；
(3)将步骤(1)获得的包含luxa/b/c/d/e基因簇的质粒电转化感受态vre，挑选阳性菌落。
4.一种权利要求2所述基因修饰的vre的应用，其特征在于，所述应用包括在筛选杀菌方法中的应用，在筛选药物中的应用，或者，在制备动物模型中的应用。
5.一种计算细菌浓度的评估方法，其特征在于，所述评估方法包括绘制不同浓度权利要求2所述的基因修饰的vre的荧光值的标准曲线，并通过检测荧光值计算vre的浓度。
6.一种杀菌方法的评估方法，其特征在于，所述评估方法包括利用权利要求2所述基因修饰的vre对杀菌方法进行评估。
7.一种药物筛选方法，其特征在于，所述药物筛选方法包括利用权利要求2所述基因修饰的vre对药物进行筛选。
8.一种动物模型的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将权利要求2所述基因修饰的vre通过鼻饲、灌胃、腹腔注射、尾静脉注射等方法注入动物体内。
9.一种vre的杀菌方法，其特征在于，所述杀菌方法包括利用紫外照射或者84消毒液对携带vre的物品进行杀菌。
10.如权利要求9所述的杀菌方法，其特征在于，所述杀菌方法包括紫外照射30min以上，或者以10％的84消毒液对物品进行消毒。
技术总结本发明涉及一种基因修饰的自发荧光的耐万古霉素肠球菌(Vancomycin‑Resistant Enterococcus,VRE)及其应用。本发明利用质粒构建和电转化技术，构建了能够在肠球菌中表达的含有荧光素酶基因簇(luciferase gene cassette,lux)的质粒，该质粒经电转化导入VRE，经自发荧光鉴定与培养特性的观察,最终获得了可稳定表达荧光素酶的VRE，该VRE能够在体内和体外检测。本发明为研究VRE相关疾病进展，筛选合适的杀菌方法、抗生素等提供重要的可视化研究工具。
技术研发人员：滑明溪;王宇光;陈晨;段昂;袁临天;曾辉;李昂
受保护的技术使用者：首都医科大学附属北京地坛医院
技术研发日：2020.12.07
技术公布日：2021.03.12
