一种减毒鰤鱼诺卡氏菌及其构建方法和应用与流程

专利2022-07-08 108

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种减毒鰤鱼诺卡氏菌及其构建方法和应用。

背景技术：

近年来鱼类诺卡氏菌病已经成为水产养殖业中的严重病害，当水产动物体质虚弱、免疫力低下时，病原菌可通过鳃、饲料或者伤口等进行感染。病鱼表现为腹部膨大，内脏器官常弥漫性分布有致密肉芽肿，该病的感染率和死亡率都比较高，目前尚缺乏有效的防治措施，给水产养殖行业带来巨大损失。近年来鰤鱼诺卡氏菌(nocardiaseriolae)已成为鱼类诺卡氏菌病的主要病原，超过39种海淡水养殖鱼种深受其害。

相关研究表明，导致鱼类诺卡氏菌病的主要病原菌是鰤鱼诺卡氏菌。鰤鱼诺卡氏菌在分类上属于细菌域(bacteria)、厚壁菌门(firmicutes)、放线菌纲(actinobacteria)、放线菌目(actinobacterales)、诺卡氏菌科(nocardiaceae)、诺卡氏菌属(nocardia)。鰤鱼诺卡氏菌生长缓慢，该菌在平板上生长呈现黄色砂粒或颗粒状凸起，表面形成褶皱。液体培养条件下，细菌容易聚集形成大颗粒。目前关于鰤鱼诺卡氏菌防治手段，仍然是以预防为主。细菌的减毒株作为一种活性细菌，在保持原有免疫原性的基础上，又不会对宿主造成危害，因此减毒株备受关注。然而在鰤鱼诺卡氏菌中，已有相关研究在探索减毒株的构建。但是相关的减毒株的保护效果依然不够理想，缺乏免疫原性。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种减毒鰤鱼诺卡氏菌及其构建方法和应用，使构建的鰤鱼诺卡氏菌具有较低致病性外仍保留了较好的免疫原性，作为候选株在制备疫苗或其他生物制品中的应用。

本发明提供了一种减毒鰤鱼诺卡氏菌，所述减毒鰤鱼诺卡氏菌缺失gluns基因。

优选的，所述gluns基因编码的蛋白质的氨基酸如seqidno:12所示或与seqidno:12同源性或覆盖度达到30％～99％的序列。

优选的，所述减毒鰤鱼诺卡氏菌的保藏编号为gdmccno:61258。

本发明提供了所述减毒鰤鱼诺卡氏菌的构建方法，包括以下步骤：

1)将gluns基因的重组同源臂插入载体中构建重组载体；

2)将所述重组载体转化入鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞中，得到重组细胞；

3)将所述重组细胞经培养，筛选，得到减毒鰤鱼诺卡氏菌。

优选的，步骤1)中所述gluns基因的重组同源臂由gluns基因上游片段和下游片段组成。

优选的，步骤1)中所述gluns基因的重组同源臂的核苷酸序列如seqidno:1所示。

优选的，步骤1)中所述载体包括pre112；

所述gluns基因的重组同源臂插入pre112的多克隆位点为saci/kpni。

优选的，步骤3)中所述培养用溶液为26～30℃预热的含0.3mm蔗糖的bhi溶液，所述培养的温度为26～30℃，所述培养的时间10～12h。

优选的，所述筛选后，还包括鉴定减毒鰤鱼诺卡氏菌；

所述鉴定包括采用pcr扩增方法进行；

所述pcr扩增用引物对为112-f1/112-r1；

所述112-f1的核苷酸序列如seqidno:2所示；

所述112-r1的核苷酸序列如seqidno:3所示。

本发明提供了所述的减毒鰤鱼诺卡氏菌在制备疫苗或包含所述减毒鰤鱼诺卡氏菌的相关生物制品中的应用。

本发明提供的减毒鰤鱼诺卡氏菌，通过基因工程手段，将野生型鰤鱼诺卡氏菌中谷氨酸内肽酶(gluns)基因敲除，构建一株对宿主具有较好保护性的减毒株，该减毒株既能有效降低细菌的致病性，又保留了较好的免疫原性。实验表明，野生株的半致死浓度为4.74×10⁵cfu/ml，所述减毒株的半致死浓度为3.41×10⁶cfu/ml，其半致死浓度相较野生株降低了1个数量级，表明了该菌株毒力发生显著下降。活菌攻毒实验结果表明，所述减毒株的相对免疫保护率达到93.38％，说明所述减毒株是一株对宿主具有较好保护性的减毒株(菌株保藏编号为gdmccno:61258)。

同时，本发明构建的减毒鰤鱼诺卡氏菌还具有较高的遗传稳定性。实验表明，gluns缺失株鰤鱼诺卡氏菌zj0503-6296连续传至30代，无法检测出gluns基因片段，表明gluns缺失株能稳定遗传。

附图说明

图1为pre112质粒图谱；

图2为本发明构建后的重组质粒图谱；

图3为gluns基因缺失株鰤鱼诺卡氏菌zj0503-6296的第一次筛选得到的电泳图；m:dnamarker2000，1，2：实验组，3：zj0503，4：pre112；

图4为gluns基因缺失株鰤鱼诺卡氏菌zj0503-6296的第二次筛选得到的电泳图；m:dnamarker2000，1：鰤鱼诺卡氏菌zj0503-6296，2：zj0503；

图5为gluns基因缺失株鰤鱼诺卡氏菌zj0503-6296的稳定遗传验证；m:dnamarker10000，1：鰤鱼诺卡氏菌zj0503-6296，2-4：zj0503；

图6为敲除质粒pre112-δgluns构建方法示意图；

图7为gluns基因缺失株鰤鱼诺卡氏菌zj0503-6296的构建原理。

生物材料保藏信息

鰤鱼诺卡氏菌(nocardiasp.)zj0503-6296，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，单位简称gdmcc，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏时间2020年10月29日，保藏编号为gdmccno：61258。

具体实施方式

本发明提供了一种减毒鰤鱼诺卡氏菌，所述减毒鰤鱼诺卡氏菌缺失gluns基因。

本发明对gluns基因的序列没有特殊限制，凡缺失本领域所熟知的gluns基因的全部核苷酸序列(seqidno:13，gtgctcgtcgccggacccctggcggcgagcgcacacgcggaacccgcgacccccgatctgcccgcccagctgatcgcggccatcacccgcgacctcaagatctccccgcaggactacctggcccgggccgacaccgcacagaaggtggccaccttcgccaccaccgcgcagcggcagttcccgcaggtcttcggcggcgcctggctggacgagaccggcaaggccgtcgtggcgctggccccgggcgagggcgtggacaaggcccgcaaggccgtgcaggacgccggtttcaccgccaaggacgtgagcaagagcgagaccacgctgcgcggcgagaagaacgccttccagcagtggctcaaggatcagcccgagtccgtggcgaaggccatccggggcgtggccatcgacaccttgaacaacagcatcgcggtgcgggtggacaagcccgatctgccgctgccgggcttcgtggacccggcccgcgtcatcgtcatgaccgcaccgccggtcggcggcgagggccagaacgtgccgcaggccaccgagatcgcgggcgcgggcccgcgcgccatcgccgccggcgaggcctacgcctcggtcgccggccgcatgtcgctgcgctgctcgctcggcttcaacggcaccgacggcaacggcaatgtcgtcaatatcaccgcgggccactgcaacccgaacatcgcggccaccggcggcgcgaactcgccgagcgtgtaccagctcatcggtgacagccgcggtcccgaggtcggccagttccagaagtcggtgctgggcaacgaggactactcgatcgtcggcatcaacgaccagttccgcgacgccttctccaacccgttcgtaaccgtcccgggctcggcctcgatcgccgtcaccggcgtggccgtgccggtggtcggcgcgccggtctgcaagtcgggtgcgcgcaccggcttcagctgcggcgtggtgaacgccgtggaccagaccgtccaggtcggcgaccgcctgctgacccagtccttctccgccaatatctgtgccctgcccggtgattcgggtggcccgctggtgaccggcacgctggccctgggcatcgccagcgcatcctcggtcgccgactacccgatctgcgagatcccgaacctgctcggcctgatcaccggcaacaccccgcagctgttcgcgcagccggtgagcaccgtgctctccgacaacccggggctgcgggtccgcaccacgtaa)或部分核苷酸序列(orf6296)均能实现减毒目的，因此，本发明对缺失全部或部分gluns基因的核苷酸序列和编码的氨基酸序列均在本发明保护的范围之内。

在本发明中，所述gluns基因编码的蛋白质的氨基酸优选如seqidno:12所示(vlvagplaasahaepatpdlpaqliaaitrdlkispqdylaradtaqkvatfattaqrqfpqvfggawldetgkavvalapgegvdkarkavqdagftakdvsksettlrgeknafqqwlkdqpesvakairgvaidtlnnsiavrvdkpdlplpgfvdparvivmtappvggegqnvpqateiagagpraiaageayasvagrmslrcslgfngtdgngnvvnitaghcnpniaatgganspsvyqligdsrgpevgqfqksvlgnedysivgindqfrdafsnpfvtvpgsasiavtgvavpvvgapvcksgartgfscgvvnavdqtvqvgdrlltqsfsanicalpgdsggplvtgtlalgiasassvadypiceipnllglitgntpqlfaqpvstvlsdnpglrvrtt)。本发明缺失的gluns基因还包括与seqidno:12同源性或覆盖度达到30％～99％的序列。所述减毒鰤鱼诺卡氏菌的保藏编号优选为gdmccno:61258。

本发明还提供了所述减毒鰤鱼诺卡氏菌的构建方法，包括以下步骤：

1)将gluns基因的重组同源臂插入载体中构建重组载体；

2)将所述重组载体转化入鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞中，得到重组细胞；

3)将所述重组细胞经培养，筛选，得到减毒鰤鱼诺卡氏菌。

本发明提供了所述减毒鰤鱼诺卡氏菌构建方法，构建原理为克隆目的基因上下游约500bp片段作为同源臂，通过重叠pcr方法将同源臂连接在一起，构建到缺失载体pre112上。将缺失载体导入到鰤鱼诺卡氏菌中，利用同源重组的方法，将缺失载体上重组同源臂片段替换细菌中含有同源臂和目的基因片段，使得鰤鱼诺卡氏菌中目的基因缺失，只含有重组同源臂片段，以此构成减毒鰤鱼诺卡氏菌(见图7)。

本发明将gluns基因的重组同源臂插入载体中构建重组载体。

在本发明中，所述gluns基因的重组同源臂优选由gluns基因上游片段和下游片段组成。本发明对所述gluns基因上游片段和下游片段的长度不做具体限定，采用本领域所熟知的gluns基因上游片段和下游片段的长度即可，例如5bp～2000bp均可。在本发明实施例中，所述gluns基因上游片段以gluns基因上游389bp片段作为上游同源臂，所述下游片段以gluns基因下游407bp片段作为下游同源臂，以上游同源臂-下游同源臂的连接方式形成所述gluns基因的重组同源臂。所述gluns基因的重组同源臂的核苷酸序列优选如seqidno:1(gcctgcaccctgggcggtgacagcggcggcgcgatcgtgtcgggcacgctggcgctgggcatcaccagcggttcgaacgcggccgacgcgccgaactgcaacgaggccaacaccgcgctggcgcagtacggtggaaccgcgtcgctgggcatcccggtgcgcgcgattctcaccgaaatcgacgccaattccggtggcggcgtcggcagcggaattcaggtgcggacgcggtccaacgcctgacggcgaagtgctccagcacccgacggcaaagcggtccaacgcctgacgatggcgacatcggcggtaaacggacatccttcacattgcccctgaatccgacatgcccgctgtttgccccgtgaataccgaaacgtcacctcgcaataagtaggcataacgggcccgacaccatatagtcggggccatgctcctgccacgtatgcgcttctccatgcctgccgcgggccgacgcccgcggtcccttgtccgtactgcggcgatcgcggcgacctcttcacggcaccctcgaaaaggccggtagctcaacagctaccggccttttgtcgtcccggtggggaagagataccgctgacctcactaattcggatgcagcgctggaagttcgtggcccgcctcggtctggactgacggagcgggggagcgaagcggaggagcggaggagggaagaccgaggtaacagggccaccaaccgccgtagcgcagcggaggcaaattaaacagagcatgctggggatatgtgtttggtgttgctgggttggcgagcgcatccggagtaccgcttgatcgtggccgccaaccgggacgagttcttcacccgcccaacggaatcgctgcgccggtgggacgaagtgcccggggtgctggccgggcgggacctgggcgcggccggaccggtgcccggcacctggctcggtgcgctgcccgatcatcgccgcttcgcgacggtcaccaatgtgcgactacccggcgaattccgcgccgatgtgcgctcgcgcggcgcgctgctgctgg)。所述gluns基因上游片段的核苷酸序列优选如seqidno:4所示(gcctgcaccctgggcggtgacagcggcggcgcgatcgtgtcgggcacgctggcgctgggcatcaccagcggttcgaacgcggccgacgcgccgaactgcaacgaggccaacaccgcgctggcgcagtacggtggaaccgcgtcgctgggcatcccggtgcgcgcgattctcaccgaaatcgacgccaattccggtggcggcgtcggcagcggaattcaggtgcggacgcggtccaacgcctgacggcgaagtgctccagcacccgacggcaaagcggtccaacgcctgacgatggcgacatcggcggtaaacggacatccttcacattgcccctgaatccgacatgcccgctgtttgccccgtgaataccgaaacgtcacctcgcaataagtaggcataacgggcccgacaccatatagtcggggccatgctcctgccacgtatgcgcttctccatgcctgccgcgggccgacgcccgcggtcccttgtccgtactgcggcgatcgcggcgacctct)。所述gluns基因上游片段的扩增用引物优选为gluns-uf和gluns-ur。所述gluns-uf的核苷酸序列优选如seqidno:5所示(catatggggcatcaccagcggttcg)，所述gluns-ur的核苷酸序列优选如seqidno:6所示(tgcatccgaattagtgaggtcagaggagcatggccccgact)。所述gluns基因下游片段的核苷酸序列优选如seqidno:7所示(tcacggcaccctcgaaaaggccggtagctcaacagctaccggccttttgtcgtcccggtggggaagagataccgctgacctcactaattcggatgcagcgctggaagttcgtggcccgcctcggtctggactgacggagcgggggagcgaagcggaggagcggaggagggaagaccgaggtaacagggccaccaaccgccgtagcgcagcggaggcaaattaaacagagcatgctggggatatgtgtttggtgttgctgggttggcgagcgcatccggagtaccgcttgatcgtggccgccaaccgggacgagttcttcacccgcccaacggaatcgctgcgccggtgggacgaagtgcccggggtgctggccgggcgggacctgggcgcggccggaccggtgcccggcacctggctcggtgcgctgcccgatcatcgccgcttcgcgacggtcaccaatgtgcgactacccggcgaattccgcgccgatgtgcgctcgcgcggcgcgctgctgctgg)。所述gluns基因下游片段的扩增用引物优选为gluns-df和gluns-dr。所述gluns-df的核苷酸序列优选如seqidno:8所示(agtcggggccatgctcctctgacctcactaattcggatgca)，所述gluns-dr的核苷酸序列优选如seqidno:9所示(gagctcaattcgccgggtagtcgc)。利用gluns-uf和gluns-dr引物，以gluns基因上游片段和gluns基因下游片段为模板，通过pcr扩增可获得重叠pcr产物。pcr扩增程序为：94℃，5min，15个循环：94℃，30s，58℃，30s，72℃，1min。72℃，5min。反应体系为：gluns基因上游片段产物2μl，gluns基因下游片段产物2μl，gluns-uf和gluns-dr各1μl，rtaq酶25μl，无菌水19μl。

在本发明中，所述载体优选包括pre112，见图1。所述gluns基因的重组同源臂插入pre112的多克隆位点优选为saci/kpni。所述gluns基因的重组同源臂插入载体的方法优选包括酶切和连接。所述酶切包括分别对所述gluns基因的重组同源臂和载体进行酶切。本发明对所述酶切的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的酶切方法即可。本发明对所述连接的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的连接方法即可，例如利用t4连接酶进行连接。本发明对所述t4连接酶的连接方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的t4连接酶的连接方案即可。连接后，本发明还优选包括鉴定；所述鉴定优选采用pcr扩增的方法或采用测序的方法均可。构建后的重组载体见图2。

得到重组载体后，本发明将所述重组载体转化入鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞中，得到重组细胞。

在本发明中，所述鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞的制备方法采用本领域公知的制备感受态细胞的方案即可。所述鰤鱼诺卡氏菌的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的鰤鱼诺卡氏菌即可。为了举例说明减毒株的构建方法，本发明实施例中，以鰤鱼诺卡氏菌野生株zj0503为材料实施。

本发明对所述转化的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转化方法即可。在本发明实施例中，所述转化优选包括电转化。所述电转化的参数优选如下：电压180～220v，脉冲间隔时间800～1200ms，脉冲持续时间80～120μs，方波25～35个。

得到重组细胞后，本发明将所述重组细胞经培养，筛选，得到减毒鰤鱼诺卡氏菌。

在本发明中，所述培养用溶液优选为26～30℃预热的含0.3mm蔗糖的bhi溶液，所述培养的温度优选为26～30℃，所述培养的时间优选为10～12h。所述筛选优选采用载体中所携带的抗性基因对应的抗生素进行筛选。在本发明实施例中，优选采用含25mg/ml氯霉素抗性的bhi平板进行筛选。

在本发明中，所述筛选后优选还包括鉴定减毒鰤鱼诺卡氏菌。所述鉴定优选包括采用pcr扩增方法鉴定gluns基因是否缺失。所述pcr扩增用引物对优选为gluns-f1/gluns-r1和gluns-f2/gluns-r2。所述gluns-f1的核苷酸序列优选如seqidno:10所示(ccgccaaggacgtgag)。所述gluns-r1的核苷酸序列优选如seqidno:11所示(ctgtcaccgatgagctggta)。所述gluns-f2的核苷酸序列优选如seqidno:14所示(gggcatcaccagcggttcg)。所述gluns-r2的核苷酸序列优选如seqidno:15所示(aattcgccgggtagtcgc)。pcr扩增反应程序为：94℃，5min，30个循环：94℃，30s，(55℃(gluns-f2/gluns-r2)，58℃(gluns-f1/gluns-r1))，30s，72℃，1min。72℃，5min。

本发明提供了所述减毒鰤鱼诺卡氏菌的构建方法构建得到的减毒鰤鱼诺卡氏菌，所述减毒鰤鱼诺卡氏菌的基因组缺失gluns基因。所述减毒鰤鱼诺卡氏菌的半致死浓度为3.41×10⁶cfu/ml，而野生株的半致死浓度为4.74×10⁵cfu/ml，所述减毒鰤鱼诺卡氏菌较野生株降低了1个数量级，表明了该菌株毒力发生显著下降。所述减毒鰤鱼诺卡氏菌的相对免疫保护率为93.38％，具有较高的免疫原性。同时本发明构建的减毒鰤鱼诺卡氏菌，是在鰤鱼诺卡氏菌基因组上直接进行敲除，菌内不含抗性质粒，符合生物安全，并且不会以为质粒的丢失而影响鰤鱼诺卡氏菌的生长。

在本发明中，为了测定减毒鰤鱼诺卡氏菌的遗传稳定性，将减毒鰤鱼诺卡氏菌传代30代后，测定减毒鰤鱼诺卡氏菌的遗传稳定性。方法为采用gluns-f1(seqidno:10)和gluns-r1(seqidno:11)，gluns-f2(seqidno:14)和gluns-r2(seqidno:15)引物进行扩增，筛选gluns缺失株。

基于所述减毒鰤鱼诺卡氏菌的毒力下降且保持较理想的免疫原性本发明提供了所述减毒鰤鱼诺卡氏菌在制备疫苗或包含所述减毒鰤鱼诺卡氏菌的相关生物制品中的应用。本发明对所述疫苗的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的疫苗的制备方法即可。制备的疫苗能够用于防治因鰤鱼诺卡氏菌引起的鱼类诺卡氏菌病，具有较高的应用价值。本发明对所述相关生物制品的种类不做具体限定，采用本领域所熟知的生物制品的种类即可，例如治疗制品、诊断制品或疫苗制品等。

下面结合实施例对本发明提供的一种减毒鰤鱼诺卡氏菌及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

减毒鰤鱼诺卡氏菌的构建方法

步骤一：构建同源重组载体。

具体的，将保存的鰤鱼诺卡氏菌野生株(zj0503)无菌操作划线接种到脑心浸液(brainheartinfusion，bhi)固体培养基(购自广东环凯微生物科技有限公司)，26～30℃倒置培养。待平板上长出单菌落，无菌操作挑取单菌落至40～60mlbhi液体培养基中，26～30℃，100～150rpm培养至对数生长期。取一定体积的菌液提取细菌基因组，以此作为模板，利用表1引物分别克隆gluns基因上下游各片段，然后连接到pre112载体中。扩增程序为：pcr扩增的反应程序为pcr扩增程序为：94℃，5min；30个循环：94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min；72℃，5min。扩增体系为：鰤鱼诺卡氏菌基因组dna1μl，f和r各2μl，rtaq酶25μl，无菌水20μl。

表1引物序列

注：下划线为酶切位点，波浪线为重叠pcr位点。

从-80℃冰箱中取出含有pre112质粒的e.colis17-1菌种(购自武汉淼灵生物科技有限公司)，37℃水浴融化，划线于含有氯霉素抗性的lb平板中。挑取单菌落过夜扩大培养，随后使用质粒提取试剂盒提取质粒。按照表2体系对pre112质粒和重叠pcr产物分别进行双酶切实验，37℃反应30min。随后按照表3，将重叠pcr产物与质粒pre112连接。重叠pcr产物获得方法：利用gluns-uf和gluns-dr引物，以gluns基因上游片段和gluns基因下游片段为模板，通过pcr扩增可获得重叠pcr产物。pcr扩增程序为：94℃，5min，15个循环：94℃，30s；58℃，30s，72℃，1min；72℃，5min。反应体系为：gluns基因上游片段产物2μl，gluns基因下游片段产物2μl，gluns-uf和gluns-dr各1μl，rtaq酶25μl，无菌水19μl。

表2双酶切反应体系

表3重叠pcr产物与质粒pre112连接体系

步骤二：鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞的制备；

将保存的鰤鱼诺卡氏菌野生株(zj0503)无菌操作划线接种到脑心浸液(brainheartinfusion，bhi)固体培养基(购自广东环凯微生物科技有限公司)，28℃倒置培养。待平板上长出单菌落，无菌操作挑取单菌落至50mlbhi液体培养基中，28℃，120rpm培养至对数生长期。取达到对数生长期的30ml鰤鱼诺卡氏菌菌液于50ml离心管中，4℃，8000rpm收集细菌菌体；用10ml10％无菌甘油分别洗涤菌体两次，再用10ml无菌甘油重悬细菌菌体。

步骤三：电转化；

吸取一定体积的敲除质粒pre112-δgluns加入到感受态细胞中，使得敲除质粒总量为1μg，冰浴混匀30min。随后将混合液加入到96孔酶标板中，每孔100μl。设置电转仪参数：电压200v、频率30、间隔时间1000ms、持续时间60ms。电转后，加入100μl28℃预热的bhi液体培养基。置于28℃培养箱中静置复苏2小时。

步骤四：阳性克隆筛选；

取电转后复苏的鰤鱼诺卡氏菌菌液100μl涂布于含有氯霉素(25mg/ml)抗性的bhi平板上，另以没电转过的鰤鱼诺卡氏菌菌液作为阴性对照，等量涂布于含有氯霉素抗性的bhi平板上，放在生化培养箱中，28℃倒置培养至平板长出菌落。挑取单菌落到不含有10％蔗糖的bhi液体培养基中培养5d，用表4引物对112-f1/112-r1检测细菌内是否含有敲除质粒pre112-δgluns。pcr扩增反应程序为：94℃，5min，30个循环：94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min。72℃，5min。扩增体系为：模板dna1μl，112-f1和112-r1各1μl，rtaq酶12μl，无菌水10μl。将菌液接种到含有10％蔗糖的bhi液体培养基中继续培养，用表5缺失株验证引物进行多重pcr检测，筛选gluns基因缺失株。pcr扩增反应程序为：94℃，5min，30个循环：94℃，30s，(55℃(gluns-f2/gluns-r2)，58℃(gluns-f1/gluns-r1))，30s，72℃，1min。72℃，5min。扩增体系为：模板dna1μl，f和r各1μl，rtaq酶12μl，无菌水10μl。

用gluns-f1/gluns-r1引物对，可扩增鰤鱼诺卡氏菌野生株(zj0503)glu基因内部463bp片段，而缺失株zj0503-6296则无法扩增出目的条带。用gluns-f2/gluns-r2引物对，可扩增鰤鱼诺卡氏菌野生株(zj0503)gluns基因，及其上下游同源臂共2042bp条带；但是对于缺失株zj0503-6296只能扩增上下游同源796bp条带。

结果如图3和图4所示，构建成功的gluns基因缺失株命名为鰤鱼诺卡氏菌(nocardiasp.)zj0503-6296。

表4pre112验证引物

表5gluns缺失株筛选引物

实施例2

稳定性遗传分析

为测定鰤鱼诺卡氏菌gluns缺失株的遗传稳定性，分别从平板挑取鰤鱼诺卡氏菌zj0503-6296和鰤鱼诺卡氏菌野生株(zj0503)至含有bhi液体培养基的ep管中，培养3～4天。然后继续划线于无抗性的bhi平板上，28℃倒置培养至平板上长出菌落、观察菌落形态和生长特性。连续划线接种培养gluns缺失株至30代，用缺失株引物(gluns-f2和gluns-r2)验证相应菌株的遗传稳定性。

结果如图5所示，gluns缺失株连续传至30代，无法检测出gluns基因片段，表明gluns缺失株能稳定遗传。

实施例3

1.半致死浓度测定

为了测定缺失株鰤鱼诺卡氏菌zj0503-6296和鰤鱼诺卡氏菌野生株(zj0503)的半致死浓度(ld50)。参考文献方法[2]，用无菌pbs溶液调整菌悬液浓度为10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸cfu/ml，实验组每尾杂交鳢腹腔注射100μl菌液，对照组注射等量的无菌pbs溶液，每个浓度设立三个平行组，每组30尾。连续观察14天，每天正常投喂商业饲料并记录死鱼情况。参考文献方法[3]，采用spss17.0进行统计学分析并计算ld50。

参考文献

[1]朱志东,吕莉,邓剑壕,等.鱼类诺卡氏菌病的研究进展[j].水产养殖,2018,39(01):48–52.

[2]王文基,陈建林,侯素莹,等.鰤鱼诺卡氏菌感染乌斑杂交鳢的组织病理学研究[j].基因组学与应用生物学,2019,38(10):4439–4446.

[3]熊浩明,魏柏青,魏荣杰,等.用spss软件计算鼠疫菌半数致死量(ld_(50))[j].中国人兽共患病学报,2013,29(11):1127–1130.

结果如表6和表7所示，野生株的半致死浓度为4.74×10⁵cfu/ml，鰤鱼诺卡氏菌zj0503-6296的半致死浓度为3.41×10⁶cfu/ml，其半致死浓度相较野生株降低了1个数量级，表明了该菌株毒力发生显著下降。

表6鰤鱼诺卡氏菌各菌株死亡数统计

表7缺失株鰤鱼诺卡氏菌zj0503-6296半致死浓度计算置信度

2.免疫保护率的计算；

将缺失株鰤鱼诺卡氏菌zj0503-6296以10⁶cfu/ml免疫杂交鳢35天后，进行鰤鱼诺卡氏菌野生株活菌攻毒实验，并计算免疫保护率，同时设置对照组，对照组用pbs代替鰤鱼诺卡氏菌zj0503-6296。根据公式i计算免疫保护率。

相对免疫保护率(rps)＝{1–[免疫组死亡率(％)/对照组死亡率(％)]}×100％公式i。

表8鰤鱼诺卡氏菌注射杂交鳢存活率鱼免疫保护率计算

由上述可知，缺失株鰤鱼诺卡氏菌zj0503-6296的相对免疫保护率达到93.38％，取得了较理想的免疫原性，可用于后续疫苗的制备。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>广东海洋大学深圳研究院；广东海洋大学；深圳义海生物科技有限公司

<120>一种减毒鰤鱼诺卡氏菌及其构建方法和应用

<160>15

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1035

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gcctgcaccctgggcggtgacagcggcggcgcgatcgtgtcgggcacgctggcgctgggc60

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gcgcgctgctgctgg1035

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atcttgcgaatatatgtgtaga22

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

taaccagaccgttcagctg19

<210>4

<211>517

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4