本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种复合酶消化液及其制备方法和应用。
背景技术：
类器官(organoids)是衍生于干细胞或前体细胞的器官特异性细胞集合。与常规培养在二维环境中的单一细胞类群不同，类器官培养是在三维环境中的特定器官包含的多种细胞类群，其培养体系与体内微环境更为相似，是一种良好的疾病体外模型，甚至可以说类器官是最佳的体外药物筛选模型。
因类器官培养是基于基质胶胶滴，如果需要将类器官收集用于传代冻存或者其他下游应用，首先需要做的是将类器官从凝胶中完整的分离出来。常规的分离方法是利用胰酶进行消化，然而由于类器官的体积是微米级别并且组成单一，因而其本身较为脆弱，在现有的胰酶消化体系消化过程中极易出现形态破裂、细胞活性降低的情况，从而影响后续实验。
技术实现要素：
针对现有类器官消化过程存在的上述问题，本发明旨在提供一种复合酶消化液及其制备方法和应用。本发明的技术方案为：
第一个方面，本发明提供一种复合酶消化液，包括以下终浓度的组分：四型胶原酶100-200u/ml，二型分散酶1-10u/ml，脱氧核糖核酸酶5-20u/ml，pmsf0.1-0.5mm，乙二醇10wt％-20wt％，聚蔗糖5wt％-10wt％，溶剂为无菌水；所述消化液的ph为7.4-8.0。
进一步地，所述消化液还包括金属盐，并且所述金属盐在所述消化液中的终浓度为0.5-20mm。
可选地，所述金属盐为钠、锌、锰、钙、镁、铁的硝酸盐及氯化盐中的至少一种。
优选地，所述金属盐为cacl2和mgcl2，两者在所述消化液中的终浓度分别为1-10mm和1-2mm。
进一步地，所述消化液还包括甘油1wt％-5wt％。
进一步地，所述消化液还包括ph调节剂。
优选地，所述ph调节剂为naoh。
第二个方面，本发明提供上述复合酶消化液的制备方法，包括：
按照消化液各组分的终浓度配料；
先将四型胶原酶、二型分散酶、脱氧核糖核酸酶ⅰ、pmsf、聚蔗糖溶于无菌水中，然后加入乙二醇混合均匀；
调节ph至7.4-8.0，过滤除菌后即得。
进一步地，当所述消化液包含金属盐时，还包括将金属盐溶于所述的无菌水的过程。
进一步地，当所述消化液包含甘油时，还包括将甘油加入至混合了乙二醇的溶液的过程。
第三个方面，本发明提供上述复合酶消化液及其制备方法在类器官技术中的应用。
第四个方面，本发明提供一种用于病理或传代研究的类器官的消化方法，包括：
去除类器官培养液中的上清液后加入上述消化液混匀；
于2-8℃静置消化10-30分钟，期间每间隔10分钟吹打分散；
加入edta溶液终止消化，离心弃上清，得到消化完成的类器官。
第五个方面，本发明提供一种用于体外药物筛选或基因测序的类器官的消化方法，包括：
去除类器官培养液中的上清液后加入上述消化液混匀；
室温静置消化5-15min，期间每间隔3分钟吹打分散；
加入edta溶液终止消化，离心弃上清，得到均匀大小的细胞团。
进一步地，所述edta溶液的浓度为0.1～1mg/ml。
优选地，所述edta溶液的浓度为0.5mg/ml。
进一步地，所述离心处理的速度为：1000～1500rpm，时间为3～6min。
本发明的消化液与传统消化液比，具有以下几个优点：
1、本发明消化液既能得到完整的类器官又能得到分散均一大小的细胞团，传统消化液只能得到细胞团，并且本发明消化液消化时间短、操作方便、效果稳定。
2、本发明消化液在2-8℃消化时可以有效减少消化过程中对类器官的损伤，维持类器官完整的形态结构与功能。
3、本发明消化液在室温消化时可更温和的将类器官均匀消化，细胞团大小更均一，细胞死亡率低存活率高，可回收得到更多的细胞。
附图说明
图1为本发明实施例12获得的消化完成的类器官的结构形貌图。
图2为本发明实施例13获得的消化完成的类器官的结构形貌图。
图3为本发明实施例14获得的消化完成的类器官的结构形貌图。
图4为本发明实施例15获得的消化完成的类器官的结构形貌图。
图5为本发明实施例16获得的消化完成的类器官的结构形貌图。
图6为本发明实施例17获得的消化完成的类器官的结构形貌图。
图7为本发明实施例18获得的消化完成的类器官的结构形貌图。
图8为本发明实施例19获得的消化完成的类器官的结构形貌图。
图9为本发明实施例20获得的消化完成的类器官的结构形貌图。
图10为本发明实施例21获得的消化完成的类器官的结构形貌图。
图11为本发明实施例22获得的消化完成的类器官的结构形貌图。
图12为本发明对比例1获得的消化完成的类器官的结构形貌图。
图13为本发明对比例2获得的消化完成的类器官的结构形貌图。
图14为本发明对比例3获得的消化完成的类器官的结构形貌图。
图15为本发明对比例4获得的消化完成的类器官的结构形貌图。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
本实施例提供一种复合酶消化液，包括以下终浓度的组分：四型胶原酶200u/ml，二型分散酶2u/ml，脱氧核糖核酸酶20u/ml，pmsf0.1mm，乙二醇10wt％，聚蔗糖10wt％，溶剂为无菌水；所述消化液的ph为7.4。该消化液的制备方法包括：按照消化液各组分的终浓度配料；先将四型胶原酶、二型分散酶、脱氧核糖核酸酶ⅰ、pmsf、聚蔗糖溶于无菌水中，然后加入乙二醇混合均匀；调节ph至7.4，过滤除菌后即得，将消化液保存在-20℃冰箱中备用。
实施例2
本实施例提供一种复合酶消化液，与实施例1的区别在于还包括：cacl22mm，mgcl21mm。该消化液的制备方法包括：按照消化液各组分的终浓度配料；先将四型胶原酶、二型分散酶、脱氧核糖核酸酶ⅰ、pmsf、cacl2、mgcl2、聚蔗糖溶于无菌水中，然后加入乙二醇混合均匀；调节ph至7.4，过滤除菌后即得，将消化液保存在-20℃冰箱中备用。
实施例3
本实施例提供一种复合酶消化液，与实施例1的区别在于还包括：甘油1wt％。该消化液的制备方法包括：按照消化液各组分的终浓度配料；先将四型胶原酶、二型分散酶、脱氧核糖核酸酶ⅰ、pmsf、聚蔗糖溶于无菌水中，然后加入乙二醇和甘油混合均匀；调节ph至7.4，过滤除菌后即得，将消化液保存在-20℃冰箱中备用。
实施例4
本实施例提供一种复合酶消化液，与实施例1的区别在于还包括：cacl22mm，mgcl21mm，甘油1wt％。该消化液的制备方法包括：按照消化液各组分的终浓度配料；先将四型胶原酶、二型分散酶、脱氧核糖核酸酶ⅰ、pmsf、cacl2、mgcl2、聚蔗糖溶于无菌水中，然后加入乙二醇和甘油混合均匀；调节ph至7.4，过滤除菌后即得，将消化液保存在-20℃冰箱中备用。
实施例5
本实施例提供一种复合酶消化液，包括以下终浓度的组分：四型胶原酶100u/ml，二型分散酶1u/ml，脱氧核糖核酸酶5u/ml，pmsf0.5mm，cacl210mm，mgcl22mm，乙二醇20wt％，聚蔗糖8wt％，甘油5wt％，溶剂为无菌水；所述消化液的ph为8.0。制备方法同实施例3。
实施例6
本实施例提供一种复合酶消化液，包括以下终浓度的组分：四型胶原酶150u/ml，二型分散酶10u/ml，脱氧核糖核酸酶10u/ml，pmsf0.3mm，cacl25mm，mgcl21.5mm，乙二醇15wt％，聚蔗糖5wt％，甘油3wt％，溶剂为无菌水；所述消化液的ph为7.6。制备方法同实施例3。
实施例7
本实施例与实施例4的区别在于：通过kno33mm替换cacl22mm和mgcl21mm。
实施例8
本实施例与实施例4的区别在于：金属盐为cacl23mm。
实施例9
本实施例与实施例4的区别在于：金属盐为mgcl23mm。
实施例10
本实施例与实施例5的区别在于：通过fecl312mm替换cacl210mm和mgcl22mm。
实施例11
本实施例与实施例6的区别在于：通过mncl26.5mm替换cacl25mm和mgcl21.5mm。
实施例12
本实施例提供一种用于体外药物筛选研究的人肺癌类器官的消化方法，采用实施例1的消化液，包括以下步骤：
(1)将人肺癌类器官培养皿中的上清小心吸出后加入消化液2-3ml，静置1分钟后，将胶滴吹散；
(2)于室温静置消化5-15分钟，期间每间隔3分钟轻轻吹打分散；
(3)加入3ml0.5mg/ml的edta溶液终止消化，离心弃上清，得到消化完成的细胞团，其结构形貌如图1所示。
图1中显示获得了细胞团，但消化过程不是太均一，大小差异比较明显，并且还存在单细胞过度消化的情况。
实施例13
本实施例提供一种用于体外药物筛选研究的人胃癌类器官的消化方法，采用实施例2的消化液，过程同实施例12，其结构形貌如图2所示。
图2中显示获得了细胞团，但还存在部分细胞团发生过度消化，过度消化产生的死细胞释放出来胶质状的dna，形成了絮状物，说明消化酶发挥了最佳活性。
实施例14
本实施例提供一种用于体外药物筛选研究的人肝癌类器官的消化方法，采用实施例3的消化液，过程同实施例12，其结构形貌如图3所示。
图3中显示获得了细胞团，但细胞团消化过程不是太均一，大小差异比较明显。
实施例15
本实施例提供一种用于体外药物筛选研究的人肺癌类器官的消化方法，采用实施例4的消化液，过程同实施例12，其结构形貌如图4所示。
图4中显示获得了完整的细胞团，并且细胞团消化均一，大小相对均匀，类器官活性良好。
实施例16
本实施例提供一种用于病理研究的小鼠结肠类器官的消化方法，采用实施例5的消化液，过程与实施例12类似，与实施例12的区别在于：于2-8℃静置消化10-30分钟，期间每间隔10分钟轻轻吹打分散，其结构形貌如图5所示。
图5中显示获得了完整的类器官，并且类器官大小差异小，类器官活性良好。
实施例17
本实施例提供一种用于病理研究的小鼠小肠类器官的消化方法，采用实施例6的消化液，过程同实施例16，其结构形貌如图6所示。
图6中显示获得了完整的类器官，并且类器官大小差异较小，活性良好。
实施例18
本实施例提供一种用于病理研究的小鼠大肠类器官的消化方法，采用实施例7的消化液，过程同实施例16，其结构形貌如图7所示。
图7中显示获得了完整的类器官，并且类器官大小差异较小，活性较好。
实施例19
本实施例提供一种用于病理研究的小鼠肝脏类器官的消化方法，采用实施例8的消化液，过程同实施例16，其结构形貌如图8所示。
图8中显示获得了完整的类器官，并且类器官大小差异较小，活性较好。
实施例20
本实施例提供一种用于病理研究的小鼠肝脏类器官的消化方法，采用实施例9的消化液，过程同实施例16，其结构形貌如图9所示。
图9中显示获得了完整的类器官，并且类器官大小差异较小，活性中等。
实施例21
本实施例提供一种用于病理研究的小鼠肺芽类器官的消化方法，采用实施例10的消化液，过程同实施例16，其结构形貌如图10所示。
图10中显示获得了完整的类器官，并且类器官大小差异较小，活性较好。
实施例22
本实施例提供一种用于病理研究的小鼠肺芽类器官的消化方法，采用实施例11的消化液，过程同实施例16，其结构形貌如图11所示。
图11中显示获得了完整的类器官，并且类器官大小差异较小，活性中等。
实施例1-3的消化液缺少甘油和/或金属盐，实施例4-11的消化液则包含了甘油和金属盐，并且实施例4-6采用的金属盐为氯化镁和氯化钙。通过实施例12-22的结果可以看出，如果缺少甘油和金属盐，尽管也能获得类器官，但极易发生部分类器官过度消化的情况，并且获得的类器官大小差异较大，不均匀。这说明消化液中加入金属盐和甘油可以充分增加消化液的活性，尤其金属盐采用氯化钙和氯化镁效果最好，既能保护类器官不过度消化，又能得到完整的类器官，并且还能得到分散均一大小的细胞团。
对比例1
本对比例与实施例15的区别在于消化液中不含有四型胶原酶。
图12中显示获得了完整的细胞团，但大小差异较大，活性良好，消化液成分中的金属盐让酶发挥了最佳活力，而甘油的成份也很好的保护细胞团不过度消化，但缺少四型胶原酶，能得到较完整的细胞团，难以得到分散均一大小的细胞团，说明消化液中的四型胶原酶必不可少。
对比例2
本对比例与实施例15的区别在于消化液中不含有二型分散酶。
图13中显示获得了完整的细胞团，但大小差异明显，活性良好，消化液成分中的金属盐让酶发挥了最佳活力，而甘油的成份也很好的保护细胞团不过度消化，但缺少二型分散酶，能得到较完整的细胞团，细胞团发生聚集现象，且难以得到分散均一大小的细胞团，说明消化液中的二型分散酶必不可少。
对比例3
本对比例与实施例15的区别在于消化液中不含有脱氧核糖核酸酶ⅰ。
图14中显示获得了完整的细胞团，但大小差异明显，活性良好，消化液成分中的金属盐让酶发挥了最佳活力，而甘油的成份也很好的保护细胞团不过度消化，但缺少脱氧核糖核酸酶ⅰ，能得到较完整的细胞团，但难以得到分散均一大小的细胞团，说明消化液中的脱氧核糖核酸酶ⅰ必不可少。
对比例4
本对比例与实施例15的区别在于消化液中将甘油替换成乙二醇。
图15中显示细胞团消化过度，大部分消化成单细胞状态，活性较差，消化液成分中的金属盐让酶发挥了最佳活力，但缺少甘油保护细胞团不过度消化，能得到分散均一大小的细胞团，难以能得到较完整的细胞团，说明消化液中的甘油必不可少。
综上，本发明消化液既能得到完整的类器官又能得到分散均一大小的细胞团，传统消化液只能得到细胞团，并且本发明消化液消化时间短、操作方便、效果稳定。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
1.一种复合酶消化液，其特征在于：包括以下终浓度的组分：四型胶原酶100-200u/ml，二型分散酶1-10u/ml，脱氧核糖核酸酶5-20u/ml，pmsf0.1-0.5mm，乙二醇10wt％-20wt％，聚蔗糖5wt％-10wt％，溶剂为无菌水；所述消化液的ph为7.4-8.0。
2.根据权利要求1所述的一种复合酶消化液，其特征在于：所述消化液还包括金属盐，并且所述金属盐在所述消化液中的终浓度为0.5-20mm。
3.根据权利要求2所述的一种复合酶消化液，其特征在于：所述金属盐为钠、锌、锰、钙、镁、铁的硝酸盐及氯化盐中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的一种复合酶消化液，其特征在于：所述消化液还包括甘油1wt％-5wt％。
5.根据权利要求1所述的一种复合酶消化液，其特征在于：所述消化液还包括ph调节剂。
6.权利要求1所述的一种复合酶消化液的制备方法，其特征在于：包括：
按照消化液各组分的终浓度配料；
先将四型胶原酶、二型分散酶、脱氧核糖核酸酶ⅰ、pmsf、聚蔗糖溶于无菌水中，然后加入乙二醇混合均匀；
调节ph至7.4-8.0，过滤除菌后即得。
7.根据权利要求6所述的一种复合酶消化液的制备方法，其特征在于：当所述消化液包含金属盐时，还包括将金属盐溶于所述的无菌水的过程。
8.根据权利要求6所述的一种复合酶消化液的制备方法，其特征在于：当所述消化液包含甘油时，还包括将甘油加入至混合了乙二醇的溶液的过程。
9.一种用于病理或传代研究的类器官的消化方法，其特征在于：包括：
去除类器官培养液中的上清液后加入权利要求1～5任意一项所述的消化液混匀；
于2-8℃静置消化10-30分钟，期间每间隔10分钟吹打分散；
加入edta溶液终止消化，离心弃上清，得到消化完成的类器官。
10.一种用于体外药物筛选或基因测序的类器官的消化方法，其特征在于：包括：
去除类器官培养液中的上清液后加入权利要求1～5任意一项所述的消化液混匀；
室温静置消化5-15min，期间每间隔3分钟吹打分散；
加入edta溶液终止消化，离心弃上清，得到均匀大小的细胞团。
技术总结