一种从脂肪组织中提取CD90高表达目的细胞的方法与流程

本发明涉及生物医药
技术领域：
，具体涉及一种从脂肪组织中提取cd90高表达目的细胞的方法。
背景技术：
：cd90是免疫球蛋白超家族中的一员，相对分子质量为（25~37）×103，主要通过甘油二酯锚定于糖基磷脂酰肌醇的羧基端从而附着在细胞膜上。cd90作为一种细胞表面的糖蛋白分子，在成纤维细胞、造血干细胞、神经细胞等许多类型的细胞中均有表达，关对细胞与细胞间，细胞与间质间的反应起着调节作用。目前提取cd90高表达目的细胞的方法主要有传统的脂肪组织打散后流式细胞分离法，但普遍存在提取纯度不高的问题。技术实现要素：本发明的目的是提供一种从脂肪组织中提取cd90高表达目的细胞的方法，以解决现有技术中cd90高表达目的细胞提取纯度不高的问题。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供了一种从脂肪组织中提取cd90高表达目的细胞的方法，包括：步骤s1，去除脂肪组织中的杂质细胞，进行酶消化和初步目的细胞分离；步骤s2，对初步分离的目的细胞进行原代培养，分离去除杂细胞；步骤s3，目的细胞收获。进一步地，在所述步骤s1中，将脂肪组织转移至无菌50ml离心管中，向其中加入适量（优选脂肪组织：生理盐水比例为1:1且离心管内液体总量不超过40ml）生理盐水，用吸管吹打10~20次，静置1min，然后用吸管将组织下层的液体吸出，如此反复直到所吸出的液体呈透明状，不带有血细胞为止。进一步地，在所述步骤s1中，向含有脂肪组织的离心管中以体积比1:5的比例加入0.3%的i型胶原酶，然后添加含钙镁离子的pbs定容至30ml，将离心管密封置于37℃恒温摇床中，以180rpm振荡消化30min。进一步地，在所述步骤s1中，消化完成后，吸出离心管中的下层液体，通过100µm滤网过滤到一个新的50ml离心管中，以1500rpm离心10min，将细胞沉淀以生理盐水重悬，以1500rpm离心10min再洗涤一次，弃上清，得到初步分离的目的细胞。进一步地，所述步骤s2包括：对初步分离的目的细胞进行计数后，以3×10^6个细胞/ml的密度，加入含10%胎牛血清的α-mem细胞培养基并吹悬3-6次，置于通气盖培养瓶中，将培养瓶放入37℃5%co2培养箱中；培养3-4天，保持培养瓶物理静止。进一步地，所述步骤s2中，目的细胞呈贴壁生长时，使用10mlpbs清洗培养瓶3次，去除悬浮细胞和死细胞等杂质细胞。进一步地，所述步骤s3包括：使用10ml生理盐水，清洗培养瓶2次；吸弃瓶中生理盐水，加入2ml胰酶消化液，37℃镜下观察消化，当细胞开始回缩变圆后，用0.22µm滤器过滤，并终止消化，（轻柔）吹打底面2-3次后收集所有液体入离心管中；加入10ml生理盐水，（轻柔）吹打底面2-3次后，将生理盐水一同转移至同一离心管中；1200转/分钟离心8分钟，弃上清，得目的细胞。优选地，使用前，将胰酶消化液、生理盐水和新鲜培养基放置到37℃水浴锅中3分钟。本发明的有益效果如下：本发明提供的一种从脂肪组织中提取cd90高表达目的细胞的方法，可有效地去除终产物中红细胞、血小板、悬浮淋巴细胞、非贴壁细胞等的数量，分离cd90高表达目的细胞纯度可达98%以上，具有极大的科研和临床研究价值。附图说明图1为本发明一种从脂肪组织中提取cd90高表达目的细胞的方法的流程图。图2为本发明实施例1流式检测结果图。图3为本发明比较例1流式检测结果图。具体实施方式下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，如未有特殊说明，实施例中各个步骤均可采用本领域现有材料及常规技术手段来实现。实施例1本实施例从脂肪组织中提取cd90高表达目的细胞的方法中，采用了脂肪组织酶消化、原代培养、目的细胞收获法。具体包括以下步骤：步骤s1，对人脂肪组织去除杂质细胞，进行酶消化和初步目的细胞分离。s1-1.将20g人脂肪组织转移至无菌的50ml离心管中，向其中加入20ml生理盐水，用吸管吹打10~20次，然后静置1min，用吸管将组织下层的液体吸出，如此反复直到所吸出的液体呈透明状，不带有血细胞为止；s1-2.向含有脂肪组织的离心管中以体积比1:5的比例加入0.3%的i型胶原酶，然后添加含钙镁离子的pbs（ph7.4）定容至30ml，将离心管密封置于37℃恒温摇床中，以180rpm振荡消化30min；s1-3.吸出离心管中的下层液体，通过100µm滤网过滤到一个新的50ml离心管中，以1500rpm离心10min，将细胞沉淀以生理盐水重悬，以1500rpm离心10min再洗涤一次，弃上清。步骤s2，对初步分离的目的细胞进行原代培养，分离去除杂细胞。对细胞进行计数后，以3×10^6个细胞/ml的密度，加入含10%胎牛血清的α-mem细胞培养基并吹悬3-6次，置于通气盖培养瓶中，将培养瓶放入37℃5%co2培养箱中；培养3-4天，保持培养瓶物理静止。第4天后目的细胞呈贴壁生长情况，使用10mlpbs清洗培养瓶3次，去除悬浮细胞和死细胞等杂质细胞。步骤s3，目的细胞收获。将胰酶消化液、生理盐水和新鲜培养基（lonza12-725f）放置到37℃水浴锅中3分钟；使用10ml生理盐水，清洗培养瓶2次；吸弃瓶中生理盐水，加入2ml胰酶消化液（gibco25200-072），37℃镜下观察消化，当细胞开始回缩变圆后，用0.22µm滤器过滤；加入少量新鲜培养基至培养瓶中终止消化，轻柔吹打底面2~3次后收集所有液体入离心管中；加入10ml生理盐水，轻柔吹打底面2-3次后，将生理盐水一同转移至同一离心管中；配平后1200转/分钟离心8分钟，弃上清，细胞沉淀用适量生理盐水重悬，取样进行流式检测。比较例1采用传统的脂肪组织打散后流式细胞分离法。步骤如下：1、将20g小块脂肪组织静置处理，使膨胀液和筛分后的脂肪根据其比重不同自然分离，通过筛分网得到脂肪组织，并通过注射器将脂肪组织吸入注射器，得到小块脂肪组织微粒；2、制备脂肪单细胞悬液，取小块脂肪组织微粒用细胞分离试剂进行消化，加血清终止消化，打散后通过离心分层，去除上清液；用缓冲液重悬细胞，过滤网获得单细胞悬液；3、流式细胞分选，从获得的细胞群中富集cd90 细胞；4、cd90 细胞培养，将获得的cd90 细胞接种到培养皿中，经贴壁筛选法纯化细胞、并采用无血清培养基进行体外培养，得到cd90 细胞。测试结果详见表1。表1.实施例1和比较例1流式检测结果组别有核细胞占比cd90高表达细胞占比cd73阳性率cd105阳性率实施例181.4