本发明属于细胞生物学、干细胞生物学(细胞重编程)、医学、药学交叉领域；更具体地，本发明涉及一种不导入、不使用任何外源基因/转录因子/microrna(mirna)基因，或其结合有载体的基因，或其rna、蛋白质及多肽等诱导因子，也不使用任何细胞因子或生长因子，仅用化学小分子(简称小分子)组合，化学诱导体内外成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的化学小分子组合物及其方法。
背景技术：
中国是肝病大国，甲肝、乙肝、脂肪肝、酒精肝、肝硬化(肝纤维化)等患病人数众多，而其中由各种肝病、化学药物、创伤等多种原因导致的急慢性肝衰竭，病情危重，病死率高。肝移植是治疗终末期肝病或肝功能衰竭的有效手段，然而肝源的缺乏使很多患者，尤其是急性肝衰竭患者失去治疗机会。肝细胞移植、生物人工肝和源于生物工程技术的全肝移植是肝移植的重要替代手段而被关注和研究，如何获得足够数量的可用于临床治疗的人肝细胞来源就成为国际研究热点。目前，获得功能肝细胞的途径主要有以下方式：1)从供肝分离原代肝细胞；2)由干细胞或诱导多能干细胞等定向分化为肝细胞；3)由成纤维细胞等体细胞转分化为肝细胞等。从供肝分离原代肝细胞因肝源的严重缺乏使其应用受限。干细胞定向诱导分化获得功能肝细胞，因为干细胞的无限增殖潜能而成为最可能获得足够数量肝细胞的有效手段和途径。然而现有的定向分化方法存在以下一个或者多个缺陷：如分化效率低、转化纯度低、分化获得的肝细胞功能欠缺、可能产生免疫排斥反应、存在干性细胞分化不彻底而有潜在致癌风险以及成本高昂等，不能满足临床的需求。
成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞，因为避免了多潜能干细胞重编程为ips细胞(inducedpluripotentstemcell)及其应用的潜在风险而受到关注。但目前已有的将成纤维细胞转分化为肝细胞方法采用的仍然是导入外源基因/转录因子//microrna(mirna)基因，等诱导因子，结合化学小分子、各种细胞因子或生长因子等替代因子，组成的多种诱导因子组合物，诱导成纤维细胞转分化肝细胞。因导入外源基因或转录因子，存在破坏原有基因结构，故有致癌或致病风险，这使其仍然很难临床应用；且还存在操作复杂，实验环节增加，质量难以控制，成本增加，临床应用风险增加等等缺陷。因此，如何避免导入外源基因/转录因子/microrna基因等诱导因子，仅用化学小分子，化学诱导成纤维细胞直接重编程为肝细胞，并克服上述导入外源基因/转录因子/microrna基因诱导的定向分化、ips细胞重编程，或转分化肝细胞方法的缺陷，是肝细胞临床应用亟待解决的瓶颈问题。而成纤维细胞或纤维细胞异常导致的纤维化疾病如肝硬化(肝纤维化)，目前临床更是缺乏有效治疗药物和手段，亟需研发有效的新方法及新药物。
细胞重编程(cellreprogramming)是细胞从一种类型向另外一种类型的转换，是通过靶向诱导调控特定细胞信号通路或表观遗传修饰改变，来改变细胞命运的过程。所谓表观遗传是指dna序列/结构不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变。诱导细胞重编程包括：(1)诱导分化的细胞逆转恢复到多能或全能性状态的诱导多潜能干细胞(ips细胞)重编程；(2)不经过多潜能干细胞阶段，从一种分化细胞类型直接转化为另一种分化细胞类型的细胞直接重编程(又称：转分化/谱系重编程)。
化学诱导细胞直接重编程(转分化)：是在不导入、不使用任何外源基因/转录因子/microrna(mirna)基因，及其rna、蛋白质及多肽等诱导因子；仅使用化学小分子靶向诱导调控细胞信号通路及表观遗传修饰，使其表观遗传修饰发生变化，以改变细胞的基因表达谱，将一种分化细胞直接转变为另一种分化细胞的过程。包括：(1)化学诱导多潜能干细胞重编程(hongkuideng等，science.341,651-4，2013)；(2)化学诱导细胞直接重编程(转分化/谱系重编程)(lix等，cellstemcell；17(2):195-203，2015；huw等，cellstemcell.17(2):204-212，2015)。
自从日本科学家山中伸弥(shinyayamanaka)于2006年利用病毒载体将四个转录因子(基因)oct4(又称oct，oct3，或oct-3多肽表达因子等)、sox2、klf4和c-myc的诱导组合，导入分化的体细胞中，通过诱导多潜能干细胞重编程获得ips细胞以来，由于外源导入转录因子/基因，存在破坏细胞原基因序列稳定，可导致突变致癌风险，以及细胞重编程转化率低、稳定性差、操作复杂等缺陷，因此诱导细胞重编程方法在不断改进，已逐步改为非整合以及仅导入1-2个外源转录因子诱导，结合使用microrna(mirna)基因及其rna、蛋白多肽、化学小分子、细胞因子、生长因子等替代转录因子，组成多种因子诱导组合物诱导细胞重编程；而导入的外源转录因子/基因，是必须要在重编程过程中，首先使用基因载体导入外源转录因子/基因诱导起始细胞，同时将不需使用基因载体的其他组份如：化学小分子、各种生长因子、细胞因子等，同时、同培养条件诱导，才能重编程出目的细胞。因此，导入的外源诱导转录因子/基因，由于其不可替代性，仍是诱导重编程组合物的必需且最重要的诱导因子成分。
由于化学小分子(简称小分子)属于靶向性分子化合物，能够靶向诱导调控特定的信号通路和表观遗传，使一种细胞转化为另一种细胞；且成药性好、成本低、稳定性好、操作简单，因此成为替代诱导转录因子的最佳候选者；因此，化学诱导细胞重编程，就成为干细胞科研领域的重要目标之一。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种在不导入、不使用任何外源基因/转录因子/microrna(mirna)基因，及其rna、蛋白质或多肽等诱导因子；也不使用任何细胞因子或生长因子，仅使用由2种(类)化学小分子抑制剂：gsk3β抑制剂和hmt抑制剂组成的诱导组合物，体内外化学诱导调控成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的小分子诱导组合物及方法。
本发明是在本发明人之前已公开的发明：仅使用3种(gsk3β抑制剂、g9ahmt抑制剂、tgfβ抑制剂)化学小分子诱导人成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的化学小分子组合物及其方法基础上的进一步创新发明。
本发明人发现，尽管组成该小分子诱导组合物的2种小分子(gsk3β抑制剂、hmt抑制剂)，包括可添加的tgfβ抑制剂，单独存在时并不具有诱导调控成纤维细胞转分化为肝细胞的功能，但它们作为组合物联合应用时却效果卓著。
该化学小分子组合物的用途包括：用于制备体内诱导原位成纤维细胞转分化为肝细胞、以其原位转分化肝细胞效应减少或降低纤维化组织或器官的纤维化，因此可添加药物载体或赋型剂研发制备成临床治疗纤维化疾病(如肝硬化/肝纤维化)的药物/前体药物/药物组合物；或，制备诱导成纤维细胞转分化肝细胞的试剂或培养基；或用于将成纤维细胞转分化为肝细胞，以制备转化肝细胞，为科研应用、医药应用及临床应用如肝细胞移植治疗肝衰竭提供肝细胞源。
该发明的先进性、创新性在于：本发明的仅由2种化学小分子(gsk3β抑制剂和hmt抑制剂)组成的诱导成纤维细胞转分化为肝细胞组合物与之前本发明人发明的3种小分子(gsk3β抑制剂、g9ahmt抑制剂、tgfβ抑制剂)组成的诱导成纤维细胞转分化为肝细胞的组合物及其方法相比较，前者不仅具有3种小分子组合物诱导成纤维细胞转分化肝细胞所具备的先进性和创新性外，还具有：(1)前者与后者体外诱导成纤维细胞转分化为肝细胞效果相同或相近；但前者体内原位诱导成纤维细胞转分化肝细胞及其效应，降低或改善成纤维细胞/纤维细胞异常相关疾病如肝纤维化疾病的效果与后者相同或更佳；(2)前者与后者的小分子组合结构不同；2个小分子组成的组合物的组成成分更少，组合结构更简单，成药性更好，产生副作用的风险更低，开发成本价格更低，更容易开发为相关疾病药物；(3)前者小分子组合物的组成成分hmt抑制剂中的有效化学小分子种类增加，数量更多，候选药物化学小分子的选择范围更广。
在本发明的第一方面，提供一种用于化学诱导体内外成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的化学小分子组合物。所述的化学小分子组合物只包括化学小分子抑制剂：gsk3β抑制剂和组蛋白甲基转移酶(histonemethyltransferase，hmt)抑制剂；或，所述的小分子组合物仅由化学小分子抑制剂：gsk3β抑制剂和hmt抑制剂组成；
其中，所述的成纤维细胞中不导入或不使用任何外源基因/转录因子/microrna(mirna)基因，及其rna、蛋白质或多肽等诱导因子；或，所述的化学小分子组合物中不含有或不使用任何外源基因/转录因子/microrna(mirna)基因，及其转录的rna，或其翻译的蛋白质及多肽等诱导因子；也不含有或不使用任何细胞因子或生长因子；
在一个优选例中，所述化学小分子hmt抑制剂包括(但不限于)：g9a组蛋白甲基转移酶(g9ahmt)抑制剂、ezh2组蛋白甲基转移酶(ezh2hmt)抑制剂；或所述化学小分子组合物包括：
化学小分子gsk3β抑制剂和hmt抑制剂(g9ahmt抑制剂/ezh2hmt抑制剂)；或仅由gsk3β抑制剂和g9ahmt抑制剂/ezh2hmt抑制剂组成；
在一个优选例中，所述的化学小分子组合物包括：化学小分子抑制剂：gsk3β抑制剂和g9ahmt抑制剂/ezh2hmt抑制剂；或，所述的化学小分子组合物：仅由化学小分子抑制剂：gsk3β抑制剂和g9ahmt抑制剂或ezh2hmt抑制剂组成。
在一个优选例中，所述的化学小分子组合物还可添加包括化学小分子抑制剂：tgfβ抑制剂；或，所述的组合物还可由化学小分子抑制剂：gsk3β抑制剂、hmt抑制剂(g9ahmt抑制剂/ezh2hmt抑制剂)和tgfβ抑制剂组成。
在一个优选例中，所述的化学小分子组合物包括：由化学小分子抑制剂：gsk3β抑制剂、g9ahmt抑制剂/ezh2hmt抑制剂、tgfβ抑制剂组成的化学小分子诱导组合物。
在一个优选例中，所述的化学小分子组合物包括：由化学小分子抑制剂：gsk3β抑制剂和g9ahmt抑制剂/ezh2hmt抑制剂组成的化学小分子诱导组合物；或，
所述的化学小分子组合物包括：由化学小分子抑制剂：gsk3β抑制剂、g9ahmt抑制剂/ezh2hmt抑制剂、tgfβ抑制剂组成的化学小分子诱导组合物。
在一个优选例中，所述的化学小分子组合物，其中化学小分子抑制剂：gsk3β抑制剂、hmt抑制剂、tgfβ抑制剂为：
gsk3β抑制剂：5-80重量份，较佳地10-70重量份；或溶液状态下终浓度为0.1-20μm，较佳地0.5-10μm；
hmt抑制剂：0.1-50重量份，较佳地0.5-40重量份；或溶液状态下终浓度为0.01-20μm，较佳地0.05-10μm；或
tgfβ抑制剂：0.1-50重量份，较佳地0.5-40重量份，或溶液状态下终浓度为0.05-10μm。
在一个优选例中，所述的化学小分子组合物，按照重量份比，所述的小分子抑制剂：gsk3β抑制剂(如chir99021、licl、chir-98014)和hmt抑制剂【g9ahmt抑制剂(如bix01294、unc0638、unc0642)/ezh2hkmt抑制剂(如epz005687、gsk343、unc1999)】为(5-80)﹕(0.1-50)；或溶液状态下摩尔浓度比为(0.1-20)﹕(0.01-20)；或
按照重量份比，所述的gsk3β抑制剂(如chir99021、licl、chir-98014)、hmt抑制剂【g9ahmt抑制剂(如bix01294、unc0638、unc0642)/ezh2hkmt抑制剂(如epz005687、gsk343、unc1999)】和tgfβ抑制剂(如sb431542、a83-01、repsox)为(5-80)﹕(0.1-50)﹕(0.1-50)；或溶液状态下摩尔浓度比为(0.1-20)﹕(0.01-20)﹕(0.01-20)。
在另一优选例中，上述的小分子组合物，所述的小分子组合物还可包含药学上可接受的载体或赋形剂；或添加包括有机溶剂、生理盐水、缓冲液、细胞基础培养基等载体或赋形剂。
在另一优选例中，小分子gsk3β抑制剂、hmt抑制剂(g9ahmtase抑制剂/ezh2hmt抑制剂)；或gsk3β抑制剂、hmt抑制剂(g9ahmt抑制剂/ezh2hmt抑制剂)和tgfβ抑制剂，相加的重量占组合物总重量的0.01～99.9％；更佳地为50～99.9％；溶液状态下为0.01～50％，如0.01％，1％，5％，10％，20％，30％等。
上述重量份比的重量单位可以是：千克(kg)、毫克(mg)、微克(μg)等任一重量单位；摩尔浓度比的摩尔单位可以是：摩(m)、毫摩(mm)、微摩(μm)等任一摩尔浓度单位。
所述的小分子组合物应用于大动物和病人时，按小动物使用剂量通过相应的专业换算公式，换算出大动物或人的有效使用剂量(包括固态或溶液态的剂量换算)，也属于本发明的保护范围。
在另一优选例中，所述的化学小分子抑制剂：gsk3β抑制剂，指能够靶向抑制gsk3β信号通路的抑制剂总称，包括但不限于：chir-99021、bio、licl、im-12、tws119、1-azakenpaullone、chir-98014、tideglusib、ar-a014418、ly2090314、sb216763、azd1080，以及诱导抑制gsk3β信号通路的其他gsk3β小分子抑制剂。或与它们等效的药剂制品、类似物、异构体和/或其盐、水合物或前体，或其组合；较佳地为gsk3β抑制剂chir-99021、licl、bio、ly2090314。
所述化学小分子抑制剂：hmt抑制剂，包括(但不限于)：g9ahmt抑制剂或ezh2hmt抑制剂，以及抑制hmt的其他hmt小分子抑制剂；或与它们等效的药剂制品、类似物、异构体和/或其盐、水合物或前体，或其组合；较佳地为g9ahmt抑制剂、ezh2hmt抑制剂。
所述的化学小分子g9ahmt抑制剂，指能够靶向抑制g9ahmt的抑制剂总称，包括但不限于：bix01294、unc0638、a-366、unc0631、brd4770、unc0224、unc0646、unc0642、unc0321、brd4770、hkmti-1-247、hkmti-1-248、cpuy074020、dcg066，以及抑制g9ahmt的其他g9ahmt小分子抑制剂。或与它们等效的药剂制品、类似物、异构体和/或其盐、水合物或前体，或其组合；较佳地为g9ahmt抑制剂bix01294(或bix-01294)、unc0638、unc0642。
所述的小分子抑制剂：ezh2hmt抑制剂，指能够靶向抑制ezh2hmt的总称，包括但不限于：epz005687、gsk343、tazemetostat(epz-6438)、unc1999、jq-ez-05(jqez5)、ebi-2511、cpi-1205、epz011989、pf-06726304、ei1、gsk503、gsk126、cpi-360、cpi-169，以及抑制ezh2hkmt的其他ezh2hkmt小分子抑制剂。或与它们等效的药剂制品、类似物、异构体和/或其盐、水合物或前体，或其组合；较佳地为epz005687、gsk343、unc1999。
所述的小分子抑制剂：tgfβ抑制剂，指能够靶向抑制tgfβ信号通路的抑制剂总称，包括但不限于：sb431542、a83-01、sb525334、ly2109761，repsox、sd-208、gw788388、sb505124、ew-7197，galunisertib，以及诱导抑制tgfβ信号通路的其他tgfβ小分子抑制剂。或与它们等效的药剂制品、类似物、异构体和/或其盐、水合物或前体，或其组合；较佳地为tgfβ抑制剂sb431542、a83-01、repsox或ly2109761。
在另一优选例中，所述的化学小分子组合物是药物组合物，用于化学诱导体内原位成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞，以其体内原位诱导成纤维细胞转分化为肝细胞及其效应，可减少或降低组织或器官的成纤维细胞或纤维细胞异常，可研发制备为治疗纤维化疾病(如肝硬化/肝纤维化)的药物/前体药物/药物组合物；同样机理，该小分子组合物通过研发完善，对治疗肺纤维化、肾纤维化，以及其他组织、器管的纤维化疾病也应有类似效果，并可制备成为相应的药物或前体药物；
因此，所述小分子组合物是药物组合物，还包含药学上可接受的载体或赋形剂，其载体或赋形剂包括(但不限于)选自下组的一种或多种：水、盐水、磷酸缓冲液或其它水性溶剂；dmso(二甲基亚砜)、甘油和乙醇或其它有机溶剂；微球、脂质体、微乳液或高分子表面活性剂；胶体型载药系统或高分子载药系统；或防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、ph缓冲物质，黏合剂、填充剂、润滑剂或其它药物赋形剂。
在另一优选例中，所述的化学小分子组合物可制备的药物剂型包括(但不限于)：固体剂型，包括(但不限于)：粉剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂、控速释剂；液体剂型，包括(但不限于)：注射剂、输液剂、混悬剂，或其它液体剂型；气体剂型；或半固体剂型。
在本发明的另一方面，提供所述的化学小分子组合物的用途，包括：用于制备体内化学诱导原位成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞，以其体内原位转分化肝细胞效应，减少或降低纤维化细胞组织或器官的纤维化，以治疗成纤维细胞或纤维细胞异常的相关疾病即纤维化疾病(如：肝硬化/肝纤维化)的药物/前体药物/药物组合物；或，用于制备化学诱导体内外成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的转分化培养基或试剂；或，用于化学诱导体外成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞，以制备转分化/转化肝细胞，为科研应用、医药应用及临床应用如肝细胞移植治疗肝衰竭提供肝细胞源。
在本发明的另一方面，提供一种在成纤维细胞中不导入或不使用，或在小分子组合物中不含有或不使用任何外源基因/转录因子/microrna(mirna)基因，及其rna、蛋白质或多肽等诱导因子；也不使用细胞因子或生长因子；仅用化学小分子组合物，体内外化学诱导成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的方法，所述方法包括：应用上述任一所述的化学小分子组合物，体内外诱导成纤维细胞转分化为肝细胞的方法；或，为制备体内原位诱导成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞；以其体内原位转分化肝细胞效应减少或降低组织器官的成纤维细胞或纤维纤维细胞异常，以治疗成纤维细胞或纤维细胞异常的纤维化疾病(如：肝硬化/肝纤维化)的药物/前体药物/药物组合物的方法；
同样机理，该小分子组合物通过研发完善，对治疗肺纤维化、肾纤维化，以及其他组织、器管的纤维化疾病也应有类似效果，制备相应的药物或前体药物；
或以上述任何小分子组合物诱导成纤维细胞直接重编程为肝细胞，以制备转化肝细胞的方法；
或添加有机溶剂、或生理盐水、或缓冲液、或细胞基础培养基等载体或赋形剂，制备用于化学诱导成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的转分化培养基或试剂的方法。
所提供制备诱导成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的转分化培养基或试剂方法及其实验步骤，包括：
(1)浓缩液试剂配制：根据前面任一所述的小分子组合物，将各成分溶解于有机溶剂或水性溶剂中配制成浓缩液试剂；较佳地，所述的有机溶剂包括二甲基亚砜；较佳地，所述的水性溶剂包括：水，生理盐水，磷酸盐缓冲液；
(2)成纤维细胞转分化肝细胞培养基获得：将步骤(1)中的浓缩液试剂分别稀释入含5-20％小牛血清的细胞基础培养基中(使得各组分的浓度符合前面任一所述的小分子组合物中所限定的终浓度)，获得诱导成纤维细胞转分化肝细胞的培养基；其中，该培养基各组分的百分含量还可上下浮动50％；较佳地上下浮动30％；更佳地上下浮动20％，如10％，5％；
(3)诱导成纤维细胞转分化为肝细胞：将成纤维细胞在含5-20％小牛血清的细胞基础培养基或含有各种细胞因子或生长因子的无血清培养基中混悬、铺板，在细胞贴壁后换成步骤(2)的转分化培养基，37℃培养，每2-4天换液一次；3-15天传代一次。
(4)诱导成纤维细胞转分化肝细胞的传代培养：弃原培养液，pbs洗涤一次，加入细胞消化液消化细胞，37℃，1-5分钟，终止细胞消化，离心，弃上清，将细胞沉淀重悬，按1:1-1:3传代铺板。应用步骤(2)的转分化培养基，参照上述方法培养，每2-4天换液一次。所用消化液包括胰酶，edta，acutase，tryplee等。3-15天传代一次。
(5)诱导成纤维细胞转分化肝细胞细胞的收获：经上述实验步骤(3)、(4)转分化肝细胞培养和传代培养2-4周，即可将成纤维细胞转分化为肝细胞，并获得转分化后的肝细胞。
在本发明的另一方面，提供一种用于化学诱导体内外成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的药盒或试剂盒。所述的药盒/试剂盒中包括：前面任一所述的化学小分子组合物；或基于该小分子组合物添加药学上可接受的载体或赋形剂，用于体内化学诱导原位成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞，以其原位转分化肝细胞效应减少或降低纤维化组织/器官的纤维化，而研发或制备的治疗人纤维化疾病(如肝硬化/肝纤维化)的药物/前体药物/药物组合物；或添加有机溶剂/生理盐水/缓冲液/细胞基础培养基等载体或赋形剂制备的诱导成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的转分化培养基或试剂。
该药盒或试剂盒中不包括、不含有：用于导入成纤维细胞中，或添加到小分子组合物/转分化培养基中的任何外源基因/转录因子/microrna(mirna)基因，或其rna、蛋白质及多肽等成分；或其与基因载体的结合物。
如前面任一方面，所述的成纤维细胞包括但不限于：人成纤维细胞或哺乳动物成纤维细胞；较佳地，包括但不限于人的：皮肤成纤维细胞、肝成纤维细胞(肝星状/形细胞hepaticstellatecell，hsc)、肺成纤维细胞、肾成纤维细胞、胰腺成纤维细胞，以及人体其他组织或器官的成纤维细胞。较佳地为人皮肤成纤维细胞及肝成纤维细胞(肝星状细胞)。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、肝成纤维细胞(肝星状细胞hsc)与其转分化所得肝细胞(cihep)形态比较。图1a右侧图表示2种小分子组合物的转分化肝细胞培养基1(2f)诱导小鼠hsc转分化所得的肝细胞(cihep)；图1b右侧图表示3种小分子组合的转分化培养基11(3f)诱导hsc转分化所得的肝细胞(cihep)；分别与图a、b左侧图中hsc的形态比较，转化肝细胞形态均发生明显改变，与肝细胞形态吻合，部分转化肝细胞明显出现双细胞核。显示hsc都已转分化为肝细胞(cihep)。实验结果显示，仅由2种化学小分子(gsk3β抑制剂和hmt抑制剂)组成的小分子组合物(2f)与之前本发明人发明的仅由3种小分子(gsk3β抑制剂、g9ahmt抑制剂、tgfβ抑制剂)组成的小分子组合物(3f)，在体外诱导成纤维细胞转分化为肝细胞的效果相同或相近。
图2、肝星状细胞(hsc)与其转分化获得肝样细胞(cihep)的糖原染色(pas)。图2右侧图：显示hsc转分化所得cihep的糖原染色阳性。图2左侧图显示：肝星状细胞(hsc)糖原染色阴性；表明该转分化获得的肝样细胞具有人肝细胞相同的糖原储存活性特有功能。
图3、肝星状细胞(hsc)与其转分化获得肝样细胞(cihep)的脂肪油红染色(oil-red)比较。图3右侧图显示：肝星状细胞(hsc)转分化所得cihep的脂肪油红染色阳性，阳性染色展现转分化肝细胞代谢脂肪的能力。而hsc脂肪油红染色阴性；结果表明该转分化所得肝样细胞具有肝细胞代谢脂肪特有功能。
图4、成纤维细胞(hf)转分化为肝样细胞(cihep)后表达肝细胞相关基因。该实验结果显示，成纤维细胞转分化为肝样细胞后高表达肝细胞相关基因；表明成纤维细胞已经被转分化为肝细胞。
图5、通过口服体内原位成纤维细胞转分化肝细胞试剂5治疗肝纤维化小鼠动物模型实验，表明处理组(treat)比对照组(ctrl)的外周血中转氨酶(谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast))显著降低，表明该小分子组合物诱导体内原位成纤维细胞转分化为肝细胞效应，使肝纤维化病变明显减轻或逆转。
图6、通过口服体内原位成纤维细胞转分化肝细胞试剂7、10治疗肝纤维化小鼠动物模型对比实验，分别取两处理组(treat)和对照组(ctrl)小鼠的肝脏组织固定切片，作天狼星红染色(按试剂盒操作说明)。图6a图：与对照组比较，口服成纤维细胞转分化试剂7(2f)的处理组小鼠其天狼星红染色显著减少；图6b图：与对照组比较，口服成纤维细胞转分化试剂10(3f)的处理组小鼠其天狼星红染色也显著减少。图6的a图和b图比较，a图的处理条件降低纤维化程度的效果显著比b图的处理条件更佳；表明该2种小分子组合物比3种小分子组合物的体内原位转分化成纤维细胞为肝细胞及其效应，使肝纤维化病变减轻或逆转效果更佳。
图7、人肝星状细胞(lx2)与其转分化获得的转化肝细胞(lx2-cihep)的形态比较；结果显示，人肝星状细胞((lx2)转分化后，具人肝细胞的特有形态特征。
图8、人肝星状细胞系(lx2)转分化获得的肝细胞(lx2-cihep)的油红染色(oil-red)、糖原染色(pas)；与人原代肝细胞(phh)进行对照染色比较。结果显示，人肝星状细胞转分化获得的肝细胞与原代肝细胞染色均为阳性，具备糖原储存和脂肪代谢特有功能。
图9、人肝星状细胞(lx2)与其转分化获得的转化肝细胞(lx2-cihep)的人肝细胞特异性标志物流式细胞分析；结果显示，转分化所获得的肝细胞(lx2-cihep)有人肝细胞的特异性标志物表达，而对照组则没有表达。
图10、实验结果显示，转分化肝细胞培养基13、14、15化学诱导成纤维细胞转分化后，高表达肝细胞相关基因(alb、aat、asgpr1、7a1)。
图11、体内原位成纤维细胞转分化肝细胞口服试剂12体内原位诱导小鼠肝星状细胞(hsc)转分化为肝细胞示踪比较实验。图11上图对照组与下图处理组比较，下图处理组左侧图为转分化处理后的肝细胞组织仍然显示红色，形态不变；中间图显示肝星状细胞转分化为肝细胞后，形态已转变为肝细胞形态，但仍然显示其绿色荧光标记；右侧图显示转化肝细胞(绿色荧光)与原有肝细胞组织(红色荧光)整合为一体，且转化肝细胞仍然显示原位hsc示踪标记的绿色荧光。实验结果充分显示本发明的小分子组合物可体内原位诱导hsc转分化为肝细胞。
图12、化学小分子组合物的各单独小分子组成成分诱导成纤维细胞(hf)转化比较试验。图12显示，图左侧成纤维细胞(hf)对照组(control)与图右侧各小分子处理组(treat)相比较，各单独小分子成分对人成纤维细胞没有诱导转分化为肝细胞的作用，成纤维细胞被其诱导转分化前后，形态基本没有变化，更与肝细胞形态没有任何相似之处。实验结果表明，化学小分子组合物的各单独组分：gsk3β抑制剂、hmt抑制剂、tgfβ抑制剂单独存在时，不具有诱导成纤维细胞转分化为肝细胞的功能。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，揭示了一种不导入或不使用任何外源基因/转录因子/microrna(mirna)基因，及其rna、蛋白质或多肽等诱导因子；或，在化学小分子组合物/转分化培养基中，不含有或不使用任何外源基因/转录因子/microrna(mirna)基因，或其转录的rna，或其翻译的蛋白质及多肽等诱导因子；也不添加使用任何细胞因子或生长因子。仅使用化学小分子，体内外化学诱导成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的小分子组合物及其方法；该小分子组合物可添加药学上可接受的载体或赋形剂，用于化学诱导体内原位成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞，以其体内原位转分化肝细胞效应，减少或降低组织或器官的成纤维细胞或纤维细胞异常，研发制备成临床治疗纤维化疾病(如肝硬化/肝纤维化)的药物或药物前体；同样机理，该小分子组合物通过研发完善，对治疗肺纤维化、肾纤维化，以及其他组织、器管的纤维化疾病也有类似效果，并可制备成为相应的药物或前体药物；或添加水性溶剂或有机溶剂，或生理盐水/缓冲剂/细胞基础培养基等载体或赋型剂，制备成转分化试剂或培养基；还可用于体外化学诱导成纤维细胞转分化为肝细胞，制备转分化肝细胞，为科研应用、医药应用及临床应用如肝细胞移植提供肝细胞源。该小分子组合物，体内外化学诱导成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的方法可应用于人成纤维细胞或哺乳动物成纤维细胞；较佳地，包括但不限于人的：皮肤成纤维细胞、肝成纤维细胞(肝星状细胞)、肺成纤维细胞、肾成纤维细胞、胰腺成纤维细胞或人体其他组织或器官的成纤维细胞；更佳地为人皮肤成纤维细胞或肝成纤维细胞(肝星状细胞)。而体外转分化获得的肝样细胞具有正常肝细胞功能。
基本机理
细胞重编程(cellreprogramming)是细胞从一种类型向另外一种类型的转换，是通过靶向诱导调控特定细胞信号通路及表观遗传修饰，使其表观遗传发生变化来改变细胞命运的过程。
本发明即是在成纤维细胞或起始细胞中，或在小分子组合物/转分化培养基中不导入或不使用任何外源基因/转录因子/microrna基因，及其转录的rna，或其翻译的蛋白质及多肽等诱导因子；也不添加使用任何细胞因子或生长因子。仅使用化学小分子组成的诱导组合物gsk3β抑制剂和hmt抑制剂(较佳地为g9ahmt抑制剂/ezh2hkmt抑制剂)2种小分子组成的诱导组合物，同时靶向诱导调控成纤维细胞的gsk3β信号通路及其表观遗传酶hmt，调控出新信号通路及表观遗传修饰，使细胞基因表达谱发生改变，从而将成纤维细胞转分化为肝细胞。
本发明的小分子组合物及其方法具有以下先进性和创新性优点：
①化学小分子为靶向小分子化合物，性质稳定，作用的时间、剂量及组合方式易于控制，作用效果稳定可靠，成药性好；②转分化获得的肝细胞具有正常成熟的人肝细胞形态和功能；③该方法的成纤维细胞可取材于患者本人，因此转分化获得肝细胞具有个性化特征，并有两大优势：一是更易于进入临床应用，并最大限度降低或避免转化肝细胞移植引起的免疫排斥反应风险；二是可以构建具群体代表性的肝细胞库，应用于新药的肝毒安全评测和药效筛选；④该体内外转分化成纤维细胞为肝细胞的方法及诱导组合物，是在不导入、不使用任何外源基因/转录因子/microrna基因，或其rna，或其蛋白质及多肽，等诱导因子；仅使用化学小分子组成诱导组合物，避免了外源基因导入或结构基因改变引起新的致癌风险，更为安全可靠；而且也不使用任何细胞因子或生长因子，成本费用更低，操作也更简单。⑤该方法采取化学诱导直接重编程，不需要经过诱导多潜能干细胞(ipsc)重编程阶段，避免了诱导多潜能干细胞引起的致癌风险；⑥化学小分子为靶向小分子化合物，结构稳定，成药性好，易于应用于体内原位成纤维细胞转分化，以其体内原位转分化效应减少或降低纤维化组织/器官的纤维化，易于研发或制备成治疗临床纤维化疾病(如肝纤维化/肝硬化)的药物或前体药物；还可进一步研发制备治疗肾纤维化、肺纤维化、及其他器官或组织纤维化疾病的药物或前体药物。
此外，本发明的先进性、创新性还在于：本发明最少仅由2种化学小分子(gsk3β抑制剂和hmt抑制剂)组成的组合物与之前本发明人发明的3种小分子(gsk3β抑制剂、g9ahmt抑制剂、tgfβ抑制剂)组成的诱导成纤维细胞转分化为肝细胞的组合物及其方法相比较，前者不仅具有3个小分子组合物诱导成纤维细胞转分化肝细胞的全部先进性和创新性外，还具有：(1)前者与后者体外诱导成纤维细胞转分化为肝细胞效果相同或相近；但前者体内原位诱导成纤维细胞转分化肝细胞及其效应，降低或改善成纤维细胞/纤维细胞异常相关疾病如肝纤维化疾病的效果与后者相同或更佳；(2)前者与后者的小分子组合物的组合结构不同；2个小分子组成的组合物的组成成分更少，组合结构更简单，成药性更好，产生副作用的风险更低，开发成本更低，更容易开发为相关疾病药物；(3)前者小分子组合物的组成成分hmt抑制剂中的有效化学小分子种类增加，数量更多，候选药物化学小分子的选择范围更广。
另一方面，前述任一化学小分子组合物中的gsk3β抑制剂、hmt抑制剂(较佳地为g9ahmt抑制剂/ezh2hkmt抑制剂)，以及可选择添加的tgfβ抑制剂，其中任一小分子组分单独存在时，并无任何诱导成纤维细胞转分化肝细胞的功能。
且至今未见任何文献报道上述化学小分子单独存在时，具有诱导成纤维细胞转分化为肝细胞的功能。
前述小分子抑制剂拥有特异性的抑制或阻断特定信号通路或表观遗传酶活性的能力，每个类别下的其他靶向性小分子抑制剂，都是根据其所诱导调控或抑制的特定细胞信号通路或酶活性，发挥有效调控功能，才划归为同一类别(该归类工作由化学小分子发明者完成)，并以所调控的特定信号通路或表观遗传修饰酶，以及所发挥功能为类别名称；例如，gsk3β抑制剂类别内的所有小分子都具有靶向抑制gsk3β信号通路的共同功能特点。而同类别内的小分子抑制剂之间，仅只是有效剂量、活性大小、作用效果存在差异，但诱导调控特定信号通路或表观遗传酶活性的能力并无本质区别。因此，由于同类别小分子抑制剂可靶向诱导调控同一特定细胞信号通路或其表观遗传酶特定靶点这一特殊性，使同一类别小分子抑制剂，其作为单独成分发挥功效是基本相同的；作为组合物的参与成分，其在组合物有机整体中发挥的功效也是基本相同的，而不会有质的差别。其他靶向诱导细胞特定信号通路或其表观遗传的特定靶点的小分子抑制剂或小分子化合物亦同此理。这为本领域科技人员所熟知的常识。
因此，gsk3β抑制剂、hmt抑制剂(g9ahmt抑制剂/ezh2hkmt抑制剂等)，以及可选择添加的tgfβ抑制剂，分别包含了诱导调控相同的特定细胞信号通路或其表观遗传修饰酶，以及发挥的功能活性、效应、效果一致的各自类别内的小分子化合物；所形成的不同组合，都能够不同程度地诱导成纤维细胞转分化为肝细胞。因此，其功能相同或诱导靶点相同，或对同一条信号通路或其表观遗传酶起相同效应的同类别内的小分子化合物，以及所构成的能够诱导调控成纤维细胞转分化为肝细胞的小分子组合都属于本发明保护范围内。
另一方面，成纤维细胞(fibroblast)，也称为纤维母细胞，是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymalcell)分化而来。成纤维细胞根据不同功能活动状态，可划分为成纤维细胞和纤维细胞；成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动；处于成熟期或称静止状态的被称为纤维细胞；在一定条件下，二者可实现互相转化。成纤维细胞具有不同类型，存在与体内各种组织或器官中；在不同的组织或器官中有不同的名称和特性，包括：皮肤成纤维细胞、肝成纤维细胞(肝星状细胞)、肺成纤维细胞、胰腺成纤维细胞以及其它组织或器官中的成纤维细胞。
而本发明的方法或小分子组合物诱导的成纤维细胞，即前面所述的成纤维细胞包括但不限于：人成纤维细胞或哺乳动物成纤维细胞；较佳地，包括但不限于人的：皮肤成纤维细胞、肝成纤维细胞(肝星状细胞)、肺成纤维细胞、肾成纤维细胞、胰腺成纤维细胞，以及人体其他组织或器官的成纤维细胞。更佳地为人皮肤成纤维细胞或肝成纤维细胞(肝星状细胞)。
药物组合物及其应用
本发明人经过广泛的研究，首次提出一种不导入，不使用任何外源基因/转录因子/microrna(mirna)基因，或其转录的rna，或其翻译的蛋白及多肽等诱导因子；也不添加使用任何细胞因子或生长因子。仅由化学小分子抑制剂：gsk3β抑制剂和hmt抑制剂组成的小分子组合物，体内或体外化学诱导成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞；即同时不同程度地抑制gsk3β信号通路，以及抑制其hmt(g9ahmt或ezh2hmt)，即可诱导调控出新的信号通路及其表观遗传修饰的改变，从而使其基因表达谱发生改变，使成纤维细胞转分化为肝细胞。
上述小分子组合物是药物组合物，还可添加tgfβ抑制剂；该药物组合物可用于化学诱导体内原位成纤维细胞转分化为肝细胞，以其体内原位转分化肝细胞效应，减少或降低组织/器官的成纤维细胞异常，达到治疗成纤维细胞或纤维细胞异常相关疾病(纤维化疾病如：肝纤维化/肝硬化)的效果。因此可添加药物载体或赋型剂，研发制备为治疗肝纤维化(肝硬化)疾病的药物/前体药物/药物组合物；由此推及，该小分子组合物经过研发完善，对治疗肺纤维化、肾纤维化，以及其他组织、器管的纤维化疾病也应有类似效果；亦可添加药物载体或赋型剂，研发制备相应的创新药物或前体药物，因此也应包含在本发明中。
应理解，同类别内的小分子抑制剂之间，仅只是有效剂量、活性大小、作用效果存在差异，但诱导抑制或调控特定信号通路或表观遗传酶的能力并无本质区别。除了本发明实施例中所列举的具体、代表性的化学小分子gsk3β抑制剂以外的其它可靶向抑制gsk3β细胞信号通路的gsk3β小分子抑制剂，也可实现同样的技术效果，也应被包含在本发明中；
除了本发明实施例中所列举的具体的，代表性的hmt抑制剂以外的其它靶向诱导抑制hmt的化学小分子hmt抑制剂，也可实现同样的技术效果，也应被包含在本发明中；
除了本发明实施例中所列举的具体的，代表性的hmt抑制剂(g9ahmt抑制剂/ezh2hkmt抑制剂)以外的其它靶向诱导抑制hmt的化学小分子hmt抑制剂(g9ahmt抑制剂/ezh2hkmt抑制剂)，也可实现同样的技术效果，也应被包含在本发明中；
除了本发明实施例中所列举的具体的，代表性的g9ahmt抑制剂/ezh2hkmt抑制剂以外的其它靶向诱导调控抑制g9ahmt/ezh2hkmt的其他g9ahmt抑制剂或ezh2hkmt抑制剂，也可实现同样的技术效果；也应被包含在本发明中。
同样，除了本发明实施例中所列举的具体，代表性tgfβ抑制剂以外的其它靶向抑制tgfβ信号通路的化学小分子tgfβ抑制剂，也可实现同样的技术效果，也应被包含在本发明中。
如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。
如本文所用，术语“基本上由……构成”指在组合物中，除了含有必要成分或必要组份之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。例如，可以含有甜味剂以改善口味、抗氧化剂以防止氧化，以及其他本领域常用的药物添加剂、载体、赋形剂。本发明中，所述“包括gsk3β抑制剂和hmt抑制剂”或“由gsk3β抑制剂和hmt抑制剂组成”包括了“基本上由gsk3β抑制剂和hmt抑制剂组成”、“主要以gsk3β抑制剂和hmt抑制剂为活性成分”、“以gsk3β抑制剂和hmt抑制剂为唯一活性成分”、“基本上以gsk3β抑制剂和hmt抑制剂为活性成分”的情形。
如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质；如本领域常用的药物载体或赋形剂。
如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体或赋形剂”，其中载体指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系；药物载体本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的，包括但不限于：水、盐水、磷酸缓冲液以及其它水性溶剂；dmso(二甲基亚砜)、甘油和乙醇以及其它有机溶剂；微球、脂质体、微乳液、高分子表面活性剂；胶体型载药系统、新型高分子载药系统、新型药物载体以及其他药学上的载体；其中赋形剂指在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；中药丸剂中的酒、醋、药汁等；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂。
对赋形剂的一般要求是性质稳定，与主药无配伍禁忌，不产生副作用，不影响疗效，在常温下不易变形、干裂、霉变、虫蛀、对人体无害、无生理作用，不与主药产生化学或物理作用，不影响主药的含量测定等。在remington’spharmaceuticalsciences(mackpub.co.，n.j.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。
如本文所用，术语“组合物可制备的药物剂型”中的药物剂型指：为适应治疗或预防的需要而制备的药物应用形式，称为药物剂型；
如本文所用，“重量份”或“重量份数”可互换使用，所述的重量份可以是任何一个固定的以微克、毫克、克数或千克数表示重量(如1ug、1mg、1g、2g、5g、或kg等)。例如，一个由1重量份组分a和9重量份组分b构成的组合物，可以是1克组分a 9克组分b，也可以是10克组分a 90克组分b等构成的组合物。在所述组合物，某一组分的百分比含量＝(该组分的重量份数/所有组分的重量份数之和)×100％。因此，由1重量份组分a和9重量份组分b构成的组合物中，组分a的含量为10％，组分b为90％。
此外，在溶液状态时，上述“重量份”也可以换算成为“摩尔数”；“重量份比”也可以换算成为“摩尔浓度比”。所述重量份比的重量单位可以是：千克(kg)、毫克(mg)、微克(ug)等任一重量单位；摩尔浓度比的摩尔单位可以是：摩(m)、毫摩(mm)、微摩(um)等任一摩尔浓度单位；
化学小分子：gsk3β抑制剂(如chir99021、licl、chir-98014)，hmt抑制剂【g9ahmt抑制剂(如bix01294、unc0638、unc0642)/ezh2hkmt抑制剂(如epz005687、gsk343、unc1999)】，tgfβ抑制剂(如sb431542、a83-01、repsox)，以重量份比(5-80)﹕(0.1-50)﹕(0.1-50)；较佳地，(10-70)﹕(0.5-40)﹕(0.5-40)存在；或溶液状态下以摩尔浓度比(0.1-20)﹕(0.01-20)﹕(0.01-20)；较佳地，(0.5-10)﹕(0.05-10)﹕(0.05-10)存在。
例如，所述的组合物中，包括的成分及重量份比如表1或摩尔浓度比如表2(溶液状态)所示。
表1、重量份比(重量单位：kg、mg、μg……)
表2、摩尔浓度比(摩尔单位：m、mm、μm……)
表1和表2的配方范围可以作为参考性指导。但是应理解，当用于研发制备药物组合物时，所用的组合物的有效剂量可随施用的模式和待治疗纤维化(如肝硬化)疾病患者身体状况，或疾病严重程度而变化。且，体内使用时，通常使用“重量/公斤(体重)”作为剂量单位；所述的小分子组合物应用于大动物和肝病病人时，按小动物使用剂量通过相应的专业换算公式，换算出的大动物或人的有效使用剂量(包括固态或溶液态的剂量换算)，也属于本发明的保护范围。
还应理解，由于各种类别化学小分子各自的小分子成员较多，且各自小分子成员的有效剂量和活性大小差别较大，虽然本发明人长期研究化学小分子诱导调控干细胞定向分化，做了大量的实验，但说明书的实施例不可能全部例举，实施例仅是针对小分子诱导调控组合成分的，各自类别的代表性小分子(如针对gsk3β抑制剂，代表性地以chir-99021、licl、chir-98014等几个小分子抑制剂加以论证)在实验中的使用浓度；故本发明专利申请权利要求中所概括的合理浓度范围，自然是包括，但不限于实施例中各类别的，特定代表性小分子实验中的使用浓度范围；这一基本而浅显的道理，本领域专业技术人员都熟知，不可混淆。
如本发明所用，所述的gsk3β抑制剂是指能够抑制细胞中gsk3β信号通路的小分子抑制剂的总称，包括但不限于：chir-99021，bio、licl、im-12、tws119，1-azakenpaullone、chir-98014、tideglusib、ar-a014418、sb216763、azd1080，以及诱导抑制gsk3β信号通路的其他gsk3β小分子抑制剂或小分子化合物；
作为本发明的优选方式，所述的gsk3β抑制剂是chir-99021，其别名为ct99021；其分子结构式如以下式(i)所示：
所述化学小分子抑制剂：hmt抑制剂，是能够靶向抑制hmt化学小分子的总称，包括(但不限于)：g9ahmt抑制剂、ezh2hmt抑制剂；
所述的化学小分子g9ahmt抑制剂，是指能够靶向抑制g9ahmt的化学小分子抑制剂的总称，包括但不限于：bix01294、unc0638、a-366、unc0631、brd4770、unc0224、unc0646、unc0642，unc0321、brd4770、hkmti-1-247、hkmti-1-248、cpuy074020、dcg066，以及诱导抑制g9ahmt的其他g9ahmt小分子抑制剂或小分子化合物；
作为本发明的优选方式，所述的g9ahmt抑制剂是bix01294(或bix-01294)；其分子结构式如以下式(ii)所示：
所述的化学小分子ezh2hmt抑制剂是指能够靶向抑制ezh2hmt的化学小分子抑制剂的总称，包括但不限于：epz005687、gsk343、tazemetostat(epz-6438)、unc1999、jq-ez-05(jqez5)、ebi-2511、cpi-1205、epz011989、pf-06726304、ei1、gsk503、gsk126、cpi-360、cpi-169，以及抑制ezh2hmt的其他化学小分子ezh2hmt抑制剂或小分子化合物：
作为本发明的优选方式，所述的化学小分子ezh2hmt抑制剂是小分子epz005687；其分子结构式如以下式(iii)所示：
所述的化学小分子tgfβ抑制剂，是指能够抑制细胞中tgfβ信号通路的化学小分子抑制剂的总称，包括但不限于：sb431542、a83-01、sb525334、ly2109761、repsox，sd-208、gw788388、sb505124、ew-7197，galunisertib，以及诱导抑制tgfβ信号通路的其他小分子tgfβ抑制剂或小分子化合物；
作为本发明的优选方式，所述的化学小分子tgfβ抑制剂是小分子sb431542(或称为sb-431542)；其分子结构式如以下式(iv)所示：
作为本发明的优选方式，所述的化学小分子tgfβ抑制剂是小分子a83-01(或称为a8301)；其分子结构式如以下式(v)所示：
本发明还包括与上述小分子化合物ⅰ、ⅱ或ⅲ、ⅳ、v等效的化合物、药剂制品、类似物和/或其盐、水合物或前体；也包括其自然生成和人工合成化合物。
所述小分子化合物的类似物包括但不限于：所述小分子化合物的异构体、外消旋体。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。
所述的“盐”包括但不限于：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸等。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐等。
所述的“化合物的前体”指当用适当的方法施用或处理后，该化合物的前体在培养基中，或动物，或人体内可转变成上述任一化合物的一种化合物，或上述任一化合物的一种化合物所组成的盐或溶液。
本发明的化学小分子组合物是用于诱导成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的药物组合物，可添加药物载体、赋型剂，研发制备为治疗涉及成纤维细胞或纤维细胞相关疾病的药物/前体药物/药物组合物；因此还包括：药学上可接受的载体或赋形剂；较佳地，所述载体或赋形剂包括选自下组的一种或多种：水、盐水、磷酸缓冲液或其它水性溶剂；dmso、甘油和乙醇或其它有机溶剂；微球、脂质体、微乳液或高分子表面活性剂；胶体型载药系统或高分子载药系统；防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、ph缓冲物质，黏合剂、填充剂、润滑剂或其它药物赋形剂；或
本发明所述的化学小分子组合物的剂型没有特别的限制，可以是任何适用于哺乳动物服用的剂型；可制备的剂型包括：粉剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂、控速释剂及其它固体剂型；注射剂、输液剂、混悬剂及其它液体剂型；以及气体剂型、半固体剂型等其它剂型。优选的，所述的剂型可以是但不限于：粉末剂、颗粒剂、胶囊、缓释剂、片剂等固体剂型或注射剂、输液剂、溶液剂、混悬液等液体剂型。
本发明的小分子组合物的制备方法根据所需制备的剂型以及给药途径来决定，本领域技术人员在参考了本发明所提供的组合以及配比后，采用常规的药物组合物的制备方法即可制备出本发明的化学小分子组合物。
应理解，尽管在具体实施方式中，本发明人列举了几种组合物形式，但本领域人员也可由此推导：本发明的其它任何一种小分子组合形式也是同样具有突出效果的。
本发明人首次证实了本发明的小分子组合物可体内原位诱导成纤维细胞转分化为肝细胞，以其体内原位转分化肝细胞效应减少或降低组织/器官的成纤维细胞或纤维细胞异常，因此可添加药物载体或赋型剂，研发制备预防、改善或治疗纤维化疾病如肝纤维化(肝硬化)药物或前体药物或药物配方；
应理解，该小分子组合物经过研发完善，对治疗肺纤维化、肾纤维化，以及其他组织、器管的纤维化疾病也应有类似效果；并可添加药物载体或赋型剂，研发制备相应的创新药物或前体药物，因此也应包含在本发明中。
当用于预防、改善或治疗肝纤维化(肝硬化)以及他器官或组织纤维化疾病时，所用的组合物的有效剂量可随施用的模式和待治疗纤维化疾病类型以及疾病严重程度而变化。具体情况根据受试者的个体情况来决定，这在熟练医师或药剂师可以判断的范围内。
本发明中，所述的成纤维细胞包括但不限于：人成纤维细胞或哺乳动物成纤维细胞；较佳地，包括但不限于人的：皮肤成纤维细胞、肝成纤维细胞(肝星状细胞)、肺成纤维细胞、肾成纤维细胞、胰腺成纤维细胞，以及人体其他组织或器官的成纤维细胞。更佳地为人皮肤成纤维细胞或肝成纤维细胞(肝星状细胞)。
制备转分化培养基和试剂
本发明还提供了小分子组合物可添加有机溶剂、或生理盐水、或缓冲液、或细胞基础培养基等载体/赋形剂/基础营养液，制备为化学诱导成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的转分化培养基或试剂；诱导成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的转分化培养基(以下简称：成纤维细胞转分化肝细胞培养基)。
按本发明所提供的化学小分子组合物终浓度配方，选择具体终浓度的小分子组合物进行配制。作为本发明的优选方式，将该具体小分子组合物中的不同成分，分别根据其溶质的不同性质和不同溶解度将其溶解于dmso(二甲基亚砜)或其它有机溶剂或水性溶剂中配成浓缩液试剂(从1∶50-1∶10,000范围)；然后按该具体小分子组合物终浓度要求，将各小分子有机溶液浓缩液试剂稀释，添加入含10％小牛血清的细胞基础培养基中，即可获得所述的成纤维细胞转分化肝细胞培养基。其中，该培养基各组分的百分含量还可上下浮动50％；较佳地上下浮动30％；更佳地上下浮动20％，如10％，5％。除非另外说明，百分数以v/v计。
作为本发明的优选方式，所述的细胞基础培养基包括但不限于：dmem/f12、mem、dmem、f12、imdm、rpmi1640、neuronalbasal或fischers等，均为市场上可购得的商品。
作为本发明的优选方式，前述转分化培养基特殊条件下，也可使用无血清培养基配制。所述“无血清培养基”指：不含血清而含有支持细胞增殖和生物反应的多种营养成分(如生长因子、组织提取物等)的细胞培养基。即将除血清以外的各种细胞因子或生长因子等添加剂，添加到细胞基础培养基中组成的细胞培养基。
作为本发明的优选方式，所述的含有各种细胞因子或生长因子的无血清培养基包括但不限于：its、n2、b27等，均为可自行配制或商购产品。
应理解，本领域技术人员熟悉所述的细胞基础培养基或无血清培养基的配制或购买途径，因此，细胞基础培养基或无血清培养基并不限于本发明中所举例的这些。
作为本发明的优选方式，所述的“成纤维细胞转分化肝细胞培养基”具体制备或配制如下实施：
(1)将①gsk3β抑制剂(如chir99021)：终浓度为0.1μm-20mm；优选量为：0.5μm-10mm；②g9ahmt抑制剂(如bix01294)终浓度为0.01-20μm；优选量为：0.05-10μm；混合，即可获得本发明用于化学诱导成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的小分子组合物。
(2)将上述各小分子分别经过：溶解配制浓缩液→稀释到细胞基础培养基中→混合，即可配制获得“成纤维细胞转分化肝细胞培养基”。
本发明还提供了用于化学诱导体内原位成纤维细胞转分化肝细胞的实验动物注射或口服用试剂(以下简称：体内原位成纤维细胞转分化肝细胞试剂)。
作为本发明的优选方式，将前述任一组合物中的各小分子组合物，按公斤体重计算出相应的用药量，将其溶于captisol(1-30％)，tween-80(5％)溶液中获得实验动物注射或口服用的原位转分化成纤维细胞试剂。较佳地为captisol(1-30％)。
制备转分化/转化肝细胞的培养方法
本发明还公开了一种化学小分子组合物，体外化学诱导成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞，以制备转化肝细胞的方法，所述方法步骤包括：
(1)浓缩液试剂配制：根据本发明中任一所述的组合物，将各成分溶解于有机溶剂或水性溶剂中配制成浓缩液试剂；较佳地，所述的有机溶剂包括二甲基亚砜；较佳地，所述的水性溶剂包括：水，生理盐水，磷酸盐缓冲液；
(2)培养基获得：将步骤(1)中的浓缩液试剂分别稀释入含5-20％小牛血清的细胞基础培养基中(使得各组分的浓度符合前面所述的组合物中所限定的浓度)，获得诱导成纤维细胞转分化肝细胞的培养基；
其中，该培养基各组分的百分含量还可上下浮动50％；较佳地上下浮动30％；更佳地上下浮动20％，如10％，5％。
(3)诱导成纤维细胞转分化为肝细胞：将成纤维细胞在含5-20％小牛血清的细胞基础培养基中；或无血清培养基中；混悬、铺板，在细胞贴壁后弃原培养基，换步骤(2)的成纤维细胞转分化肝细胞的培养基37℃培养，每2-4天换液一次；3-15天传代一次。
(4)诱导成纤维细胞转分化的传代培养：弃原培养液，pbs洗涤一次，加入细胞消化液消化细胞，37℃，1-5分钟，终止细胞消化，离心，弃上清，将细胞沉淀重悬，按1:1-1:3传代铺板。按实验步骤第(2)和(3)步骤培养，每2-4天换液一次。所用消化液包括胰酶，edta，acutase，tryplee等。3-15天传代一次。
(5)诱导成纤维细胞转分化并获得转分化肝细胞：经上述实验步骤(3)、(4)转分化培养和传代培养成纤维细胞2-4周，即可获得转分化肝细胞。可用该肝细胞进行其他科研实验；新药药毒、药效检测评估；为构建生物人工肝，临床细胞移植等提供肝细胞源。成纤维细胞的转分化肝细胞培养如上述培养方法实验步骤。
转分化获得的肝细胞的功能检测：成纤维细胞的转分化肝细胞培养如上述，用培养不同时间获得的转化肝细胞检测其相关功能。
本发明的在不导入或不使用任何外源基因/转录因子/microrna(mirna)基因，及其rna、蛋白质或多肽等诱导因子；也不在转分化培养基或转分化试剂中，添加使用任何细胞因子或生长因子；仅用化学小分子组合物体内外化学诱导成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞。该小分子组合物，可制备成治疗纤维细胞异常疾病(如肝纤维化/肝硬化)的药物或前体药物或药物组合物；或制备化学诱导成纤维细胞直接重编程为肝细胞的转分化培养基或试剂；或用于化学诱导成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞，以制备转化肝细胞，为科研应用、医药应用及临床应用提供肝细胞源。
此外，该方法还可广泛作为防治组织或器官纤维化的防治方法及机理研究的借鉴；以及肝病研究、药理及毒理安全性检测的细胞模型。所获得的转分化肝细胞可继续进行功能检测、临床前期研究等。该方法不仅为研发防治肝纤维化(肝硬化)、肺纤维化及其他器管或组织纤维化疾病新药及其机理研究开辟了一个新途径，还为肝细胞的医药应用、临床应用及科研应用提供新肝细胞源，具有广泛的应用前景；而且丰富了干细胞重编程理论，拓展其应用范围。具有重要的科学意义和极大的应用价值。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如[美]j.s.博尼费斯农等著；章静波，方瑾，王海杰等译，《精编细胞生物学实验指南[shortprotocolsincellbiology]》，科学出版社2007；中所述的条件；或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、小分子诱导成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的小分子组合物，及其转分化培养基和试剂的配制
设计如下组合物或转分化培养基，可按摩尔浓度或重量浓度进行配制：
1、成纤维细胞转分化肝细胞小分子组合物的配方
(1)成纤维细胞转分化肝细胞组合物1
gsk3β抑制剂chir-99021：终浓度3μm；
g9ahmt抑制剂bix01294：终浓度3μm；
(2)成纤维细胞转分化肝细胞组合物2
gsk3β抑制剂ly2090314：终浓度0.3μm；
g9ahmt抑制剂unc0642：终浓度2μm；
(3)成纤维细胞转分化肝细胞组合物3
gsk3β抑制剂licl：终浓度10μm；
g9ahmt抑制剂bix01294：终浓度2.5μm；
(4)成纤维细胞转分化肝细胞组合物4
gsk3β抑制剂bio：终浓度1um；
g9ahmt抑制剂unc0638：终浓度3um；
(5)成纤维细胞转分化肝细胞组合物5
gsk3β抑制剂ly2090314：终浓度1μm；
g9ahmt抑制剂unc0638：终浓度5μm；
(6)成纤维细胞转分化肝细胞组合物6
gsk3β抑制剂chir-98014：终浓度4μm；
g9ahmt抑制剂bix01294：终浓度2.5μm；
(7)成纤维细胞转分化肝细胞组合物7
gsk3β抑制剂ly2090314：终浓度0.4μm；
g9ahmt抑制剂bix01294：终浓度0.5μm；
(8)成纤维细胞转分化肝细胞组合物8
gsk3β抑制剂licl：终浓度20μm；；
g9ahmt抑制剂bix01294：终浓度5μm；
(9)成纤维细胞转分化肝细胞组合物9
gsk3β抑制剂bio：终浓度3μm；
g9ahmt抑制剂bix01294：终浓度2μm；
(10)成纤维细胞转分化肝细胞组合物10
gsk3β抑制剂ly2090314：终浓度4um；
g9ahmt抑制剂bix01294：终浓度2μm；
tgfβ抑制剂sb431542：终浓度10μm；
(11)成纤维细胞转分化肝细胞组合物11
gsk3β抑制剂bio：终浓度3um；
g9ahmt抑制剂unc0642：终浓度2.5μm；
tgfβ抑制剂a83-01：终浓度2um；
(12)成纤维细胞转分化肝细胞组合物12
gsk3β抑制剂chir-99021：终浓度6um；
g9ahmt抑制剂hkmti-1-248：终浓度5um；
tgfβ抑制剂repsox：终浓度0.5um；
(13)成纤维细胞转分化肝细胞组合物13
gsk3β抑制剂bio：终浓度1um；
ezh2hmt抑制剂epz005687：终浓度3um；
(14)成纤维细胞转分化肝细胞组合物14
gsk3β抑制剂chir-98014：终浓度4μm；
ezh2hmt抑制剂unc1999：终浓度2μm；
(15)成纤维细胞转分化肝细胞组合物15
gsk3β抑制剂chir-98014：终浓度20μm；；
ezh2hmt抑制剂gsk343：终浓度6μm；
各具体小分子组合物按前述“培养方法”步骤(1)先溶解于dmso中制成浓缩液试剂。
2、成纤维细胞转分化肝细胞培养基配制
将上述实验步骤1配制的成纤维细胞转分化肝细胞组合物1～15各成分dmso浓缩液试剂按前述“培养方法”步骤(2)配制，选用的细胞基础培养基是dmem，添加有10％小牛血清，获得成纤维细胞转分化肝细胞培养基1～15(即培养基1与组合物1的化合物终浓度相同，培养基2与组合物2的化合物终浓度相同，…，培养基15与组合物15的化合物终浓度相同)。
3、体内原位成纤维细胞转分化肝细胞口服试剂配制
将成纤维细胞转分化肝细胞组合物5、7、10、12的dmso浓缩液溶于5％captisol，配制成为体内原位成纤维细胞转分化肝细胞口服试剂(与组合物5、7、10、12的化合物终浓度相同)。
实施例2、成纤维细胞转分化肝细胞培养基1、11化学诱导肝成纤维细胞(肝星状细胞hsc)转分化为肝细胞比较实验
1、成纤维细胞转分化肝细胞培养
将小鼠肝星状细胞(hsc)即肝成纤维细胞在添加入含10％小牛血清的细胞基础培养基dmem中混悬、铺板，37℃培养。设置对照组和处理组；
待肝星状细胞贴壁后，弃原培养基，处理组分别换成纤维细胞转分化肝细胞培养基1、11，37℃培养，每3天换液1次；3-7天传代一次。
2、肝星状细胞(hsc)转分化肝细胞的传代培养
传代培养步骤：弃原培养液，pbs洗涤一次，加入细胞消化液消化细胞，37℃，3分钟，终止细胞消化，离心，弃上清，将细胞沉淀重悬，按1:2传代铺板。处理组换成纤维细胞转分化肝细胞培养基1、11培养，每3天换液1次。所用消化液是胰酶(也可用edta，acutase，tryplee)等。3-7天传代一次。
3、转分化肝细胞的收获
经上述实验步骤1-2的成纤维细胞转分化肝细胞培养以及传代培养2-4周，可获得转分化肝细胞，可用于进行进一步的实验。
4、肝成纤维细胞(肝星状细胞hsc)与转分化所得肝细胞(cihep)形态比较
将对照组肝星状细胞hsc与上述步骤3的处理组转分化所得肝细胞(cihep)进行形态比较，结果如图1。
图1a右侧图表示2种小分子组合物的转分化肝细胞培养基1(2f)诱导hsc转分化所得的肝细胞(cihep)；图1b右侧图表示3种小分子组合的转分化肝细胞培养基11(3f)诱导hsc转分化所得的肝细胞(cihep)；分别与其图a、b左侧图中的hsc进行形态比较，转化肝细胞形态均发生明显改变，与肝细胞形态吻合，部分转化肝细胞明显出现双细胞核。显示hsc都已转分化为肝细胞(cihep)。
实验结果显示，仅由2种化学小分子(gsk3β抑制剂和hmt抑制剂)组成的小分子组合物(2f)与之前本发明人发明的仅由3种小分子(gsk3β抑制剂、g9ahmt抑制剂、tgfβ抑制剂)组成的小分子组合物(3f)，在体外诱导成纤维细胞转分化为肝细胞的效果相同或相近。
实施例3、成纤维细胞转分化肝细胞培养基2诱导肝成纤维细胞(肝星状细胞)转分化为肝样细胞的糖原染色
成纤维细胞转分化肝细胞培养基2，化学诱导小鼠肝成纤维细胞(肝星状细胞)转分化为肝细胞的方法步骤同实施例2。
将肝星状细胞(hsc)转分化所得肝样细胞进行糖原染色。染色的深浅展现肝细胞储存糖原的能力。用schiff方法作肝糖原染色。具体方法为：(1)弃细胞培养液，pbs漂洗1次；(2)4％多聚甲醛固定10分钟后，pbs漂洗5分钟×3次；(3)加入pas-i液10min，流水冲洗；(4)加入pas-ii液1-2min，流水冲洗；(5)显微镜取照片。
肝星状细胞(hsc)转分化所得肝细胞(cihep)的糖原染色(pas)结果如图2；图2左侧图为肝星状细胞(hsc)的pas结果，右侧图为转分化培养基2所得转分化或转化肝细胞的糖原染色结果。
由图2实验结果显示，图右侧转分化培养所获肝样细胞的肝糖原染色阳性，而图左侧肝星状细胞肝糖原染色阴性。证明本发明的方法获得的转分化肝细胞具有肝细胞特有的糖原储存活性。
实施例4、成纤维细胞转分化肝细胞培养基3诱导肝成纤维细胞(肝星状细胞)转分化为肝样细胞的脂肪油红(oil-red)染色实验
成纤维细胞转分化肝细胞培养基3，化学诱导成纤维细胞转分化为肝细胞的方法步骤同实施例2。
使用脂肪油红(oil-red)染色常规试剂盒，方法步骤见试剂盒。染色结果见图3。
由图3实验结果显示，右侧图显示肝星状细胞(hsc)转分化获得的肝细胞脂肪油红染色阳性，染色的深浅展现肝细胞代谢脂肪的能力；左侧图肝星状细胞(hsc)脂肪油红染色阴性；证明该2小分子组合物诱导肝星状细胞转分化所得肝样细胞具有肝细胞的代谢脂肪功能。
实施例5、化学诱导成纤维细胞(hf)转分化为肝样细胞后表达肝细胞相关基因
成纤维细胞转分化肝细胞培养基4，化学诱导成纤维细胞(hf)转分化为肝细胞的方法步骤同实施例2。分别收集对照组和转分化组的细胞的rna，做rt-pcr，检测肝细胞相关基因的表达。
结果见图4，成纤维细胞转分化为肝样细胞后高表达肝细胞相关基因，包括alb、hnf4a、aat、cyp1a2、cyp3a4。表明成纤维细胞已经被转分化为肝细胞。
实施例6、口服体内原位成纤维细胞转分化肝细胞试剂5，体内化学诱导原位肝成纤维细胞转分化肝细胞效应，治疗肝纤维化小鼠动物模型实验
实验操作步骤：
1、肝纤维化小鼠动物模型制作：雄性4～5周c57/bl6小鼠，用5％cci4(橄榄油溶剂)腹腔注射，剂量5μl/g体重，3次/周共84天，约12周制作肝纤维化模型。造模第12周取一只小鼠解剖，取肝脏组织固定切片，作he染色(常规染色)和天狼星红染色(按试剂盒操作说明)，明确肝纤维化模型制作成功。
2、体内原位成纤维细胞转分化肝细胞口服试剂5配制及口服治疗实验：口服给药。将成纤维细胞转分化肝细胞组合物5的dmso浓缩液溶于5％captisol，配制成为原位成纤维细胞转分化肝细胞口服试剂(与组合物5的化合物终浓度相同)，1次/天作为处理组(n＝6)，将同等剂量dmso溶于5％captisol，口服给药作为对照(n＝6)。共处理34天，约5周，期间cci4继续使用。实验结束后，收集小鼠血液、肝脏做后续分析。
3、取处理组和对照组小鼠的外周血，进行血常规生化检测其转氨酶。
结果见图5，表明处理组比对照组的外周血中转氨酶(谷丙转氨酶、谷草转氨酶)显著降低，表明该小分子组合物体内原位诱导成纤维细胞转分化为肝细胞效应使肝纤维化病变明显减轻或逆转。
实施例7、口服体内原位成纤维细胞转分化肝细胞试剂7、10，体内化学诱导原位肝纤维化细胞转分化肝细胞及其效应，治疗肝纤维化小鼠动物模型对比实验
实验操作步骤：
1、肝纤维化小鼠动物模型制作：雄性4～5周c57/bl6小鼠，用5％cci4(橄榄油溶剂)腹腔注射，剂量5μl/g体重，1次/3天共84天，约12周制作肝纤维化模型。造模第12周取一只小鼠解剖，取肝脏组织固定切片，作he染色(常规染色)和天狼星红染色(按试剂盒操作说明)，明确肝纤维化模型制作成功。
2、原位成纤维细胞转分化肝细胞口服试剂7、10配制及口服治疗实验：口服给药。将成纤维细胞转分化肝细胞组合物7、10的dmso浓缩液溶于5％captisol，配制成为原位成纤维细胞转分化肝细胞口服试剂(与组合物7、10的化合物终浓度相同)，1次/天作为处理组(2n＝2*6)，将同等剂量dmso溶于5％captisol，口服给药作为对照(n＝6)。共处理34天，约5周，期间cci4继续使用。实验结束后，收集小鼠血液、肝脏做后续分析。
3、分别取两处理组和对照组小鼠的肝脏组织固定切片，作天狼星红染色(按试剂盒操作说明)。
结果见图6，图6a原位成纤维细胞转分化肝细胞口服试剂7处理组小鼠与对照组比较，其天狼星红染色显著减少；图6b原位成纤维细胞转分化肝细胞口服试剂10处理组小鼠与对照组比较，其天狼星红染色也显著减少；但前者的降低纤维化程度的效果显著比后者更佳。表明该2个小分子组合物比3个小分子组合物的体内原位成纤维细胞转分化为肝细胞效应，使肝纤维化病变减轻或逆转效果相同或更佳。
实施例8、人肝星状细胞(hepaticstellatecell，hsc)系lx2与其转分化获得的转分化肝细胞(lx2-cihep)的形态比较实验
成纤维细胞转分化肝细胞培养基6，化学诱导肝成纤维细胞系lx2(肝星状细胞hepaticstellatecell，hsc，lx2细胞系)转分化为肝细胞的方法步骤同实施例2。
将人肝星状细胞lx2(对照组)与其转分化(处理组)获得的转化肝细胞(lx2-cihep)进行形态比较(实验结果见图7)；图7实验结果显示，该小分子组合物诱导人肝星状细胞转分化所得肝细胞具有肝细胞的特有形态特征。
实施例9、人肝星状细胞(hepaticstellatecell，hsc)系lx2转分化获得的转化肝细胞(lx2-cihep)与人原代肝细胞(phh)的功能比较实验
转分化肝细胞培养基8，化学诱导肝成纤维细胞系lx2(肝星状细胞hepaticstellatecell，hsc，lx2)转分化为肝细胞的方法步骤同实施例2。
将人肝星状细胞lx2转分化(处理组)获得的转化肝细胞(lx2-cihep)进行油红染色(oil-red)和糖原染色(pas)，与人原代肝细胞(phh)进行对照染色比较(步骤同实施例3、4)，实验结果见图8；结果显示lx2转分化获得的转化肝细胞(lx2-cihep)与原代肝细胞(phh)染色均为阳性，表明转化肝细胞具有肝细胞特有的糖原储存和脂肪代谢功能。
实施例10、人肝星状细胞(hepaticstellatecell，hsc)系lx2与其转分化获得的转分化肝细胞(lx2-cihep)的特异标志物表达比较实验
成纤维细胞转分化肝细胞培养基9，化学诱导肝成纤维细胞系lx2(肝星状细胞hepaticstellatecell，hsc，lx2)转分化为肝细胞的方法步骤同实施例2。
将人肝星状细胞lx2(对照组)与其转分化(处理组)获得的转分化肝细胞(lx2-cihep)消化，离心后固定，用人肝细胞特异性抗体作免疫染色，然后对样本作流式细胞分析比较，实验结果见图9。结果显示，转分化的肝细胞(lx2-cihep)表达人肝细胞的特异性标志物，而对照组则没有表达。
综上实验结果显示，人肝星状细胞lx2转分化(处理组)获得的转分化肝细胞(lx2-cihep)与对照组的形态、功能(糖原染色、油红染色)，以及人肝细胞特异性标志物比较。结果显示，人肝星状细胞lx2转分化为肝样细胞后，具有人肝细胞特有的形态、功能以及其特异性标志物特征。
实施例11、转分化肝细胞培养基13、14、15诱导成纤维细胞转分化获得肝样细胞表达肝细胞相关基因
转分化肝细胞培养基13、14、15诱导皮肤成纤维细胞转分化肝样细胞的方法步骤同实施例2。分别收集对照组(control)和转分化肝细胞培养基13、14、15转分化处理组(依次标注为t1、t2、t3)转分化所得的肝样细胞的rna，做rt-pcr，检测肝细胞相关基因的表达。
实验结果见图10，结果显示：转分化肝细胞培养基13、14、15诱导成纤维细胞转分化获得的肝样细胞，与对照组相比较，处理组t1、t2、t3高表达肝细胞相关基因，包括alb、aat、asgpr1、7a1。实验结果表明，本发明的2小分子组合物诱导成纤维细胞转分化的肝样细胞，高表达肝细胞相关基因。
实施例12、体内原位成纤维细胞转分化肝细胞口服试剂12体内原位诱导小鼠肝星状细胞(hepaticstellatecell，hsc)转分化为肝细胞示踪比较实验
肝纤维化疾病动物模型实验操作步骤同实施例6。采用携带标记肝星状细胞示踪信号的转基因小鼠(mtmg/pdgff1)制作肝纤维化小鼠动物模型。对照组与处理组的处理条件唯一区别是：处理组口服体内原位成纤维细胞转分化肝细胞口服试剂12含有小分子组合物12，而对照组的口服试剂没有。实验结果见图11。
图11上图对照组，左侧图显示转基因小鼠的肝细胞显示红色荧光，形态没有改变；中间图显示转基因小鼠的原位肝星状细胞(hsc)或称肝成纤维细胞，显示绿色荧光，形态没有改变；右侧图显示上述两种细胞组织的荧光合成图；
图11下图处理组，左侧图为转分化处理后的肝细胞组织仍然显示红色，形态不变；中间图显示肝星状细胞转分化后，形态已转变为肝细胞形态，但仍然显示肝星状细胞原有绿色荧光标记；右侧图显示肝星状细胞转分化为转化肝细胞与原有肝细胞组织整合为一体，且转化肝细胞仍然显示原位hsc示踪标记的绿色荧光。实验结果充分显示本发明的小分子组合物可体内原位诱导hsc转分化为肝细胞。
实施例13化学小分子组合物的各单独小分子组成成分[gsk3β抑制剂/hmt抑制剂(g9ahmt抑制剂/ezh2hmt抑制剂)/tgfβ抑制剂]诱导细胞转化比较试验
(1)gsk3β抑制剂chir-99021，hmt抑制剂(g9ahmt抑制剂bix01294、ezh2hmt抑制剂epz005687)、tgfβ抑制剂sb431542，各单独小分子成分培养基的配制：将gsk3β抑制剂chir-99021、hmt抑制剂(g9ahmt抑制剂bix01294、ezh2hmt抑制剂epz005687)、tgfβ抑制剂sb431542，各单独小分子组成成分按照前述实验步骤1配制成为dmso浓缩液试剂；按前述“培养方法”步骤(2)转分化肝细胞培养基的配制，选用的细胞基础培养基是dmem，添加有10％小牛血清，获得单独小分子成分培养基
(2)诱导成纤维细胞转分化为肝细胞的培养方法步骤同实施例2；所使用细胞为人成纤维细胞(hf)。
(3)将各单独小分子成分培养基诱导人成纤维细胞转分化培养处理组(treat)所获得的细胞形态与对照组(control)的人成纤维细胞(hf)进行形态比较(对照组与处理组培养条件唯一差别是不添加化学小分子成分)。实验结果见图12。
图12显示，图左侧对照组与图右侧各小分子处理组相比较，各单独小分子成分对人成纤维细胞没有诱导转分化肝细胞作用，成纤维细胞被其诱导转分化前后，形态基本没有变化，更与肝细胞形态没有任何相似之处。
实验结果表明，化学小分子组合物的各单独组分：gsk3β抑制剂、hmt抑制剂(g9ahmt抑制剂/ezh2hmt抑制剂)、tgfβ抑制剂单独存在时，不具有诱导成纤维细胞转分化为肝细胞的功能。
综上，本发明的“体内外化学诱导成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的化学小分子组合物及方法具有以下有益效果在于：
1、本发明方法是不导入、不使用任何外源基因/外源转录因子/microrna(mirna)基因，及其rna、蛋白质或多肽等诱导因子；也不使用任何细胞因子或生长因子；最少仅使用由2种化学小分子组成的诱导组合物，体内外诱导成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞。操作方法简单，转化肝细胞成本低，质量好，更安全；
2、该化学小分子组合物具有多种用途：(1)作为体内原位诱导成纤维细胞转分化为肝细胞的药物组合物，可研发或制备成治疗人成纤维细胞异常相关疾病(如肝纤维化/肝硬化)的药物/前体药物/药物组合物；(2)用于制备化学诱导成纤维细胞转分化为肝细胞的转化培养基或试剂；(3)用于体外化学诱导成纤维细胞转分化为肝细胞，以制备转化肝细胞，为科研应用、医药应用及临床应用提供肝细胞源。
3、体外转分化获得的肝细胞具有正常成熟的人肝细胞形态和功能；具有白蛋白生成，尿素合成，糖原储存、脂肪代谢、p450酶活性诱导及其他人肝细胞特有功能和人肝细胞特异性标志物；
4、本发明最少仅使用2种化学小分子组成的组合物，具有组合结构更简单，成药性更好；产生副作用的风险更低，开发成本更低，更容易开发为相关疾病药物。且体内原位诱导成纤维细胞转分化肝细胞效应，减轻或改善肝纤维化/肝硬化效果更佳。
5、本转分化肝细胞方法可取材于患者自身，转化肝细胞具有个性化特征，并有两大优势：一是易于进入临床应用，并最大限度降低或避免转化/转分化肝细胞移植引起的免疫排斥反应风险；二是可构建具群体代表性的肝细胞库，应用于新药的肝毒安全评测和药效筛选；因此可为临床应用、医药应用及科研应用提供肝细胞源。
6、该方法采取小分子化学诱导细胞直接重编程，不需要经过诱导多潜能干细胞重编程为ipsc阶段，避免致癌风险；方便临床应用。
7、该转分化方法普适性和可重复性好；方法简单，易于操作，成本较低；有利于推广应用。
8、常规培养、周期短、适于批量生产和易于产业化等特点。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
1.一种用于化学诱导体内外成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的化学小分子组合物，其特征在于，所述的组合物包括化学小分子抑制剂：gsk3β抑制剂和hmt抑制剂；或，所述的组合物由化学小分子抑制剂：gsk3β抑制剂和hmt抑制剂组成；
其中，所述成纤维细胞中不导入任何外源基因/转录因子/microrna(mirna)基因，及其rna、蛋白质或多肽等诱导因子；或，所述的化学小分子组合物中不含有任何外源基因/转录因子/microrna(mirna)基因，或其转录的rna，或其翻译的蛋白质及多肽等诱导因子。
2.如权利要求1所述的小分子组合物，其特征在于，所述化学小分子hmt抑制剂包括(但不限于)：g9ahmt抑制剂、ezh2hmt抑制剂；或所述化学小分子组合物包括：化学小分子gsk3β抑制剂和hmt抑制剂(g9ahmt抑制剂/ezh2hmt抑制剂)；或仅由gsk3β抑制剂和g9ahmt抑制剂/ezh2hmt抑制剂组成。
3.如权利要求1所述的化学小分子组合物，其特征在于，所述的小分子组合物还可添加包括化学小分子抑制剂：tgfβ抑制剂；或，所述的小分子组合物还可由化学小分子抑制剂：gsk3β抑制剂、hmt抑制剂(g9ahmt抑制剂/ezh2hmt抑制剂)和tgfβ抑制剂组成。
4.如权利要求1-3所述的化学小分子组合物，其特征在于，所述的化学小分子组合物包括：由化学小分子抑制剂：gsk3β抑制剂和g9ahmt抑制剂/ezh2hmt抑制剂组成的化学小分子诱导组合物；或，
所述的化学小分子组合物包括：由化学小分子抑制剂：gsk3β抑制剂、g9ahmt抑制剂/ezh2hmt抑制剂、tgfβ抑制剂组成的化学小分子诱导组合物。
5.如权利要求1或3所述的化学小分子组合物，其特征在于，按照重量份比，所述的小分子抑制剂：gsk3β抑制剂和hmt抑制剂为(5-80)﹕(0.1-50)；或溶液状态下摩尔浓度比为(0.1-20)﹕(0.01-20)；或
按照重量份比，所述的gsk3β抑制剂、hmt抑制剂和tgfβ抑制剂为(5-80)﹕(0.1-50)﹕(0.1-50)；或溶液状态下摩尔浓度比为(0.1-20)﹕(0.01-20)﹕(0.01-20)。
6.如权利要求1-3任一所述的化学小分子组合物，其特征在于，所述化学小分子抑制剂：gsk3β抑制剂是能够靶向抑制gsk3β信号通路的抑制剂，包括(但不限于)：chir-99021、licl、bio、ly2090314、im-12、tws119、1-azakenpaullone、chir-98014、tideglusib、ar-a014418、sb216763、azd1080，以及诱导抑制gsk3β信号通路的其他gsk3β小分子抑制剂，或与它们等效的药剂制品、类似物、异构体和/或其盐、水合物或前体，或其组合；较佳地为gsk3β抑制剂chir-99021、licl、bio、ly2090314；
所述化学小分子抑制剂：hmt抑制剂，包括(但不限于)：g9ahmt抑制剂、ezh2hmt抑制剂，以及抑制hmt的其他hmt小分子抑制剂，或与它们等效的药剂制品、类似物、异构体和/或其盐、水合物或前体，或其组合；较佳地为g9ahmt抑制剂；或
所述的g9ahmt抑制剂，是能够靶向抑制g9ahmt的抑制剂，包括但不限于：bix01294、unc0638、a-366、unc0631、brd4770、unc0224、unc0646、unc0642、unc0321、brd4770、hkmti-1-247、hkmti-1-248、cpuy074020、dcg066，以及抑制g9ahmt的其他g9ahmt抑制剂或小分子化合物，或与它们等效的药剂制品、类似物、异构体和/或其盐、水合物或前体，或其组合；较佳地为g9ahmt抑制剂bix01294、unc0638、unc0642。或
所述的ezh2hmt抑制剂是能够靶向抑制ezh2hmt，包括但不限于：epz005687、gsk343、tazemetostat(epz-6438)、unc1999、jq-ez-05(jqez5)、ebi-2511、cpi-1205、epz011989、pf-06726304、ei1、gsk503、gsk126、cpi-360、cpi-169，以及抑制ezh2hkmt的其他ezh2hkmt抑制剂或小分子化合物，或与它们等效的药剂制品、类似物、异构体和/或其盐、水合物或前体，或其组合；较佳地为epz005687、gsk343、unc1999；
所述化学小分子抑制剂：tgfβ抑制剂是能够靶向抑制tgfβ信号通路的抑制剂，包括(但不限于)：sb431542、a83-01、sb525334、ly2109761，repsox、sd-208、gw788388、sb505124、ew-7197，galunisertib，以及诱导抑制tgfβ信号通路的其他tgfβ小分子抑制剂，或与它们等效的药剂制品、类似物、异构体和/或其盐、水合物或前体，或其组合；较佳地为tgfβ抑制剂sb431542、a83-01、repsox。
7.如权利要求1-3任一所述的化学小分子组合物，其特征在于，所述化学小分子组合物是药物组合物，还包括：药学上可接受的载体或赋形剂；较佳地，所述载体或赋形剂包括选自下组的一种或多种：水、盐水、磷酸缓冲液或其它水性溶剂；dmso、甘油和乙醇或其它有机溶剂；微球、脂质体、微乳液或高分子表面活性剂；胶体型载药系统或高分子载药系统；防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、ph缓冲物质，黏合剂、填充剂、润滑剂或其它药物赋形剂；或
所述的化学小分子组合物可制备的药物剂型包括(但不限于)：固体剂型，包括(但不限于)粉剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂、控速释剂，或其他固体剂型；液体剂型，包括(但不限于)注射剂、输液剂、混悬剂，或其它液体剂型；气体剂型；或半固体剂型。
8.权利要求1-7任一所述的化学小分子组合物的用途，用于制备化学诱导体内外成纤维细胞直接重编程或转分化为肝细胞的制剂、试剂或培养基；或用于制备体内化学诱导原位成纤维细胞转分化为肝细胞，以其原位转分化肝细胞效应减少或降低细胞组织/器官的纤维化，达到治疗组织或器官纤维化疾病(如肝硬化/肝纤维化)的药物/药物前体/药物组合物；或
用于制备化学诱导体外成纤维细胞转分化的肝细胞。
9.一种化学诱导体内外成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的方法，包括：应用权利要求1-7任一所述的化学小分子组合物体内外诱导成纤维细胞转分化为肝细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法是不导入或不使用外源基因/转录因子/microrna及其rna、蛋白质或多肽等诱导因子；也不使用细胞因子或生长因子；仅用化学小分子组合物的方法；或
所述方法为制备体内原位诱导成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的药物组合物/药物前体/药物的方法；或为制备体内外诱导成纤维细胞直接重编程为肝细胞的小分子组合物的方法；或为制备诱导成纤维细胞直接重编程为肝细胞的培养基或试剂的方法；或为以小分子诱导成纤维细胞直接重编程为肝细胞，以制备转化肝细胞的方法。
11.一种用于化学诱导体内外成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的药盒或试剂盒，其特征在于，其中包括权利要求1-7任一所述的化学小分子组合物；或基于该小分子组合物添加药学上可接受的载体或赋形剂，用于体内化学诱导原位成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞，以其原位转分化效应减少或降低组织/器官的，而研发或制备成治疗临床纤维化疾病(如肝硬化/肝纤维化)的药物或前体药物/药物组合物；或添加有机溶剂/生理盐水/缓冲液/细胞基础培养基等载体或赋形剂制备的诱导成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的转分化培养基或试剂。
12.如权利要求1-7所述的任一小分子组合物、权利要求8-10任一所述的用途或方法、权利要求11所述的药盒或试剂盒，其特征在于，所述的成纤维细胞包括但不限于：人成纤维细胞或哺乳动物成纤维细胞；较佳地，包括但不限于人的：皮肤成纤维细胞、肝成纤维细胞(肝星状细胞)、肺成纤维细胞、肾成纤维细胞、胰腺成纤维细胞或人体其他组织或器官的成纤维细胞；更佳地为人皮肤成纤维细胞或肝成纤维细胞(肝星状细胞)。
技术总结