本申请为申请号为2020105177713、发明题目为“一种肺动脉组织单细胞悬液的制备方法及应用”的发明专利申请的分案申请。
本发明提供一种用于单细胞测序的肺动脉内膜剥脱组织单细胞悬液及其制备方法和应用，属于生物医学技术领域，具体涉及一种用于单细胞测序的肺动脉内膜剥脱组织单细胞悬液的制备方法及应用。
背景技术：
慢性血栓栓塞性肺动脉高压(chronicthromboembolicpulmonaryhypertension，cteph)是以呼吸困难、乏力和活动耐力减低为特征表现的一种疾病，由于没有溶解的血栓栓子堵塞近端肺动脉，并伴有远端肺血管重塑，导致肺血管阻力增加，肺动脉压力进行性升高及右心负荷逐渐增加，最终进展至右心衰竭，是一种严重的、进行性的、致死性的疾病。cteph发病率呈逐年升高趋势，由于发病隐匿、进展迅速、死亡率很高，已经成为严重危害人类生命与健康的全球性医疗保健问题。临床上对cteph患者的诊断和治疗仍然面临很多挑战，近端机化血栓与相应的内膜增厚大部分可以通过肺动脉血栓内膜剥脱手术解决，而远端病变无法手术和术后残余肺动脉高压则可能需要内科靶向药物治疗。
大量研究表明，cteph的发生发展是一个多个基因、多种细胞、多种因素和多个信号转导系统的异常共同参与的过程，但究竟哪些因素及具体分子机制尚未完全阐明。目前认为多种细胞在疾病发生发展中发挥作用，肺动脉内皮细胞功能障碍，肺动脉平滑肌细胞异常增殖，多种炎症细胞导致炎症反应，最终导致肺血管重塑，在cteph的进展中发挥重要作用，因此，明确参与cteph发生发展进程的全面完整的细胞图谱十分重要。
近年来，随着生物研究领域技术的飞速发展，单细胞测序技术应运而生，它是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术。单细胞测序能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达情况，对细胞进行分类比较，反映细胞间的异质性，在肿瘤、发育生物学、免疫学、微生物学等领域发挥重要作用。
目前，疾病相关的单细胞测序研究也日益增加，单细胞测序能够捕捉到每个细胞独特的发育变化，同时在单细胞层面绘制复杂机体的细胞图谱，探索机体细胞的类型、作用及发展过程，获得单细胞水平的数字化基因表达谱，可实现成千上万个单细胞群体分析，解决常规方法在通量和数据量方面的不足，为单细胞研究开拓新的思路，实现对细胞群体的划分与细胞群体间基因表达差异的检测，是细胞异质性、细胞发育、细胞群体检测研究等领域的重要方法，为疾病分型、疾病治疗策略、疾病药物治疗药效预测、新药研发等提供新的方向。
单细胞测序技术已被成功地用于明确正常组织中的复杂亚群，可以在单个细胞水平上研究分子差异并重建谱系层次结构，因此，我们可以利用单细胞测序明确肺动脉剥脱组织的细胞类型及亚型，进一步绘制cteph疾病相关细胞图谱。
为了对每个细胞中的信息进行单独标记用于数据分析，单细胞测序开始前的细胞必须是单个悬浮且完整的活细胞，因此单细胞测序对样本要求比较高，包括细胞悬浮状态、浓度、活率等。目前的实现方法是将单细胞分离设备送到医院，手术获取的新鲜组织立即进行消化及后续的分离处理，使实验在成本、时间、地点等方面受到较大限制。而且单细胞测序实验需要大量的分离的、细胞活性高于90％(原代细胞活性高于70％)的细胞，目前大多数研究血管来源的细胞方法，无论是分离新鲜组织获取细胞还是获得原代培养细胞，都不适合用于单细胞测序。肺动脉剥脱组织不易获得高活率的单细胞悬液，并且单细胞悬液也不易运输，因为运输过程中无法保证细胞活率。因而，开发一种简单便捷、易于操作的分离人肺动脉剥脱组织，并能获得高活率的单细胞悬液的方法迫在眉睫。
技术实现要素：
本发明所述制备方法包括将手术术后获取的肺动脉内膜剥脱组织标本进行分离、清洗、修块、孵育、酶解消化后可获得单细胞悬液。本发明制备得到肺动脉内膜剥脱组织单细胞悬液在保证细胞质量的同时，还可一次性获得大量分离的肺动脉内膜剥脱组织来源的细胞。本方法只需简单的试剂耗材，不需要高度专业化的设备、试剂或技能，不受时间、地点的限制，便可从较少的肺动脉内膜剥脱组织组织中获得足量、完整的细胞用于单细胞测序，便于研究人员进行操作，因此具有良好的实际应用价值。
具体来说，本发明的方法包括以下步骤：
对于手术获得的肺动脉内膜剥脱组织标本进行分离、清洗、修块，选取内膜淡黄色组织成分，尽可能去除剥脱组织内血性血栓成分，以及肌化的内膜组织，因为此部分组织几乎不含细胞成分，影响后续单细胞悬液制备的效率，不利于单细胞悬液制备。将分离、清洗、修块处理完毕的内膜淡黄色组织成分放入组织保存液保存，然后进行后续的单细胞悬液制备。
酶解液1中处理组织标本，处理温度为30-40℃，优选为37℃。向酶解液中加入dnaasei，滤网过滤经处理的样品，重悬细胞，加入酶解液2，酶解液2溶液配制中加入多种胶原酶，利于细胞解离，减少细胞成团现象发生，有利于提高细胞回收率，酶解消化。
取上清，滤网过滤，重悬后，加裂红液，消除红细胞的干扰；终止裂红后，离心收集。
去死细胞磁珠重悬细胞，室温孵育，加入到润洗后的磁珠柱中，收集溶液，离心。
重悬细胞，并稀释成不同浓度；选择“ao/pi活率”测定，然后由仪器测试，观察细胞直径分布。ao/pi双荧光计数法用来检测细胞浓度和活率。
细胞染色液由吖啶橙(ao)(绿色荧光核酸染料)和碘化丙锭(pi)(红色荧光核酸染料)混合而成。碘化丙锭不具有膜透过性，只能进入细胞膜受损的细胞，而吖啶橙能够穿过所有的细胞群体。当两种染料同时存在于细胞核中，碘化丙锭能够通过荧光共振能量转移引起吖啶橙荧光的减少。因此，具有完整细胞膜的有核细胞染绿色荧光并被计为活细胞，而有受损细胞膜的有核细胞仅染红色荧光并被计为死细胞。
具体来说，本发明的肺动脉组织单细胞悬液的制备方法，包括以下步骤：
选取肺动脉内膜淡黄色组织成分作为组织标本；其中所述的肺动脉内膜淡黄色组织成分由手术获得，并需经分离、清洗、修块，尽可能去除剥脱组织内血性血栓成分以及肌化的内膜组织；
将选取的组织标本放入组织保存液保存；
用酶解液1处理步骤2)获得的组织标本，所述的酶解液1是在1640培养基中加入胶原酶i及cacl2，处理温度为30-40℃；所述的胶原酶i的终浓度为2.5mg/ml，所述的处理温度优选37℃；
向酶解液1中加入dnaasei，充分消化组织；所述的dnaasei终浓度优选为50u/ml；
过滤经处理的样品，收集细胞，并加入酶解液2进一步酶解，所述的酶解液2中包含胶原酶i、胶原酶ii、胶原酶xi、弹性蛋白酶和dnaasei；所述的酶解液2是通过向1640培养基中加入终浓度为1mg/ml胶原酶i、1mg/ml胶原酶ii、0.2mg/ml胶原酶xi、1.8u/ml弹性蛋白酶、50u/mldnaasei及2.5mmcacl2制成的；
过滤步骤5)获得的样品，重悬后，加裂红液，消除红细胞的干扰；终止裂红后，离心收集；
过滤步骤经由滤网进行。
用去死细胞的磁珠来重悬细胞，室温孵育，加入到润洗后的磁珠柱中，收集过滤得到的溶液，离心；
重悬细胞，并稀释成不同浓度；
任选地，选择“ao/pi活率”测定，来检测细胞浓度和活率。
以上制备方法各步骤在无菌条件下进行，从而避免因细菌污染造成对后续单细胞测序的影响。应用上述制备方法可以制备得到肺动脉内膜剥脱组织的单细胞悬液。采用本发明制备方法得到的肺动脉内膜剥脱组织单细胞悬液中细胞活性高，品质好，而且细胞分离度较高，结团率低，有利于进行后续单细胞测序。
本发明基于10xgenomics平台，可以一次性分离并标记5000个单细胞，并在单细胞水平进行基因表达检测，为单细胞研究提供更具扩展性的平台。将带有条形码和引物的凝胶珠和单个细胞包裹在油滴中；接下来在每个油滴内，凝胶珠溶解，细胞裂解释放mrna，通过逆转录产生用于测序的带条形码的cdna。液体油层破坏后，cdna后续进行文库构建，使用illumina测序平台对文库进行测序检测、质控，获取原始数据，分析原始数据，对原始数据归一化处理，进行t-sne(t分布随机邻域嵌入)降维分析用于数据可视化，为深入分析样品的异质性，基于基因表达水平对细胞进行分群，彼此靠近的细胞对具有更相似的基因表达谱，最终得到应用于单细胞测序技术的肺动脉内膜剥脱组织的细胞分群结果。本发明制备得到的单细胞悬液是质量高，活性高，具有很高的应用价值。通过本发明方法制备的单细胞悬液可以比较方便、快捷、高效应用于单细胞测序检测。
附图说明
图1是肺动脉内膜剥脱组织标本选取及处理组织示例，其中图1a是肺动脉内膜剥脱组织标本大体观示意图；图1b是保存于组织保存液的内膜淡黄色组织示意图；图1c图示酶解液处理的用于单细胞悬液制备的内膜淡黄色组织成分。
图2表示荧光计数仪仪器测定得到细胞直径分布图，观察细胞直径大小分布情况。
图3表示荧光计数仪仪器利用双荧光计数法(ao/pi)检测细胞浓度和活率情况。图3a-1：活细胞荧光强度分布图，图3a-2：死细胞荧光强度分布图。图3b：细胞悬液的明场和荧光图像。
图4表示illumina测序平台测序质控数据及细胞数结果。
图5表示细胞分群二维展示图。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
组织标本的获取及处理：
手术中获得肺动脉内膜剥脱组织标本(图1a)。选取手术获得的肺动脉内膜剥脱组织标本进行分离、清洗、修块(图1b)，选取内膜淡黄色组织成分进行单细胞悬液制备，尽可能去除剥脱组织内血性血栓成分，以及肌化的内膜组织，因为此部分组织几乎不含细胞成分，影响后续单细胞悬液制备的效率，不利于单细胞悬液制备。酶解液处理的用于单细胞悬液制备的内膜淡黄色组织成分(图1c)。
单细胞悬液制备：
肺动脉内膜剥脱组织单细胞悬液制备及计数具体步骤：
(1)用2.0ml离心管配置1ml酶解液1，具体方法是：向1640培养基中加入终浓度为2.5mg/ml胶原酶i及2.5mmcacl2；
(2)用pbs彻底清洗组织中碎片，将组织转移到酶解液中(图1c)；用剪刀剪碎组织，放入30-40℃，优选为37℃，培养箱中的旋转摇床上，约20rpm消化30-60min，优选为40min，既有利于获得活性较高的组织来源单细胞，便于后续单细胞测序处理；同时，也有利于提高细胞回收率；
(3)取出离心管室温静置30s，将上清转移至新离心管，冰浴保存，向没有完全消化的组织沉淀中再次加入1ml酶解液1，再旋转消化20min，使组织充分消化；
(4)向酶解液中加入终浓度50u/mldnaasei，再旋转消化10min，充分消化组织；
(5)将步骤4中收集的上清与步骤5中的溶液合并，30μm(结合已获取细胞直径大小分布状况，见图2，优选采用此型号滤网)滤网过滤，10ml1640培养基清洗滤网，400g，4℃，离心5min；
(6)去除上清，1ml1640培养基重悬细胞，重悬过程中减少对细胞的震荡，有利于细胞活性的提高，计数(细胞数过低不支持后续实验)；
(7)用1640培养基清洗剩余组织，加入酶解液2，即向1640培养基中加入终浓度为1mg/ml胶原酶i、1mg/ml胶原酶ii、0.2mg/ml胶原酶xi、1.8u/ml弹性蛋白酶、50u/mldnaasei及2.5mmcacl2，吹打混匀，放入37℃培养箱旋转摇床20prm消化40min；
(8)吸取上清，用30μm滤网滤过，10ml1640培养基清洗滤网，300g，4℃，离心5min；
(9)去除上清，1mlpbs重悬，加3ml裂红液，吹打混匀，静置8min，4mlpbs终止裂红后，300g，4℃，离心5min；
(10)去除上清，取100μl去死细胞磁珠重悬细胞，室温孵育15min，加入到润洗后的磁珠柱中，收集过滤得到的溶液，200g，4℃，离心5min；
(11)200μlpbs重悬细胞，计数；
(12)用pbs将上述样品稀释成5种不同浓度；
(13)将12μlao/pi染色液加入到12μl样品中，用移液器轻轻混合；
(14)将20μl混合物吸入细胞计数板；
(15)让细胞在计数板上静置约1min，将计数板放入计数仪器中计数；
(16)选择“ao/pi活率”测定，然后由仪器测试，观察细胞直径分布(图2)。ao/pi双荧光计数法用来检测细胞浓度和活率(图3)。
以上制备方法各步骤在无菌条件下进行，从而避免因细菌污染造成对后续单细胞测序的影响。应用上述制备方法制备得到的肺动脉内膜剥脱组织的单细胞悬液中细胞活性高，品质好，而且细胞分离度较高，结团率低，有利于进行后续单细胞测序。
本发明基于10xgenomics平台，可以一次性分离并标记5000个单细胞，并在单细胞水平进行基因表达检测，为单细胞研究提供更具扩展性的平台。采用v3单细胞试剂试剂盒，按照10xgenomics标记单细胞文库流程，将制备好的单细胞悬浮液与含有barcode信息的凝胶珠以及酶的混合物结合，然后被位于微流体“双十字”连接中的油滴包裹，从而形成gems(gelbead-in-emulsions)，在gems内进行细胞裂解和逆转录反应，有效gems中，10xbarcode将与cdna产物连接在一起，再将gems破碎并打碎油滴，以cdna为模板进行pcr扩增，cdna扩增完成以后，针对扩增产物进行质检。扩增产物质检合格以后，进行测序文库构建。文库完成以后进行库检，库检合格以后，利用illumina测序平台进行测序，获得测序序列数据，即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据，从而实现在单细胞水平进行表达测序的目的。原始测序数据用fastq格式，采用fastqc软件进行数据质量评估，提取cell-barcode(单个gem液滴的序列称呼)，umi(uniquemolecularidentifier，唯一分子识别标签)，rna序列与参考基因组比对，基于rna序列唯一比对结果和umi序列，对umi进行校正，进而去除测序中出现的pcr重复。识别有效细胞后，生成gene-barcode矩阵，记录不同细胞基因的表达值。cellranger软件基于基因表达水平对细胞进行分群。对表达数据umi归一化，进行t-sne(t分布随机邻域嵌入)降维分析用于可视化，彼此靠近的细胞对具有更相似的基因表达谱，最终得到细胞分群结果。测序质控数据及细胞数结果见图4，为了深入分析样品的异质性，基于基因表达水平对细胞进行分群，结果见图5，通过本发明方法制备的单细胞悬液可以比较方便、快捷、高效应用于单细胞测序检测。上述结果均表明本发明制备得到的单细胞悬液质量高，活性高，具有很高的应用价值。
基于10xgenomics平台，进行文库构建。本发明基于10xgenomics平台，可以一次性分离并标记5000个单细胞，并在单细胞水平进行基因表达检测，为单细胞研究提供更具扩展性的平台。将带有条形码和引物的凝胶珠和单个细胞包裹在油滴中；接下来在每个油滴内，凝胶珠溶解，细胞裂解释放mrna，通过逆转录产生用于测序的带条形码的cdna。液体油层破坏后，cdna后续进行文库构建。然后使用illumina测序平台对文库进行测序检测，测序质控数据及细胞数结果见图4，为了深入分析样品的异质性，基于基因表达水平对细胞进行分群，结果见图5，上述结果表明本发明制备得到的单细胞悬液是质量高，活性高。
1.一种肺动脉组织单细胞悬液，其按照下述的方法制备和任选地检测，所述方法特征在于包括以下步骤：
1)选取肺动脉内膜淡黄色组织成分作为组织标本；
2)将选取的组织标本放入组织保存液保存；
3)用酶解液1处理步骤2)获得的组织标本，所述的酶解液1是在1640培养基中加入胶原酶i及cacl2，处理温度为30-40℃；
4)向酶解液1中加入dnaasei，充分消化组织；
5)过滤经处理的样品，收集细胞，并加入酶解液2进一步酶解，所述的酶解液2中包含胶原酶i、胶原酶ii、胶原酶xi、弹性蛋白酶和dnaasei；
6)过滤步骤5)获得的样品，重悬后，加裂红液，消除红细胞的干扰；终止裂红后，离心收集；
7)用去死细胞的磁珠来重悬细胞，室温孵育，加入到润洗后的磁珠柱中，收集过滤得到的溶液，离心；
8)重悬细胞，并稀释成不同浓度；
9)任选地，选择“ao/pi活率”测定，来检测细胞浓度和活率。
2.如权利要求1所述的肺动脉组织单细胞悬液，其中步骤3)所述的胶原酶i的终浓度为2.5mg/ml。
3.如权利要求1所述的肺动脉组织单细胞悬液，其中步骤3)所述的处理温度为37℃。
4.如权利要求1所述的肺动脉组织单细胞悬液，其中步骤4)所述的dnaasei终浓度是50u/ml。
5.如权利要求1所述的肺动脉组织单细胞悬液，其中步骤5)所述的酶解液2是通过向1640培养基中加入终浓度为1mg/ml胶原酶i、1mg/ml胶原酶ii、0.2mg/ml胶原酶xi、1.8u/ml弹性蛋白酶、50u/mldnaasei及2.5mmcacl2制成的。
6.根据权利要求1所述的肺动脉组织单细胞悬液，其中所述的肺动脉内膜淡黄色组织成分由手术获得，并需经分离、清洗、修块，尽可能去除剥脱组织内血性血栓成分以及肌化的内膜组织。
7.根据权利要求1所述的肺动脉组织单细胞悬液，其中所述的过滤步骤经由滤网进行。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的肺动脉组织单细胞悬液，其中各步骤在无菌条件下进行。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的肺动脉组织单细胞悬液在单细胞测序中的应用。
10.权利要求9所述的肺动脉组织单细胞悬液的应用，其中，将制备的单细胞悬液应用于10xgenomics平台，进行文库构建，获取测序质控数据、序列数据和单细胞基因表达数据，从而完成单细胞水平的基因表达检测。
技术总结