本发明公开了一种食甲酸和co2自养的重组大肠杆菌及其构建方法，属于微生物代谢工程领域和合成生物学领域。
背景技术：
随着社会经济的快速发展和化石能源的过度开发利用，温室气体的大量排放给环境生态、全球气候、人类生产生活带了巨大威胁。二氧化碳就是其中排放量最大的代表性温室气体，尤其是化石燃料与工业排放的二氧化碳已接近400亿吨每年。如何有效治理和利用二氧化碳已成为当今世界最关注的科学问题之一。
co2作为一种最基本的碳资源，是合成其他碳中性化合物（例如植物光合作用产葡萄糖）的重要前体。因此，将co2转化为化工原料或燃料，既能解决温室气体排放治理的问题，也能解决人类长期依赖化石能源导致资源匮乏的问题。那么，如何高效、环保地转化co2为化工原料呢，目前，植物和藻类的光合作用是全球分布最广、应用最为普遍的co2生物固定与转化方式。然而，光合作用仅局限于含有叶绿体的真核细胞中，不但生长速度慢、季节性影响大，而且大部分植物光能利用率不超过1%，限制了这种co2转化方式在工业水平的应用。近年来，随着电催化技术和光催化技术的迅速发展，可以充分利用清洁廉价的太阳能和电能来还原转化co2。比如利用贵重金属纳米材料负载的电极可以在一定负电压下还原co2到co、甲酸、甚至甲醇等简单的一碳化合物。甲酸作为二氧化碳还原的产物之一，是最容易制备的水溶性一碳化合物，也是大多数微生物可直接利用转化并且毒性最低的、最简单的有机碳源。因此，为弥补电催化或者光催化还原二氧化碳产物简单的问题，可以配合具有下游转化路径的微生物，利用合成代谢的优势来实现还原产物附加值的升级。同时，微生物（例如大肠杆菌）生长速度快、基因编辑便捷、具有工业应用背景，若配合甲酸代谢和co2固定转化，将有望真正实现二氧化碳的高效循环利用。
大肠杆菌是工业发酵和产物升级的模式菌株，开发其co2生物固定具有重要研究意义。目前，针对大肠杆菌甲酸和co2同化利用的还原甘氨酸途径，往往采用辅助碳源（例如葡萄糖）来帮助大肠杆菌获取足够的电子和能量来还原co2，从而获得能够转化co2为生物质并且增加细胞生物量的大肠杆菌。显然，该方式导致了高级有机碳源的浪费，是一种不经济的生物固碳方式。近来，也有以色列研究团队采用300多天的长期实验室驯化方式，获得能够适应甲酸和co2为唯一碳源进行生长的大肠杆菌。同时，也有韩国团队通过大肠杆菌的多组学分析、大量基因敲除、代谢通路精确调节、电子传递优化等系统生物学手段，最终获得最佳重组菌。虽然以上方式获得了一些食甲酸和co2自养的重组大肠杆菌，但是仍然存在操作周期长、投入成本高、通用性能差的问题。因此，开发一种简单通用的生物固碳模块，并以此获得一种食甲酸和co2自养的重组大肠杆菌，对生物固碳的工业应用具有重要指导意义。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明以实验室最常用的大肠杆菌bl21(de3)为出发菌，通过导入含有杨氏梭菌的甲酸同化酶基因簇的模块化质粒，初步构建具有c1-丙酮酸合成途径的重组大肠杆菌。接着，导入博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶突变体和大肠杆菌的甘氨酸裂解酶复合体的模块化质粒，改善胞内还原型辅因子不平衡的缺点，从而提升大肠杆菌对甲酸和co2同化为丙酮酸的效率。最终，获得一株以甲酸和co2为唯一碳源进行快速生长的大肠杆菌。
本发明的首先提供一种具有食甲酸和co2自养能力的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌导入了外源的甲酸同化酶基因簇(fhs-fcha-fold)和甲酸脱氢酶基因(cbfdh1)，并过表达了内源的甘氨酸裂解酶复合体(ecgcvthp)。
在本发明的一种实施方式中，所述的甲酸同化酶基因簇序列如seqidno.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述的甲酸脱氢酶基因序列如seqidno.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述的甘氨酸裂解酶复合体基因簇序列如seqidno.3所示。
本发明还提供了所述具有食甲酸和co2自养能力的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：
构建具有甲酸同化功能的模块化质粒pm6tac-fhs-fcha-fold：
(1)以质粒petduet-1为基本骨架，替换t7启动子为tac启动子，并在所述tac启动子前面引入酶切位点avrii，在t7终止子前后分别引入酶切位点spei和nhei，得到模块化质粒的底盘pm6tac；
所述底盘质粒pm6tac基因序列如seqidno.4所示。
(2)分别克隆甲酸同化酶基因簇的基因组序列中的fhs、fcha、fold基因片段，酶切后分别连接至pm6tac质粒，得到3个重组质粒；
(3)通过不同酶切位点的互补与消除，通过对所述得到的3个重组质粒酶切、连接，将三个携带tac启动子的甲酸同化酶基因fhs、fcha、fold连续堆砌在底盘质粒pm6tac上，从而获得具有甲酸同化功能的模块化质粒pm6tac-fhs-fcha-fold。
构建具有co2同化功能的模块化质粒pacyc-ecgcvthp-cbfdh1：
以质粒pacycduet-1为底盘质粒，在所述质粒其中一个多克隆位点插入ecgcvthp基因序列，得到质粒pacyc-ecgcvthp；在所述质粒另一个多克隆位点插入cbfdh1基因序列，得到质粒pacyc-cbfhd1；分别对质粒pacyc-ecgcvthp和质粒pacyc-cbfhd1进行双酶切，回收线性质粒片段pacyc-cbfhd1和基因片段ecgcvthp，连接、转化、抗性平板筛选得到含有co2同化功能的模块化质粒pacyc-ecgcvthp-cbfdh1。
构建具有食甲酸和co2自养能力的重组大肠杆菌：
将构建的具有甲酸同化功能的模块化质粒和具有co2同化功能的模块化质粒，逐步（先转入甲酸同化功能的模块化质粒pm6tac-fhs-fcha-fold，再转入co2同化功能的模块化质粒pacyc-ecgcvthp-cbfdh1）或同步电击转化导入大肠杆菌，氨苄霉素和氯霉素双抗性平板培养获得重组大肠杆菌。
本发明还提供所制备的一种具有甲酸同化功能的模块化质粒pm6tac-fhs-fcha-fold，所述模块化质
粒的序列如seqidno.5所示。
本发明还提供所制备的一种具有co2同化功能的模块化质粒pacyc-ecgcvthp-cbfdh1，所述模块化质粒的序列如seqidno.6所示。
本发明的还提供所述食甲酸和co2自养的重组大肠杆菌的培养方法，所述方法是将上述的甲酸和co2同化的两种模块化质粒电击转化导入大肠杆菌，在双抗性平板培养获得重组菌单克隆。随后，将上述重组菌单克隆接种至液体种子培养基，培养至一定细胞量来获得重组菌的种子液。收集种子液菌体细胞并生理盐水清洗，接种到甲酸和co2为唯一碳源的发酵培养基，最终获得食甲酸和co2自养的大肠杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述的双抗性平板配方为：15g/l琼脂粉，10g/l蛋白胨，5g/l酵母膏，10g/lnacl，80mg/lampicillin，25mg/lchloramphenicol。
在本发明的一种实施方式中，所述的液体种子培养基配方为：10g/l蛋白胨，5g/l酵母膏，10g/lnacl，80mg/lampicillin，25mg/lchloramphenicol，0.5mmol/liptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)。
在本发明的一种实施方式中，所述的发酵培养基每升配方为：4g甲酸钠，8gnahco3,6.8gna2hpo4·7h2o,3gkh2po4,0.5gnacl,1gnh4cl,0.8gmgso4·7h2o,0.24giptg,0.05g乙二胺四乙酸，2mg硫胺素，10ml维生素混合液(每升含有2mgbiotin（生物素）,2mgfolicacid（叶酸）,10mgpyridoxine·hcl（盐酸吡哆辛、维生素b6），5mgriboflavin（核黄素、维生素b2）,5mgnicotinicacid（烟酸）,5mgcalciumd-( )-pantothenate（d-泛酸钙）,0.1mgvitaminb12（维生素b12）,5mgp-aminobenzoicacid（对氨基苯酸）,5mgthiocticacid（硫辛酸）)，10ml微量元素混合液(每升含有0.5gmnso4·h2o,0.2gznso4,0.1gcacl2,0.1gcocl2·6h2o,0.1gfeso4·7h2o,20mgcucl2·2h2o,10mgna2seo3,10mgnicl2·6h2o,10mgna2wo4·2h2o,)，80mg/lampicillin（氨苄），25mg/lchloramphenicol（氯霉素）。采用hcl或naoh调节最终ph7.2。
本发明还提供所述重组大肠杆菌在化工、制药或环境领域中实现二氧化碳的高效循环利用的应用。
本发明的有益效果：
本发明以大肠杆菌bl21(de3)为案例，通过模块化质粒的快速构建与导入，获得拥有完整的c1-丙酮酸合成途径的重组大肠杆菌。整个构建过程简单(外源基因在相同酶切位点上进行连续性堆砌组装，无需繁杂的基因组敲除过程)、周期短(重组菌获得时间不超过4天，无需长周期驯化)，通用性高(模块化质粒可适用于其他种类大肠杆菌)。
另外，该重组菌可借助甲酸脱氢酶突变体来提升胞内还原型辅因子nad(p)h水平，让重组菌具有“食用”甲酸来促进丙酮酸从头合成的能力，最终获得食甲酸和co2自养的大肠杆菌。以最初0.05个od600生物量接种至甲酸和co2为唯一碳源的培养基发酵56小时，重组菌最高可获得0.9个od600生物量，而原始菌几乎没有生长。这也是目前在没有基因敲除和长期驯化等手段辅助下，生长速度最快的食甲酸和co2自养的大肠杆菌。
附图说明
图1是大肠杆菌利用甲酸和co2进行自养的c1-丙酮酸合成途径。
图2是甲酸同化功能的模块化质粒pm6tac-fhs-fcha-fold图谱和构建示意图。
图3是co2同化功能的模块化质粒pacyc-ecgcvthp-cbfdh1图谱和构建示意图。
图4是食甲酸和co2自养大肠杆菌的生长曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
以下实施例中以大肠杆菌jm109为质粒克隆扩增的主要载体，以大肠杆菌bl21(de3)为食甲酸和co2自养的底盘菌；所使用的骨架型质粒petduet-1和pacycduet-1均为novagen公司的商业化产品，所采用质粒提取试剂盒为上海生工公司商业化产品；基因与引物的合成都由上海生工公司完成；大肠杆菌生物量即为细胞浓度，采用分光光度计于1cm光程测定600nm处的吸光度差值。
下述实施例中，没有多作说明的都是采用常规分子生物学实验方法完成，所采用酶相关试剂盒均在大连宝生物公司购买。
实施例中所涉及pcr、酶切、连接、密码子优化等过程都是本领域技术人员根据产品说明书或本领域基础知识可以理解并且容易实现的，因此不再详细描述。
实施例1：甲酸同化功能的模块化质粒构建
根据商业化质粒petduet-1的基因序列和图谱，分别设计携带sali酶切位点的上游引物pem6-f和携带avrii酶切位点的下游引物pem6-r，通过pcr扩增得到petduet-1质粒的线性化片段；随后通过sali/avrii双酶切所得到的质粒线性化片段和tac基因合成片段(序列为seqidno.4所示的avrii和sali酶切位点之间序列)，通过t4dna连接酶16℃连接酶切后的质粒线性化片段和tac基因片段1小时，即可转化大肠杆菌jm109感受态；最后，通过含有氨苄抗性的lb培养基固体平板筛选，获得含有pem6tac质粒（seqidno.4即为该质粒序列）的克隆，并扩增提取后备用。根据杨氏梭菌(clostridiumljungdahlii)的甲酸同化酶基因簇的基因组序列片段(如seqidno.1所示)，分别设计引物fhs-f/fhs-r、fcha-f/fcha-r以及fold-f/fold-r，通过pcr克隆得到甲酸同化的三个关键酶fhs、fcha以及fold的基因片段；随后，将上述三个片段和pem6tac分别进行ndei/xhoi双酶切，通过t4dna连接酶连接，分别转化大肠杆菌jm109感受态；最后，通过含有氨苄抗性的lb培养基固体平板筛选，分别获得携带pem6tac-fhs、pem6tac-fcha、pem6tac-fold质粒的正确克隆（如图2所示）。
以上述质粒pem6tac-fhs为底盘质粒，采用nhei/sali进行双酶切，获得具有与avrii酶切相同的粘性末端；随后，对质粒pem6tac-fcha进行avrii/sali双酶切，获得携带ptac启动子的fcha重组片段，并与nhei/sali双酶切后的线性质粒pem6tac-fhs连接；接着，将连接后得到的片段通过转化大肠杆菌jm109感受态和单克隆筛选，获得pem6tac-fcha-fhs质粒，粘合处nhei酶切位点得到消除，并在下游引入新的nhei酶切位点，可继续组装新的基因片段。
在此基础上，继续采用nhei/sali双酶切pem6tac-fcha-fhs质粒，avrii/sali双酶切pem6tac-fold质粒，将携带ptac启动子的fold重组片段与线性质粒pem6tac-fcha-fhs连接，转化大肠杆菌后即可得到完整的甲酸同化质粒pem6tac-fcha-fhs-fold（如图2所示）。上述质粒构建方式采用灵巧的设计来进行酶切位点的互补与消除，可以实现多种基因片段的模块化组装，并且每种基因都具有独立的强启动子ptac，可以大大增强c1-丙酮酸合成途径（如图1所示）中的甲酸同化速率。
实施例2：co2同化功能的模块化质粒构建
甘氨酸裂解酶复合体在具有充足的还原性辅因子nad(p)h条件下，通常被认为具有反向催化功能，也就是具有将co2、nh4 以及甲酸同化产物ch2-thf(亚甲基四氢叶酸)转化为甘氨酸的能力。因此，甘氨酸裂解酶复合体对co2同化起着关键作用，也是实现大肠杆菌依赖c1-丙酮酸合成途径自养的限速步骤。
根据大肠杆菌bl21(de3)自身的甘氨酸裂解酶ecgcvthp基因簇序列(如seqidno.3所示)，分别设计携带ncoi/bamhi酶切位点的gcvt-f和gcvp-r引物（见表1），对上述序列进行pcr扩增获得4500bp左右的基因片段；采用限制性内切酶ncoi/bamhi分别对所得到的pcr产物和pacycduet-1质粒进行双酶切，酶切产物回收后进行t4dna酶连接和感受态转化，氯霉素抗性平板(10g/l蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/lnacl，15g/l琼脂粉，25mg/lchloramphenicol)筛选得到含有正确质粒pacyc-ecgcvthp的单克隆。
甘氨酸裂解酶将co2、nh4 以及甲酸同化产物ch2-thf转化为甘氨酸需要还原型辅因子nadh的参与，然而重组大肠杆菌在仅含甲酸和co2为碳源的培养条件下胞内极度缺乏还原型辅因子。来自博伊丁假丝酵母(candidaboidinii)的甲酸脱氢酶在经过定点突变之后，可以直接氧化甲酸来促进胞内nad(p)h再生，同时产生为co2供应细胞自养。
根据上述原理和博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶基因序列(genbank:af004096.1)，进行密码子优化和基因人工合成（合成后的序列如seqidno.2所示），再采用携带ndei/xhoi酶切位点的cbfdh-f/cbfdh-r引物(见表1)进行pcr扩增；随后采用限制性内切酶ndei/xhoi对pcr产物和pacycduet-1质粒分别进行酶切，再经过连接和感受态转化，获得模块化质粒pacyc-fhd；接着，采用突变引物fdh1-f/fdh1-r(见表1)对该质粒进行滚环pcr，使用限制性内切酶dpni对pcr产物酶切后转化到大肠杆菌jm109感受态，经氯霉素抗性平板筛选得到含有模块化质粒pacyc-cbfhd1的正确单克隆；最后，采用限制性内切酶ncoi/bamhi分别对pacyc-cbfhd1质粒和pacyc-ecgcvthp质粒进行双酶切，分别回收线性质粒片段pacyc-cbfhd1和基因片段ecgcvthp(如图3所示)，连接后进行感受态转化，从氯霉素抗性平板筛选含有co2同化功能的模块化质粒pacyc-ecgcvthp-cbfdh1的正确单克隆，从而抽提质粒备用。
实施例3：重组大肠杆菌bl21(de3)的构建
以大肠杆菌bl21(de3)为底盘菌，作为甲酸同化质粒和co2同化质粒的转化对象。大肠杆菌感受态制备方式参考常规分子生物学操作步骤：首先，采用lb培养基在37℃下培养细胞至浓度0.4od600；其次，在4℃和4000rpm离心条件下收集细胞，后采用去冷却的无菌离子水清洗2遍；最后，采用冷却的无菌去离子水按照1000:1的稀释大肠杆菌，获得可用于转化模块化质粒的感受态细胞。
分别取100ng的pem6tac-fcha-fhs-fold和pacyc-ecgcvthp-cbfdh1质粒，加入到含有100µl新鲜制备的感受态大肠杆菌bl21(de3)的电击杯中，温和混匀后，冰上孵育15分钟；随后，采用bio-rad公司生产的高压电击仪，调节参数为25µf、200ohms、2.0kv；将含有大肠杆菌和质粒的预冷电击杯擦干，迅速放入电击槽并启动电击；电击完成后，迅速取出电击杯并加入1ml无抗生素lb液体培养基，并全部转移到2ml无菌试管中；在30℃和150rpm摇床培养1小时后，4000rpm离心30s收集菌泥，全部涂布在含有氨苄和氯霉素的双抗性平板，30℃培养18-22小时，即可得含有甲酸和co2同化功能的模块化质粒的重组大肠杆菌单克隆。
实施例4：食甲酸和co2自养大肠杆菌的培养方法
食甲酸和co2自养是指重组大肠杆菌利用人工导入的c1-丙酮酸合成途径，以一碳化合物(甲酸和co2)为唯一碳源，以甲酸代谢来再生还原型辅因子nad(p)h，以大肠杆菌自身氧化磷酸化系统提供能量atp，从头合成细胞中心代谢产物丙酮酸，为生物质合成和细胞增殖提供了前体基础。
根据上述设计原理，以具有甲酸和co2同化功能的模块化质粒的重组大肠杆菌bl21(de3)为案例，按照一定的培养方法获得以甲酸和co2为唯一碳源进行生长的重组菌，即食甲酸和co2自养的重组大肠杆菌；同时，将不携带fhs-fcha-fold、cbfdh1以及ecgcvthp基因的模块化质粒pem6tac和pacycduet-1共同电击转化进入大肠杆菌(具体步骤参考实施例3)，获得不具有即食甲酸和co2自养能力的原始大肠杆菌作为对比。具体步骤如下：
首先，在双抗性lb平板(15g/l琼脂粉，10g/l蛋白胨，5g/l酵母膏，10g/lnacl，80mg/lampicillin，25mg/lchloramphenicol)上挑取重组菌单克隆，接种至含有5ml种子培养基(10g/l蛋白胨，5g/l酵母膏，10g/lnacl，80mg/lampicillin，25mg/lchloramphenicol，0.5mmol/liptg)的试管中，在30℃和200rpm恒温摇床中培养8小时，获得重组大肠杆菌初步活化的种子液；
其次，在常温离心机转速8000rpm条件下，离心4分钟来收集种子液中初步活化的重组大肠杆菌，采用无菌生理盐水清洗并重悬菌体，再次离心收集菌泥，重复3次或以上步骤，去除种子培养基中除甲酸和co2以外的其他碳源的影响；将上述多次清洗的菌泥按照最终od600=1的细胞浓度进行稀释和标定，以备发酵液接种使用；
最后，取上述od600=1的重组大肠杆菌细胞100µl，接种至含有100ml发酵培养基(0.4g甲酸钠，0.8gnahco3,0.68gna2hpo4·7h2o,0.3gkh2po4,0.05gnacl,0.1gnh4cl,0.08gmgso4·7h2o,0.024giptg,0.005g乙二胺四乙酸，0.2mg硫胺素，1ml维生素混合液，1ml微量元素混合液，8mgampicillin，2.5mgchloramphenicol)的摇瓶中，在30℃和200rpm恒温摇床中培养4天，期间间隔8-12小时取样测定细胞浓度。
如图4所示，在以甲酸和co2为唯一碳源的发酵培养基中，不具有食甲酸和co2自养能力的原始大肠杆菌在培养78小时后，细胞浓度从od600=0.04只增加到0.08，没有明显的生长现象；相反，重组大肠杆菌即食甲酸和co2自养的重组大肠杆菌在相同条件下，发酵培养56个小时，即可得细胞浓度od600=0.9，相比于原始大肠杆菌具有明显的生长优势。
*引物序列中小写字母指示引入的酶切位点。
序列表
<110>江苏大学
<120>一种食甲酸和co2自养的重组大肠杆菌及其构建方法
<160>20
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>4030
<212>dna
<213>杨氏梭菌(clostridiumljungdahlii)
<400>1
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1.一种具有食甲酸和co2自养能力的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌导入了外源的甲酸同化酶基因簇fhs-fcha-fold和甲酸脱氢酶基因cbfdh1，并过表达了内源的甘氨酸裂解酶复合体ecgcvthp。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，
所述的甲酸同化酶基因簇fhs-fcha-fold序列如seqidno.1所示；
所述的甲酸脱氢酶基因cbfdh1序列如seqidno.2所示；
所述的甘氨酸裂解酶复合体基因ecgcvthp序列如seqidno.3所示。
3.权利要求1或2任一项所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
构建具有甲酸同化功能的模块化质粒pm6tac-fhs-fcha-fold；
构建具有co2同化功能的模块化质粒pacyc-ecgcvthp-cbfdh1；
构建具有食甲酸和co2自养能力的重组大肠杆菌：
将构建的具有甲酸同化功能的模块化质粒和具有co2同化功能的模块化质粒，电击转化导入大肠杆菌，氨苄霉素和氯霉素双抗性平板培养获得重组大肠杆菌。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述构建具有甲酸同化功能的模块化质粒pm6tac-fhs-fcha-fold的方法如下：
(1)以质粒petduet-1为基本骨架，替换t7启动子为tac启动子，并在所述tac启动子前面引入酶切位点avrii，在t7终止子前后分别引入酶切位点spei和nhei，得到模块化质粒的底盘pm6tac；
(2)分别克隆甲酸同化酶基因簇的基因组序列中的fhs、fcha、fold基因片段，酶切后分别连接至pm6tac质粒，得到3个重组质粒；
(3)通过不同酶切位点的互补与消除，通过对所述得到的3个重组质粒酶切、连接，将三个携带tac启动子的甲酸同化酶基因fhs、fcha、fold连续堆砌在底盘质粒pm6tac上，从而获得具有甲酸同化功能的模块化质粒pm6tac-fhs-fcha-fold。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述底盘质粒pm6tac基因序列如seqidno.4所示。
6.权利要求4所述方法得到的具有甲酸同化功能的模块化质粒pm6tac-fhs-fcha-fold，所述模块化质粒的序列如seqidno.5所示。
7.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述构建具有co2同化功能的模块化质粒pacyc-ecgcvthp-cbfdh1的方法如下：
以质粒pacycduet-1为底盘质粒，在所述质粒其中一个多克隆位点插入ecgcvthp基因序列，得到质粒pacyc-ecgcvthp；在所述质粒另一个多克隆位点插入cbfdh1基因序列，得到质粒pacyc-cbfhd1；分别对质粒pacyc-ecgcvthp和质粒pacyc-cbfhd1进行双酶切，回收线性质粒片段pacyc-cbfhd1和基因片段ecgcvthp，连接、转化、抗性平板筛选得到含有co2同化功能的模块化质粒pacyc-ecgcvthp-cbfdh1。
8.权利要求7所述方法得到的具有co2同化功能的模块化质粒pacyc-ecgcvthp-cbfdh1，所述模块化质粒的序列如seqidno.6所示。
9.权利要求1或2任一项所述重组大肠杆菌的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
将构建的重组大肠杆菌单克隆接种至液体种子培养基，培养至一定细胞量来获得重组菌的种子液；收集种子液菌体细胞并生理盐水清洗，接种到甲酸和co2为唯一碳源的发酵培养基，培养食甲酸和co2自养的重组大肠杆菌；
所述的发酵培养基每升配方为：4g甲酸钠，8gnahco3，6.8gna2hpo4•7h2o，3gkh2po4，0.5gnacl，1gnh4cl，0.8gmgso4•7h2o，0.24giptg，0.05g乙二胺四乙酸，2mg硫胺素，10ml维生素混合液，10ml微量元素混合液，80mg/lampicillin，25mg/lchloramphenicol，培养基ph值为7.2；
其中所述的维生素混合液中含有biotin、folicacid、pyridoxine•hcl、riboflavin、nicotinicacid、calciumd-( )-pantothenate、vitaminb12、p-aminobenzoicacid和thiocticacid；
所述的微量元素混合液中含有mnso4•h2o、znso4、cacl2、cocl2•6h2o、feso4•7h2o、cucl2•2h2o、na2seo3、nicl2•6h2o和na2wo4•2h2o。
10.权利要求1或2任一项所述重组大肠杆菌在化工、制药或环境领域中实现二氧化碳的高效循环利用的应用。
技术总结