本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种具有黑色素细胞活性的细胞悬液的制备方法。
背景技术：
黑色素细胞功能失常是白癜风疾病患者发病的主要原因。处于早期的白癜风患者能通过给药的方式进行治疗与恢复，处于晚期的白癜风常常需要手术进行自体表皮移植，而有限的皮源则限制了自体皮源的广泛应用。
目前，基于自体表皮细胞提取-喷涂、体外组织工程表皮培养的方式取得了一定的成果，临床上也已有相关的产品并取得了一定的治疗效果，但是仍存在一定的问题，如黑色素细胞生长缓慢，增殖能力弱，体外培养过程中极易被其他细胞污染，导致细胞失活。另外，白癜风病变部位手术治疗后肤色与周围正常肤色差异较大，往往需要很长的时间才能复色。
技术实现要素：
有鉴于此，有必要提供一种能够提高表皮层治愈效果的具有黑色素细胞活性的细胞悬液的制备方法，该制备方法能够维持黑色素细胞的高活性，促进细胞粘附增殖，从而有利于构建具有色度的表皮层。
本发明提供一种具有黑色素细胞活性的细胞悬液的制备方法，包括以下步骤：
取健康皮肤的刃厚皮片；
将所述刃厚皮片放置在消化液中消化；
使用第一营养液清洗消化后的所述刃厚皮片后，将第二营养液滴加到清洗后的所述刃厚皮片上，刮取所述刃厚皮片的表皮，直至所述刃厚皮片的真皮层分离成若干块，得到混合细胞悬液，其中，所述第二营养液包括氢化可的松、胰岛素、l-丝氨酸、异丙肾上腺素以及胎牛血清；
过滤所述混合细胞悬液以去除部分所述真皮层以及表皮残渣；以及
使用所述第二营养液配置过滤后的所述混合细胞悬液，从而得到所述具有黑色素细胞活性的细胞悬液。
本发明提供的所述具有黑色素细胞活性的细胞悬液的制备方法能够维持黑色素细胞的高活性，促进细胞的粘附、迁移增殖和上皮化覆盖创面，从而有利于修复伤口以及构建具有色度的表皮层。
附图说明
图1是本发明较佳实施例提供的具有黑色素细胞活性的细胞悬液的制备流程图。
图2是本发明实施例1-2制备的具有黑色素细胞活性的细胞悬液的光学显微镜图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
请参阅图1，本发明较佳实施例提供一种具有黑色素细胞活性的细胞悬液的制备方法，包括以下步骤：
步骤s11，取健康皮肤的刃厚皮片(即表层皮片)。
具体地，对患者取皮部位进行皮肤消毒处理，使用取皮机取患者健康皮肤的刃厚皮片。其中，所述刃厚皮片的厚度为200-500μm。
步骤s12，将所述刃厚皮片放置在消化液中消化。
具体地，将所述刃厚皮片浸泡在消化液中消化15-45min，其中，每平方厘米的所述刃厚皮片上所述消化液的用量为3-7ml，消化温度37℃，一定时间之后使用刮刀刮取消化后的所述刃厚皮片中的表皮，如果能轻松刮下所述表皮，则进行下一步操作；如果无法轻松刮下所述表皮，则将所述刃厚皮片放回所述消化液中继续消化，直至能刮下所述表皮为止。其中，所述消化的总时间不可超过45min。
其中，所述消化液包括浓度为0.25％-0.75％的胰酶、浓度为0.05％的乙二胺四乙酸(edta)以及浓度为0-1000ng/ml的人重组表皮细胞生长因子(rh-egf)。
步骤s13，使用第一营养液清洗消化后的所述刃厚皮片后，将第二营养液滴加到清洗后的所述刃厚皮片上，刮取所述刃厚皮片的表皮，直至所述刃厚皮片的真皮层分离成若干块，得到混合细胞悬液。
具体地，将消化后的所述刃厚皮片放置在第一营养液中清洗三次后，将所述表皮朝上放置于操作台上，向所述表皮上滴加少许第二营养液，使用所述刮刀轻刮所述表皮，直至所述表皮中的真皮层分离成若干小块，并用注射器收集所有液体，得到混合细胞悬液。
其中，所述第一营养液包括林格氏缓冲液、复方电解质缓冲液以及生理盐水中的至少一种。
在本实施例中，所述第二营养液包括混合培养基、氢化可的松、胰岛素、l-左旋肉碱、l-丝氨酸、亚油酸、异丙肾上腺素、角化细胞生长因子(kgf)以及胎牛血清。其中，在所述第二营养液中，所述氢化可的松的浓度为0.1-2μm、所述胰岛素的浓度为0.05-1μm、所述l-左旋肉碱的浓度为1-10μm、所述l-丝氨酸的浓度为1-10μm、所述亚油酸的浓度为10-15μm、所述异丙肾上腺素的浓度为1-5μm、所述角化细胞生长因子的浓度为0.1-2ng/ml、所述胎牛血清的浓度为4-5％。在本实施例中，所述混合培养基由dmem培养基与ham’sf-12培养基以体积比3:1混合得到。
其中，所述第二营养液可保持黑色素细胞的活性，从而促进细胞的粘附与增殖。
步骤s14，过滤所述混合细胞悬液以去除部分所述真皮层以及表皮残渣。
具体地，使用100μm的筛网过滤所述混合细胞悬液以去除大块真皮层及表皮残渣。
步骤s15，使用所述第二营养液配置过滤后的所述混合细胞悬液，从而得到所述具有黑色素细胞活性的细胞悬液。
具体地，使用所述第二营养液配置过滤后的所述混合细胞悬液，可得到所需浓度的所述具有黑色素细胞活性的细胞悬液。
其中，所述具有黑色素细胞活性的细胞悬液包括表皮细胞、成纤维细胞、黑色素细胞以及朗格汉斯细胞。
其中，上述步骤s11至s15均需保持无菌操作。
使用上述制备方法制备的所述具有黑色素细胞活性的细胞悬液可以用于治疗皮肤缺损。具体地，将所述具有黑色素细胞活性的细胞悬液直接喷涂于受损的皮肤上。其中，受损的皮肤可为皮肤表层疾病(如白癜风)以及表皮损伤。此外，所述具有黑色素细胞活性的细胞悬液也可与人工真皮联用以治疗皮肤缺损。
下面通过实施例对本发明进行具体说明。
实施例1
第一步，使用取皮机取健康皮肤刃厚皮片。其中，所述刃厚皮片的厚度为200μm，所述刃厚皮片的尺寸为1x1cm。
第二步，将所述刃厚皮片浸泡在5ml的消化液中，于37℃消化15-45min，一定时间之后用刮刀刮取消化后的所述刃厚皮片中的表皮，如果能轻松刮下所述表皮，则进行下一步操作；如果无法轻松刮下所述表皮，则放回所述消化液中继续消化，直至能刮下所述表皮为止，其中，所述消化的总时间不可超过45min。其中，所述消化液包括浓度为0.5％的胰酶以及浓度为0.05％的edta。
第三步，将消化后的所述表皮在第一营养液中清洗三次后，将所述表皮朝上放置于操作台上，滴加少许第二营养液，使用所述刮刀轻刮所述表皮，直至所述表皮中的真皮层分离成若干小块，收集所有液体，得到混合细胞悬液。其中，所述第一营养液为生理盐水，所述第二营养液包括混合培养基(由dmem培养基与ham’sf-12培养基以体积比3:1混合得到)、浓度为1μm的氢化可的松、浓度为0.1μm的胰岛素、浓度为10μm的l-左旋肉碱、浓度为10μm的l-丝氨酸、浓度为15μm的亚油酸、浓度为1μm的异丙肾上腺素、浓度为2ng/ml的kgf以及浓度为5％的胎牛血清。
第四步，使用100μm筛网过滤所述混合细胞悬液，以去除大块真皮层及表皮残渣，收集滤液。
第五步，使用所述第二营养液配置过滤后的所述混合细胞悬液，从而得到细胞浓度为5x106/ml的具有黑色素细胞活性的细胞悬液。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：
在第一步中，所述刃厚皮片的厚度为300μm，所述刃厚皮片的尺寸为2x1cm。
在第二步中，将所述刃厚皮片浸泡在10ml的消化液中，所述消化液包括浓度为0.5％的胰酶、浓度为0.05％的edta以及浓度为8ng/ml的rh-egf。
在第三步中，所述第一营养液为林格氏缓冲液。所述第二营养液包括混合培养基(由dmem培养基与ham’sf-12培养基以体积比3:1混合得到)、浓度为1μm的氢化可的松、浓度为0.1μm的胰岛素、浓度为10μm的l-左旋肉碱、浓度为10μm的l-丝氨酸、浓度为15μm的亚油酸、浓度为1μm的异丙肾上腺素、浓度为2ng/ml的kgf以及浓度为4％的胎牛血清。
在第五步中，所述具有黑色素细胞活性的细胞悬液中的细胞浓度为1x107/ml。
将实施例1-2制备的具有黑色素细胞活性的细胞悬液分别应用于疾病治疗，具体如下：
实施例1获得的具有黑色素细胞活性的细胞悬液应用为：将白癜风创面消毒后使用取皮机取皮，取皮厚度为100μm，再将实施例1获得的具有黑色素细胞活性的细胞悬液直接喷涂于白癜风创面上，并用创面敷料覆盖包扎。
实施例2获得的具有黑色素细胞活性的细胞悬液应用为：将实施例2获得的具有黑色素细胞活性的细胞悬液直接喷涂于人工真皮支架表面，并用创面敷料覆盖后包扎。
请参阅图2，由图可知，本发明实施例1-2制备的所述具有黑色素细胞活性的细胞悬液中的表皮细胞、成纤维细胞、黑色素细胞(黑色箭头)以及朗格汉斯细胞均具有良好的生长状态，且均保持较高的活性。
本发明提供的所述具有黑色素细胞活性的细胞悬液的制备方法能够维持黑色素细胞的高活性，促进细胞的粘附、迁移增殖和上皮化覆盖创面，从而有利于修复伤口以及构建具有色度的表皮层。
以上实施方式仅用以说明本发明实施例的技术方案而非限制，尽管参照以上较佳实施方式对本发明实施例进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明实施例的技术方案进行修改或等同替换都不应脱离本发明实施例的技术方案的精神和范围。
1.一种具有黑色素细胞活性的细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
取健康皮肤的刃厚皮片；
将所述刃厚皮片放置在消化液中消化；
使用第一营养液清洗消化后的所述刃厚皮片后，将第二营养液滴加到清洗后的所述刃厚皮片上，刮取所述刃厚皮片的表皮，直至所述刃厚皮片的真皮层分离成若干块，得到混合细胞悬液，其中，所述第二营养液包括氢化可的松、胰岛素、l-丝氨酸、异丙肾上腺素以及胎牛血清；
过滤所述混合细胞悬液以去除部分所述真皮层以及表皮残渣；以及
使用所述第二营养液配置过滤后的所述混合细胞悬液，从而得到所述具有黑色素细胞活性的细胞悬液。
2.如权利要求1所述的具有黑色素细胞活性的细胞悬液的制备方法，其特征在于，在所述第二营养液中，所述氢化可的松的浓度为0.1-2μm、所述胰岛素的浓度为0.05-1μm、所述l-丝氨酸的浓度为1-10μm、所述异丙肾上腺素的浓度为1-5μm、所述胎牛血清的浓度为4％-5％。
3.如权利要求1所述的具有黑色素细胞活性的细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述第二营养液还包括l-左旋肉碱、亚油酸以及角化细胞生长因子。
4.如权利要求3所述的具有黑色素细胞活性的细胞悬液的制备方法，其特征在于，在所述第二营养液中，所述l-左旋肉碱的浓度为1-10μm、所述亚油酸的浓度为10-15μm、所述角化细胞生长因子的浓度为0.1-2ng/ml、所述胎牛血清的浓度为4％-5％。
5.如权利要求1所述的具有黑色素细胞活性的细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述第二营养液还包括dmem培养基和ham’sf-12培养基。
6.如权利要求1所述的具有黑色素细胞活性的细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述消化液包括浓度为0.25％-0.75％的胰酶、浓度为0.05％的乙二胺四乙酸以及浓度为0-1000ng/ml的人重组表皮细胞生长因子。
7.如权利要求1所述的具有黑色素细胞活性的细胞悬液的制备方法，其特征在于，每平方厘米的所述刃厚皮片上所述消化液的用量为3-7ml，所述消化的时间为15-45min。
8.如权利要求1所述的具有黑色素细胞活性的细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述刃厚皮片的厚度为200-500μm。
9.如权利要求1所述的具有黑色素细胞活性的细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述第一营养液包括林格氏缓冲液、复方电解质缓冲液以及生理盐水中的至少一种。
10.如权利要求1所述的具有黑色素细胞活性的细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述具有黑色素细胞活性的细胞悬液包括表皮细胞、成纤维细胞、黑色素细胞以及朗格汉斯细胞。
技术总结