本发明涉及生物医药技术领域，具体为一种高效产β-葡萄糖醛酸酶混合菌剂的制备方法。
背景技术：
牛黄的药用价值高、医用需求量大，药源却十分短缺，我国在20世纪80年代后期已开始大面积在活体牛胆囊内培植牛黄，但仍旧存在牛黄产量低，药用效果弱于天然牛黄等问题；
人工培植牛黄主要通过向牛胆囊内注射足量具有β-g活性的大肠杆菌，β-g可水解牛胆汁中的结合胆红素(bdg)，使之变为游离胆红素(ucb)，游离胆红素正是形成牛黄的主要成分之一，也是其药用价值的主要评判标准；
多数研究仅分离得到单一菌株致黄，但其普遍存在在胆囊中存活时间短、对胆囊环境适应性差、繁殖活力低、β-葡萄糖醛酸酶活性低等问题；针对这些缺陷，设计一种高效产β-葡萄糖醛酸酶混合菌剂的制备方法是很有必要的。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种高效产β-葡萄糖醛酸酶混合菌剂的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种高效产β-葡萄糖醛酸酶混合菌剂的制备方法，包括步骤一，新鲜动物胆囊样本采集；步骤二，大肠杆菌分离；步骤三，大肠杆菌鉴定；步骤四，大肠杆菌胆汁存活筛选；步骤五，胆酸多浓度梯度定向诱导培育；步骤六，牛胆囊仿生动态模拟培育；步骤七，大肠杆菌β-g活性测定；步骤八，菌液混合培养；步骤九，动物毒性试验检测；
其中在上述步骤一中，人工无菌摘取鸡、鸭、猪、牛等不同动物胆囊；
其中在上述步骤二中，大肠杆菌分离包括以下步骤：
1)无菌条件下用一次性注射器采集胆囊内胆汁0.1ml接种于伊红美兰琼脂培养基emb，同时各取1ml胆汁接种于10ml，lb液体培养基以增菌；
2)分别置于37℃恒温培养箱培养和37℃恒温摇床，培养16-24h，若emb无菌落生长、lb清亮透明者视为无菌；
3)emb无深紫红色带金属光泽菌落但lb浑浊者，可再取0.1ml，lb培养基转接于emb上37℃培养16-24h；若emb上出现圆形、湿润、光滑、边缘整齐、中等大小的深紫红色带金属光泽菌落视为可疑菌落，用无菌接种环挑取已编号的单个可疑菌落，于emb培养基上进行反复划线分离以得到纯化菌落；
其中在上述步骤三中，大肠杆菌鉴定包括以下步骤：
1)镜检，无菌挑取纯化的单个可疑菌落，用革兰氏染液染色后于光学显微镜下观察，镜检菌落形态为红色短杆状则初步判定为大肠杆菌；
2)pcr扩增，将上一步骤判定为阳性的菌株进行pcr扩增，pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测；
其中在上述步骤四中，大肠杆菌胆汁存活筛选包括以下步骤：
1)将步骤三2)中判定为阳性的菌株用微量移液器吸取8μl，接种于1ml无菌处理后的新鲜牛胆汁中；
2)37℃培养30天后取8μl涂布于伊红美兰琼脂平板，37℃培养，观察是否有菌落生长，若有，则视为该菌株可在牛胆汁中存活；
其中在上述步骤五中，胆酸多浓度梯度定向诱导培育包括以下步骤：
1)使用5号胆盐，胆酸含量70％-85％和无菌处理后的新鲜牛胆汁配成胆酸含量为12％、15％、18％、21％、24％、27％、30％的1ml无菌肉汤；
2)用无菌接种环挑取将步骤四2)中判定为阳性的菌落于1ml的12％胆酸-肉汤培养基中，取一环菌液接种于伊红美蓝琼脂培养基上；
3)若观察到有呈金属光泽的绿色菌落，得到第一代菌株，然后将其置于胆酸含量为15％的胆酸-肉汤培养基中，重复上述步骤，将菌株驯化至能够在含胆酸量为21％以上的无菌肉汤中存活且繁殖；
其中在上述步骤六中，牛胆囊仿生动态模拟培育包括以下步骤：
1)模拟牛胆囊温度的变化:设置温度变化范围：37℃、38℃、39℃、40℃、41℃，用无菌接种环挑取将上一步骤判定为阳性的菌株，接种于1ml无菌新鲜牛胆汁中，置于37℃恒温培养箱培养，每隔8h上调温度1℃，直至温度达到41℃，每次上调前取一环菌液划线于伊红美蓝琼脂培养基，37℃恒温培养24h，检测菌株生存活性；
2)模拟牛胆囊胆红素浓度变化tbr：配置胆红素溶液浓度范围为0.1755mg/ml、0.2048mg/ml、0.2340mg/ml、0.2633mg/ml、0.2925mg/ml，用无菌接种环挑取将上一步骤判定为阳性的菌株接种于胆红素-牛胆汁溶液中，每隔8h上调牛胆汁中胆红素浓度，直至调节到0.2925mg/ml。每次上调前取一环菌液划线于伊红美蓝琼脂培养基，37℃恒温培养24h，检测生存活性；
其中在上述步骤七中，大肠杆菌β-g活性测定包括以下步骤：
1)绘制对硝基酚标准曲线；
2)样品处理：用无菌接种环挑取上一步骤生长最好的单菌落至20mltsb培养基中震荡培养6h后取出，调整菌液浓度为1×108cfu/ml,在5000r/min、4℃条件下离心10min，弃去上清液，用pbs洗涤菌体2-3次，离心弃去上清液后向菌体加入3-4ml，pbs，用超声波细胞破碎机冰浴破碎30-45min，频率为400hz，5000r/min离心10分钟，取上清液备用；
3)酶活性测定：吸取上清液80μl于96孔中，加入等量pnpg底物溶液，作为样品液，36℃保温1h；吸取80μl，pbs于96孔中，加入等量pnpg底物溶液，作为空白对照，36℃保温1h；待各样品保温结束后，取出每孔加入36μl，0.1mol/l的naoh溶液终止反应，用全波长酶标仪在405nm波长下用空白校正零点后测定样品液的吸光度，将吸光度值代入标准曲线方程得出对硝基酚浓度，然后按照下式计算酶的活性单位；
其中在上述步骤八中，菌液混合培养包括以下步骤：
1)筛选出以1∶1浓度随机两两配对混合后对于酶活性的作用为协同的大肠杆菌组合，再在这些组合中分别进行1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、8∶1、4∶1、2∶1浓度配比；
2)混合培养后，测定混合菌液酶活力，并与同一组合1∶1浓度配比的混合菌液进行酶活力对比，筛选出能够高产β-g的混合菌液最佳配对及浓度配比；
其中在上述步骤九中，动物毒性试验检测包括以下步骤：
1)将筛选出能够高产β-g酶的混合菌液的组合编号，取3周龄成年小鼠，每组6只，设置两组分别于腹腔注射致病性大肠杆菌或生理盐水，其余组分别于腹腔注射筛选出来的混合菌液，每只1×109cfu/ml，试验饲养三周；
2)试验饲养三周，观察筛选出来的菌种是否为非致病性大肠杆菌，结果表明为非致病性大肠杆菌的菌种保存备用。
根据上述技术方案，所述步骤一中新鲜动物胆囊样本采集中，所用动物胆囊必须保证新鲜完整、胆囊管结扎且内容物未与外界接触。
根据上述技术方案，所述步骤二2)中摇床为200r/min。
根据上述技术方案，所述步骤三2)中需要根据genebank上公布的编码β-g的uid，a基因设计一段引物。
根据上述技术方案，所述步骤五2)中经37℃恒温培养24h。
根据上述技术方案，所述步骤七3)中β-g酶单位/l(u/l)＝对硝基酚释放量(μmol)/保温时间(h)/被检液量(l)。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：该一种高效产β-葡萄糖醛酸酶混合菌剂的制备方法，操作简单，通过胆汁和胆酸的驯化定向得到在胆汁中存活时间长、繁殖活力高的大肠杆菌菌株；通过牛胆囊仿生动态模拟得到适应胆囊环境变化的大肠杆菌菌株；通过pcr技术、菌液混合、酶活力测定得到β-g活力高的大肠杆菌菌株；通过毒素、毒性结合筛选，得到对动物生长影响最小的大肠杆菌菌株。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明的方法流程图；
图2是本发明的菌株在光镜下的形态图；
图3是本发明的菌株的生长曲线图；
图4是本发明的菌株的β-g活性动态图；
图5是本发明的胆囊菌株的pcr鉴定结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-5，本发明提供一种技术方案：一种高效产β-葡萄糖醛酸酶混合菌剂的制备方法，包括步骤一，新鲜动物胆囊样本采集；步骤二，大肠杆菌分离；步骤三，大肠杆菌鉴定；步骤四，大肠杆菌胆汁存活筛选；步骤五，胆酸多浓度梯度定向诱导培育；步骤六，牛胆囊仿生动态模拟培育；步骤七，大肠杆菌β-g活性测定；步骤八，菌液混合培养；步骤九，动物毒性试验检测；其特征在于：
其中在上述步骤一中，人工无菌摘取鸡、鸭、猪、牛等不同动物胆囊，新鲜动物胆囊样本采集中，所用动物胆囊必须保证新鲜完整、胆囊管结扎且内容物未与外界接触；
其中在上述步骤二中，大肠杆菌分离包括以下步骤：
1)无菌条件下用一次性注射器采集胆囊内胆汁0.1ml接种于伊红美兰琼脂培养基emb，同时各取1ml胆汁接种于10ml，lb液体培养基以增菌；
2)分别置于37℃恒温培养箱培养和37℃恒温摇床，摇床为200r/min，培养16-24h，若emb无菌落生长、lb清亮透明者视为无菌；
3)emb无深紫红色带金属光泽菌落但lb浑浊者，可再取0.1ml，lb培养基转接于emb上37℃培养16-24h；若emb上出现圆形、湿润、光滑、边缘整齐、中等大小的深紫红色带金属光泽菌落视为可疑菌落，用无菌接种环挑取已编号的单个可疑菌落，于emb培养基上进行反复划线分离以得到纯化菌落；
其中在上述步骤三中，大肠杆菌鉴定包括以下步骤：
1)镜检，无菌挑取纯化的单个可疑菌落，用革兰氏染液染色后于光学显微镜下观察，镜检菌落形态为红色短杆状则初步判定为大肠杆菌；
2)pcr扩增，将上一步骤判定为阳性的菌株进行pcr扩增，需要根据genebank上公布的编码β-g的uid，a基因设计一段引物，pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测；
其中在上述步骤四中，大肠杆菌胆汁存活筛选包括以下步骤：
1)将步骤三2)中判定为阳性的菌株用微量移液器吸取8μl，接种于1ml无菌处理后的新鲜牛胆汁中；
2)37℃培养30天后取8μl涂布于伊红美兰琼脂平板，37℃培养，观察是否有菌落生长，若有，则视为该菌株可在牛胆汁中存活；
其中在上述步骤五中，胆酸多浓度梯度定向诱导培育包括以下步骤：
1)使用5号胆盐，胆酸含量70％-85％和无菌处理后的新鲜牛胆汁配成胆酸含量为12％、15％、18％、21％、24％、27％、30％的1ml无菌肉汤；
2)用无菌接种环挑取将步骤四2)中判定为阳性的菌落于1ml的12％胆酸-肉汤培养基中，经37℃恒温培养24h，取一环菌液接种于伊红美蓝琼脂培养基上；
3)若观察到有呈金属光泽的绿色菌落，得到第一代菌株，然后将其置于胆酸含量为15％的胆酸-肉汤培养基中，重复上述步骤，将菌株驯化至能够在含胆酸量为21％以上的无菌肉汤中存活且繁殖；
其中在上述步骤六中，牛胆囊仿生动态模拟培育包括以下步骤：
1)模拟牛胆囊温度的变化:设置温度变化范围：37℃、38℃、39℃、40℃、41℃，用无菌接种环挑取将上一步骤判定为阳性的菌株，接种于1ml无菌新鲜牛胆汁中，置于37℃恒温培养箱培养，每隔8h上调温度1℃，直至温度达到41℃，每次上调前取一环菌液划线于伊红美蓝琼脂培养基，37℃恒温培养24h，检测菌株生存活性；
2)模拟牛胆囊胆红素浓度变化tbr：配置胆红素溶液浓度范围为0.1755mg/ml、0.2048mg/ml、0.2340mg/ml、0.2633mg/ml、0.2925mg/ml，用无菌接种环挑取将上一步骤判定为阳性的菌株接种于胆红素-牛胆汁溶液中，每隔8h上调牛胆汁中胆红素浓度，直至调节到0.2925mg/ml。每次上调前取一环菌液划线于伊红美蓝琼脂培养基，37℃恒温培养24h，检测生存活性；
其中在上述步骤七中，大肠杆菌β-g活性测定包括以下步骤：
1)绘制对硝基酚标准曲线；
2)样品处理：用无菌接种环挑取上一步骤生长最好的单菌落至20mltsb培养基中震荡培养6h后取出，调整菌液浓度为1×108cfu/ml,在5000r/min、4℃条件下离心10min，弃去上清液，用pbs洗涤菌体2-3次，离心弃去上清液后向菌体加入3-4ml，pbs，用超声波细胞破碎机冰浴破碎30-45min，频率为400hz，5000r/min离心10分钟，取上清液备用；
3)酶活性测定：吸取上清液80μl于96孔中，加入等量pnpg底物溶液，作为样品液，36℃保温1h；吸取80μl，pbs于96孔中，加入等量pnpg底物溶液，作为空白对照，36℃保温1h；待各样品保温结束后，取出每孔加入36μl，0.1mol/l的naoh溶液终止反应，用全波长酶标仪在405nm波长下用空白校正零点后测定样品液的吸光度，将吸光度值代入标准曲线方程得出对硝基酚浓度，然后按照下式计算酶的活性单位，β-g酶单位/l(u/l)＝对硝基酚释放量(μmol)/保温时间(h)/被检液量(l)；
其中在上述步骤八中，菌液混合培养包括以下步骤：
1)筛选出以1∶1浓度随机两两配对混合后对于酶活性的作用为协同的大肠杆菌组合，再在这些组合中分别进行1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、8∶1、4∶1、2∶1浓度配比；
2)混合培养后，测定混合菌液酶活力，并与同一组合1∶1浓度配比的混合菌液进行酶活力对比，筛选出能够高产β-g的混合菌液最佳配对及浓度配比；
其中在上述步骤九中，动物毒性试验检测包括以下步骤：
1)将筛选出能够高产β-g酶的混合菌液的组合编号，取3周龄成年小鼠，每组6只，设置两组分别于腹腔注射致病性大肠杆菌或生理盐水，其余组分别于腹腔注射筛选出来的混合菌液，每只1×109cfu/ml，试验饲养三周；
2)试验饲养三周，观察筛选出来的菌种是否为非致病性大肠杆菌，结果表明为非致病性大肠杆菌的菌种保存备用。
以1:1浓度随机两两配对混合后对于酶活性的作用为协同的大肠杆菌组合如下表：
混合菌液进行1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、8∶1、4∶1、2∶1浓度配比，混合培养后，酶活力与同一组合1:1浓度配比的混合菌液进行对比的结果如下表。
基于上述，本发明的优点在于，该一种高效产β-葡萄糖醛酸酶混合菌剂的制备方法，操作简单，通过胆汁和胆酸的驯化定向得到在胆汁中存活时间长、繁殖活力高的大肠杆菌菌株；通过牛胆囊仿生动态模拟得到适应胆囊环境变化的大肠杆菌菌株；通过pcr技术、菌液混合、酶活力测定得到β-g活力高的大肠杆菌菌株；通过毒素、毒性结合筛选，得到对动物生长影响最小的大肠杆菌菌株。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种高效产β-葡萄糖醛酸酶混合菌剂的制备方法，包括步骤一，新鲜动物胆囊样本采集；步骤二，大肠杆菌分离；步骤三，大肠杆菌鉴定；步骤四，大肠杆菌胆汁存活筛选；步骤五，胆酸多浓度梯度定向诱导培育；步骤六，牛胆囊仿生动态模拟培育；步骤七，大肠杆菌β-g活性测定；步骤八，菌液混合培养；步骤九，动物毒性试验检测；其特征在于：
其中在上述步骤一中，人工无菌摘取鸡、鸭、猪、牛等不同动物胆囊；
其中在上述步骤二中，大肠杆菌分离包括以下步骤：
1)无菌条件下用一次性注射器采集胆囊内胆汁0.1ml接种于伊红美兰琼脂培养基emb，同时各取1ml胆汁接种于10ml，lb液体培养基以增菌；
2)分别置于37℃恒温培养箱培养和37℃恒温摇床，培养16-24h，若emb无菌落生长、lb清亮透明者视为无菌；
3)emb无深紫红色带金属光泽菌落但lb浑浊者，可再取0.1ml，lb培养基转接于emb上37℃培养16-24h；若emb上出现圆形、湿润、光滑、边缘整齐、中等大小的深紫红色带金属光泽菌落视为可疑菌落，用无菌接种环挑取已编号的单个可疑菌落，于emb培养基上进行反复划线分离以得到纯化菌落；
其中在上述步骤三中，大肠杆菌鉴定包括以下步骤：
1)镜检，无菌挑取纯化的单个可疑菌落，用革兰氏染液染色后于光学显微镜下观察，镜检菌落形态为红色短杆状则初步判定为大肠杆菌；
2)pcr扩增，将上一步骤判定为阳性的菌株进行pcr扩增，pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测；
其中在上述步骤四中，大肠杆菌胆汁存活筛选包括以下步骤：
1)将步骤三2)中判定为阳性的菌株用微量移液器吸取8μl，接种于1ml无菌处理后的新鲜牛胆汁中；
2)37℃培养30天后取8μl涂布于伊红美兰琼脂平板，37℃培养，观察是否有菌落生长，若有，则视为该菌株可在牛胆汁中存活；
其中在上述步骤五中，胆酸多浓度梯度定向诱导培育包括以下步骤：
1)使用5号胆盐，胆酸含量70％-85％和无菌处理后的新鲜牛胆汁配成胆酸含量为12％、15％、18％、21％、24％、27％、30％的1ml无菌肉汤；
2)用无菌接种环挑取将步骤四2)中判定为阳性的菌落于1ml的12％胆酸-肉汤培养基中，取一环菌液接种于伊红美蓝琼脂培养基上；
3)若观察到有呈金属光泽的绿色菌落，得到第一代菌株，然后将其置于胆酸含量为15％的胆酸-肉汤培养基中，重复上述步骤，将菌株驯化至能够在含胆酸量为21％以上的无菌肉汤中存活且繁殖；
其中在上述步骤六中，牛胆囊仿生动态模拟培育包括以下步骤：
1)模拟牛胆囊温度的变化:设置温度变化范围：37℃、38℃、39℃、40℃、41℃，用无菌接种环挑取将上一步骤判定为阳性的菌株，接种于1ml无菌新鲜牛胆汁中，置于37℃恒温培养箱培养，每隔8h上调温度1℃，直至温度达到41℃，每次上调前取一环菌液划线于伊红美蓝琼脂培养基，37℃恒温培养24h，检测菌株生存活性；
2)模拟牛胆囊胆红素浓度变化tbr：配置胆红素溶液浓度范围为0.1755mg/ml、0.2048mg/ml、0.2340mg/ml、0.2633mg/ml、0.2925mg/ml，用无菌接种环挑取将上一步骤判定为阳性的菌株接种于胆红素-牛胆汁溶液中，每隔8h上调牛胆汁中胆红素浓度，直至调节到0.2925mg/ml。每次上调前取一环菌液划线于伊红美蓝琼脂培养基，37℃恒温培养24h，检测生存活性；
其中在上述步骤七中，大肠杆菌β-g活性测定包括以下步骤：
1)绘制对硝基酚标准曲线；
2)样品处理：用无菌接种环挑取上一步骤生长最好的单菌落至20mltsb培养基中震荡培养6h后取出，调整菌液浓度为1×108cfu/ml,在5000r/min、4℃条件下离心10min，弃去上清液，用pbs洗涤菌体2-3次，离心弃去上清液后向菌体加入3-4ml，pbs，用超声波细胞破碎机冰浴破碎30-45min，频率为400hz，5000r/min离心10分钟，取上清液备用；
3)酶活性测定：吸取上清液80μl于96孔中，加入等量pnpg底物溶液，作为样品液，36℃保温1h；吸取80μl，pbs于96孔中，加入等量pnpg底物溶液，作为空白对照，36℃保温1h；待各样品保温结束后，取出每孔加入36μl，0.1mol/l的naoh溶液终止反应，用全波长酶标仪在405nm波长下用空白校正零点后测定样品液的吸光度，将吸光度值代入标准曲线方程得出对硝基酚浓度，然后按照下式计算酶的活性单位；其中在上述步骤八中，菌液混合培养包括以下步骤：
1)筛选出以1∶1浓度随机两两配对混合后对于酶活性的作用为协同的大肠杆菌组合，再在这些组合中分别进行1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、8∶1、4∶1、2∶1浓度配比；
2)混合培养后，测定混合菌液酶活力，并与同一组合1∶1浓度配比的混合菌液进行酶活力对比，筛选出能够高产β-g的混合菌液最佳配对及浓度配比；
其中在上述步骤九中，动物毒性试验检测包括以下步骤：
1)将筛选出能够高产β-g酶的混合菌液的组合编号，取3周龄成年小鼠，每组6只，设置两组分别于腹腔注射致病性大肠杆菌或生理盐水，其余组分别于腹腔注射筛选出来的混合菌液，每只1×109cfu/ml，试验饲养三周；
2)试验饲养三周，观察筛选出来的菌种是否为非致病性大肠杆菌，结果表明为非致病性大肠杆菌的菌种保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种高效产β-葡萄糖醛酸酶混合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤一中新鲜动物胆囊样本采集中，所用动物胆囊必须保证新鲜完整、胆囊管结扎且内容物未与外界接触。
3.根据权利要求1所述的一种高效产β-葡萄糖醛酸酶混合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤二2)中摇床为200r/min。
4.根据权利要求1所述的一种高效产β-葡萄糖醛酸酶混合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤三2)中需要根据genebank上公布的编码β-g的uid，a基因设计一段引物。
5.根据权利要求1所述的一种高效产β-葡萄糖醛酸酶混合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤五2)中经37℃恒温培养24h。
6.根据权利要求1所述的一种高效产β-葡萄糖醛酸酶混合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤七3)中β-g酶单位/l(u/l)＝对硝基酚释放量(μmol)/保温时间(h)/被检液量(l)。
技术总结