本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种皱纹盘鲍肝胰腺细胞的分离和原代培养方法。
背景技术：
鲍鱼又称鳆鱼、海耳等，属软体动物门(mollusca)，腹足纲(gastropoda)、鲍科(haliotidae)，是我国八大海珍品之首。由于其营养物质丰富、味道鲜美及口感独特，深受人们的喜爱(颜琳等，2019)。皱纹盘鲍(haliotisdiscushanai)是我国主要北方的鲍鱼养殖品种，目前，对于皱纹盘鲍营养代谢和免疫应激方面的研究日益广泛深入。然而，鲍鱼的养殖周期较长，且容易受到环境等众多因素的影响，限制了科学实验开展的进度和效率。体外细胞水平的研究具有研究周期短、条件稳定可控、可重复性高等优点，建立稳定可靠的鲍鱼细胞培养模型，将为体外实验提供便利以及更多材料选择，对进一步研究鲍鱼的营养代谢和免疫等分子机理具有重要意义。
肝胰腺作为软体动物最大的腺体，在消化、吸收、代谢及免疫等多种生理过程中发挥着十分重要的作用(崔龙波等，2011)，体外培养的肝胰腺细胞既能够基本保持肝胰腺的特性，又可以排除体内其它因素的干扰，作为研究特异性营养代谢过程和肝胰腺功能的重要工具，培养皱纹盘鲍肝胰腺细胞可为今后研究鲍鱼的营养代谢和免疫研究奠定基础。目前在皱纹盘鲍中已有血、鳃、外套膜、肾脏、足肌等组织的体外培养方法(李霞等，1997；崔龙波等，2000)，肝胰腺细胞培养方法尚未见报道。肝胰腺组织结构及内容物十分复杂，对肝胰腺细胞的分离过程造成了一定困难，自身带有部分细菌，易造成污染且培养过程中易出现细胞团块凝集的问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种皱纹盘鲍肝胰腺细胞的分离和原代培养方法，以解决现有技术中对肝胰腺细胞的分离过程造成了一定困难，自身带有部分细菌，易造成污染且培养过程中易出现细胞团块凝集的问题。
为实现以上目的，本发明采用如下技术方案：一种皱纹盘鲍肝胰腺细胞的分离和原代培养方法，包括：
获取皱纹盘鲍的肝胰腺；
采用胶原酶消化法对所述肝胰腺进行处理并进行过筛，得到过筛液；
对所述过筛液进行多次沉淀重悬处理，得到细胞悬液；
将所述细胞悬液接种到六孔细胞培养板中，采用膜封口后置于培养箱中，每2d更换一次鲍细胞的完全培养基。
进一步的，所述获取皱纹盘鲍的肝胰腺细胞，包括：
选取健康的鲍鱼体，采用75％酒精对所述鲍鱼体进行消毒处理；
用灭菌的解剖工具将壳剥离后，再次用75％的酒精对鲍鱼软体部分消毒处理，用镊子和剪刀去除包裹在肝胰腺外的性腺和结缔组织后，剪下肝胰腺；
采用75％酒精对所述肝胰腺清洗消毒后，放入无菌海水中并置于转摇床消毒清洗1h。
进一步的，所述采用胶原酶消化法对所述肝胰腺进行处理，得到肝胰腺细胞，包括：
将肝胰腺从海水中取出后，用添加抗生素预冷的d-pbs缓冲液再清洗消毒两次；
将所述肝胰腺剪成0.5-2mm2的块，放入含有百分比为0.25％的iv型胶原酶的培养皿中消化10min，中间吹打两次；
消化完成后，加入完全培养基，将细胞研磨过70μm细胞筛，得到过筛液。
进一步的，所述对所述过筛液进行多次沉淀重悬处理，得到细胞悬液，包括：
收集过筛液，采用转速为1000rpm，持续时间为3min，弃上清液后，用完全培养基对沉淀重悬并重复离心两次，取沉淀；
将所述沉淀重悬，其采用600rpm离心2min，弃上清液后取沉淀；
用完全培养基将得到的沉淀重悬，采用100rpm离心2min，收集上清液，过70μm细胞筛，得到细胞滤液；
将所述细胞滤液静置5min，采用100rpm离心30s，收集上清液并加入完全培养基进行稀释混匀，得到细胞悬液。
进一步的，所述六孔细胞培养板的每个孔为1.5ml，所述培养箱的温度为22℃。
进一步的，还包括
制备皱纹盘鲍肝胰腺细胞的完全培养基，所述培养基组分包括：l-15基础培养基、胎牛血清、青链霉素混合液100×、硫酸庆大霉素、两性霉素b、nacl、kcl、cacl2、硫酸镁、氯化镁、iv型胶原酶、dapi溶液、75％酒精、d-pbs缓冲液、台盼蓝。
进一步的，还包括：
对细胞及细胞活性进行鉴定；
所述对细胞及细胞活性进行鉴定，包括：
采用dapi染色法对细胞进行鉴定；
采用台盼蓝染色法对细胞活性进行鉴定。
进一步的，所述采用dapi染色法对细胞进行鉴定，包括：
在完全培养基中入200uldapi试剂，充分混匀后，室温染色10min；
吸弃dapi染色液，用pbs洗涤3次，每次5分钟；
加入适量培养基，置于荧光显微镜下观察，激发波长为360-400nm；
其中，被染色的即为细胞。
进一步的，所述采用台盼蓝染色法对细胞活性进行鉴定，包括：
用pbs将台盼蓝稀释至质量分数为0.4％；
将完全培养基与0.4％台盼蓝溶液以9∶1的比例加入150ul台盼蓝；
置于显微镜下观察；其中，死细胞被染成蓝色，而活细胞拒染呈无色透明。
本发明采用以上技术方案，能够达到的有益效果包括：
本发明提供一种皱纹盘鲍肝胰腺细胞的分离和原代培养方法，包括获取皱纹盘鲍的肝胰腺；采用胶原酶消化法对所述肝胰腺进行处理并进行过筛，得到过筛液；对所述过筛液进行多次沉淀重悬处理，得到细胞悬液；将所述细胞悬液接种到六孔细胞培养板中，采用膜封口后置于培养箱中，每2d更换一次鲍细胞的完全培养基。本发明采用胶原酶消化法对皱纹盘鲍肝胰腺细胞进行处理，可以在较短时间内获得更为纯净且较为足量的皱纹盘鲍原代肝胰腺细胞，为研究皱纹盘鲍营养代谢和免疫等进行体外实验提供更多材料选择。且通过优化实验条件和方法进一步提高了肝胰腺细胞的贴壁能力，解决了在培养过程中易出现细胞团块凝集的问题，获得纯净且数量较大的肝胰腺细胞。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1a为本发明离心转速为1000rpm的上清液的细胞形态图；
图1b为本发明离心转速为600rpm的上清液的细胞形态图；
图1c为本发明离心转速为400rpm的上清液的细胞形态图；
图1d为本发明离心转速为600rpm 400rpm的上清液的细胞形态图；
图1e为本发明离心转速为600rpm 200rpm的上清液的细胞形态图；
图1f为本发明离心转速为600rpm 100rpm的上清液的细胞形态图；
图2a为本发明提供的方法优化前的细胞培养过程中胞凝集团块形态图；
图2b为本发明提供的方法优化后的细胞培养过程中胞凝集团块形态图；
图3a为本发明细胞启动培养2h后的电子显微镜图；
图3b为本发明细胞启动培养24h后的电子显微镜图；
图3c为本发明细胞启动培养120h后的电子显微镜图；
图4为本发明培养后的细胞的dapi染色结果示意图；
图5为本发明培养后的细胞的台盼蓝染色结果示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
下面结合附图介绍本申请实施例中提供的一个具体的皱纹盘鲍肝胰腺细胞的分离和原代培养方法。
如图1所示，本申请实施例中提供的皱纹盘鲍肝胰腺细胞的分离和原代培养方法包括：
s101，获取皱纹盘鲍的肝胰腺；
s102，采用胶原酶消化法对所述肝胰腺进行处理并进行过筛，得到过筛液；
s103，对所述过筛液进行多次沉淀重悬处理，得到细胞悬液；
s104，将所述细胞悬液接种到六孔细胞培养板中，采用膜封口后置于培养箱中，每2d更换一次鲍细胞的完全培养基。
本申请中完全培养基包括：l15培养基(gibco)、胎牛血清(biologicalindustries)、青链霉素混合液100×(索莱宝)、硫酸庆大霉素(索莱宝)、两性霉素b(索莱宝)、nacl(sigma)、kcl(sigma)、cacl2(sigma)、硫酸镁(sigma)、氯化镁(sigma)、iv型胶原酶(mpbiomedicals)、dapi溶液(g-clone)、75％酒精、d-pbs缓冲液(索莱宝)、trypanblue(biotopped)。
实验试剂的配置：1、天然海水用0.22μm过滤器过滤，再经高压灭菌锅121℃，30min高压灭菌，冷却后加入青霉素(100iu/ml)、链霉素(100μg/ml)、庆大霉素(250μg/ml)、两性霉素b(2μg/ml)，放置备用。在d-pbs溶液中加入相同含量的抗生素放置备用。
2、称取500ml规格的l-15干粉以及10.1gnacl、0.27gkcl、0.3gcacl2、0.5gmgso4、0.9gmgcl2充分溶解到500ml超纯水后加入5ml青链霉素混合液(100x)、1ml硫酸庆大霉素(100mg/ml)、1ml两性霉素b(500mg/ml)，在充分混合均匀后的培养基用0.22μm滤膜过滤除菌，再添加15％的胎牛血清配制成完全培养基、放置备用。
实验材料：皱纹盘鲍、0.22μm过滤器，注射器、t25培养瓶、6孔细胞培养板、弯头镊子、手术剪、解剖刀、称量勺、100μm细胞筛、40μm细胞筛、巴氏吸管。
实验材料的灭菌：解剖所用镊子剪刀等工具及实验耗材等在高压灭菌锅中121℃，30min灭菌后放入55°烘箱烘干备用；
实验鲍鱼的选取暂养：选取活力较好体重适中的健康鲍鱼，放在含有紫外消毒灯的循环海水系统中暂养。
所述获取皱纹盘鲍的肝胰腺细胞，包括：
选取健康的鲍鱼体，采用75％酒精对所述鲍鱼体进行消毒处理；
用灭菌的解剖工具将壳剥离后，再次用75％的酒精对鲍鱼软体部分消毒处理，用镊子和剪刀去除包裹在肝胰腺外的性腺和结缔组织后，剪下肝胰腺；
采用75％酒精对所述肝胰腺清洗消毒后，放入无菌海水中并置于转摇床消毒清洗1h。
本申请在无菌工作台中进行，用75％的酒精对鲍鱼体表进行全面的消毒，用灭菌的解剖工具将壳剥离后，再次用75％的酒精消毒鲍鱼软体部分，用镊子和剪刀小心去除包裹在肝胰腺外的性腺和结缔组织后，将肝胰腺剪下在75％的酒精中快速清洗消毒后，放入添加抗生素的无菌海水中，置于60转摇床消毒清洗1h。
一些实施例中，所述采用胶原酶消化法对所述肝胰腺进行处理，得到肝胰腺细胞，包括：
将肝胰腺从海水中取出后，用添加抗生素预冷的d-pbs缓冲液再清洗消毒两次；
将所述肝胰腺剪成0.5-2mm2的块，放入含有百分比为0.25％的iv型胶原酶的培养皿中消化10min，中间吹打两次；
消化完成后，加入完全培养基，将细胞研磨过70μm细胞筛，得到过筛液。
优选的，所述对所述过筛液进行多次沉淀重悬处理，得到细胞悬液，包括：
收集过筛液，采用转速为1000rpm，持续时间为3min，弃上清液后，用完全培养基对沉淀重悬并重复离心两次，取沉淀；
将所述沉淀重悬，其采用600rpm离心2min，弃上清液后取沉淀；
用完全培养基将得到的沉淀重悬，采用100rpm离心2min，收集上清液，过70μm细胞筛，得到细胞滤液；
将所述细胞滤液静置5min，采用100rpm离心30s，收集上清液并加入完全培养基进行稀释混匀，得到细胞悬液。
优选的，所述六孔细胞培养板的每个孔为1.5ml，所述培养箱的温度为22℃。
具体的，本申请肝胰腺细胞的培养方法的实现步骤如下：
(1)，将肝胰腺从海水中取出后，用添加抗生素预冷的d-pbs缓冲液再清洗消毒两次。
(2)，将肝胰腺剪成0.5-2mm2大小的小块，放入含有0.25％的iv型胶原酶的培养皿中消化10min，中间轻轻吹打两次。
(3)，消化完成后，加入含有血清的完全培养基终止消化，将细胞研磨过70μm细胞筛。
(4)，收集过筛液，1000rpm离心3min，吸弃上清收集沉淀，用培养基将沉淀重悬，重复离心两次，充分清洗去除黏液杂质等。
(5)，将最后一次的沉淀重悬，600rpm离心2min，吸弃上清收集沉淀。
(6)，用完全培养基将沉淀重悬，100rpm离心2min，收集上清液，过70μm细胞筛。
(7)，将细胞滤液静置5分钟，会出现少量凝集团块，100rpm离心30s，收集上清液，加入适量完全培养基稀释到适宜浓度，轻轻吹打混匀。
(8)，将稀释后的细胞悬液接到六孔细胞培养板中，每孔1.5ml，封口膜封口后置于22℃生化培养箱中进行培养，观察细胞状态，每两天换液。
一些实施例中，还包括：
对细胞及细胞活性进行鉴定；
所述对细胞及细胞活性进行鉴定，包括：
采用dapi染色法对细胞进行鉴定；
采用台盼蓝染色法对细胞活性进行鉴定。
其中，dapi染色：dapi(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐)是一种能够与dna中大部分a，t碱基相互结合的荧光染料，常用于荧光显微镜检测。因为dapi可以透过完整的细胞膜，可用于活细胞和固定细胞的染色。用dapi转染试剂对细胞核进行转染，转染的具体操作如下：
在培养基中加入200uldapi试剂，充分混匀后，室温染色10min。
吸弃dapi染色液，用pbs洗涤3次，每次5分钟。
加入适量培养基，置于荧光显微镜下观察，激发波长360-400nm。
其中，被染色的即为细胞，不被染色的即为其他组织。
台盼蓝染色：正常的活细胞胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色，因此，借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。启动培养后12h使用台盼蓝对培养细胞进行染色，检测细胞活性，具体操作如下：
用pbs将台盼蓝稀释至0.4％。
以培养基与0.4％台盼蓝溶液9∶1的比例加入150ul台盼蓝(终浓度0.04％)。
置于显微镜下观察：死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。
采用上述方法的实验结果如下：
不同离心转速下的细胞情况如图1所示：图1a为1000rpm上清无明显细胞形态；图1b为600rpm上清大部分为不规则的细胞碎片和杂质等；图1c为400rpm上清出现少量细胞；图1d为600rpm沉淀 400rpm上清出现少量细胞；图1e为600rpm沉淀 200rpm上清得到部分细胞，但数量较100rpm少；图1f为600rpm沉淀 100rpm上清得到数量足够且形态活力较好的肝胰腺细胞。
本实验的细胞处理培养方法能够明显减少培养过程中细胞凝集团块的出现，图2a为优化前的细胞凝集团块情况，具体为：优化前易出现细胞凝集团块；图2b为优化后的细胞凝集团块情况，具体为：优化后细胞凝集团块明显减少。
图3a为启动培养2h后，细胞分散均匀；图3b为24h后，细胞成圆形，光滑透明，折光性强，富立体感，大部分细胞贴壁。图3c为120h后，少量细胞死亡，其他细胞继续生长、活性较好。
细胞贴壁情况：每孔接种3ml细胞悬液时，大部分细胞呈悬浮状态，个别细胞轻微贴壁，易脱落；每孔接种2ml细胞悬液时，部分细胞轻微贴壁，轻微晃动或换液时易脱落；每孔接种1.5ml细胞悬液时，大部分细胞贴壁不易脱落，换液不会造成细胞脱落；将过滤后的细胞悬液稀释到适宜浓度有利于细胞贴壁，使用多聚赖氨酸或明胶等包被细胞培养瓶底部也能够提高细胞的贴壁效率。
如图4所示，dapi染色后使用echorevolve荧光显微镜在400nm激发波长处可以观察到蓝色荧光。，证明培养内容为细胞，而其他非细胞物质。
如图5所示，台盼蓝染色后，绝大多数细胞拒染，细胞活力较好。
综上所述，本发明提供一种皱纹盘鲍肝胰腺细胞的分离和原代培养方法，包括获取皱纹盘鲍的肝胰腺；采用胶原酶消化法对所述肝胰腺进行处理并进行过筛，得到过筛液；对所述过筛液进行多次沉淀重悬处理，得到细胞悬液；将所述细胞悬液接种到六孔细胞培养板中，采用膜封口后置于培养箱中，每2d更换一次鲍细胞的完全培养基。本发明采用胶原酶消化法对皱纹盘鲍肝胰腺细胞进行处理，可以在较短时间内获得更为纯净且较为足量的皱纹盘鲍原代肝胰腺细胞，为研究皱纹盘鲍营养代谢和免疫等进行体外实验提供更多材料选择。且通过优化实验条件和方法进一步提高了肝胰腺细胞的贴壁能力，解决了在培养过程中易出现细胞团块凝集的问题，获得纯净且数量较大的肝胰腺细胞。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
1.一种皱纹盘鲍肝胰腺细胞的分离和原代培养方法，其特征在于，包括：
获取皱纹盘鲍的肝胰腺；
采用胶原酶消化法对所述肝胰腺进行处理并进行过筛，得到过筛液；
对所述过筛液进行多次沉淀重悬处理，得到细胞悬液；
将所述细胞悬液接种到六孔细胞培养板中，采用膜封口后置于培养箱中，每2d更换一次鲍细胞的完全培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述获取皱纹盘鲍的肝胰腺细胞，包括：
选取健康的鲍鱼体，采用75％酒精对所述鲍鱼体进行消毒处理；
用灭菌的解剖工具将壳剥离后，再次用75％的酒精对鲍鱼软体部分消毒处理，用镊子和剪刀去除包裹在肝胰腺外的性腺和结缔组织后，剪下肝胰腺；
采用75％酒精对所述肝胰腺清洗消毒后，放入无菌海水中并置于转摇床消毒清洗1h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述采用胶原酶消化法对所述肝胰腺进行处理，得到肝胰腺细胞，包括：
将肝胰腺从海水中取出后，用添加抗生素预冷的d-pbs缓冲液再清洗消毒两次；
将所述肝胰腺剪成0.5-2mm2的块，放入含有百分比为0.25％的iv型胶原酶的培养皿中消化10min，中间吹打两次；
消化完成后，加入完全培养基，将细胞研磨过70μm细胞筛，得到过筛液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对所述过筛液进行多次沉淀重悬处理，得到细胞悬液，包括：
收集过筛液，采用转速为1000rpm，持续时间为3min，弃上清液后，用完全培养基对沉淀重悬并重复离心两次，取沉淀；
将所述沉淀重悬，其采用600rpm离心2min，弃上清液后取沉淀；
用完全培养基将得到的沉淀重悬，采用100rpm离心2min，收集上清液，过70μm细胞筛，得到细胞滤液；
将所述细胞滤液静置5min，采用100rpm离心30s，收集上清液并加入完全培养基进行稀释混匀，得到细胞悬液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述六孔细胞培养板的每个孔为1.5ml，所述培养箱的温度为22℃。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，还包括
制备皱纹盘鲍肝胰腺细胞的完全培养基，所述培养基组分包括：l-15基础培养基、胎牛血清、青链霉素混合液100×、硫酸庆大霉素、两性霉素b、nacl、kcl、cacl2、硫酸镁、氯化镁、iv型胶原酶、dapi溶液、75％酒精、d-pbs缓冲液、台盼蓝。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括：
对细胞及细胞活性进行鉴定；
所述对细胞及细胞活性进行鉴定，包括：
采用dapi染色法对细胞进行鉴定；
采用台盼蓝染色法对细胞活性进行鉴定。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述采用dapi染色法对细胞进行鉴定，包括：
在完全培养基中入200uldapi试剂，充分混匀后，室温染色10min；
吸弃dapi染色液，用pbs洗涤3次，每次5分钟；
加入适量培养基，置于荧光显微镜下观察，激发波长为360-400nm；
其中，被染色的即为细胞。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述采用台盼蓝染色法对细胞活性进行鉴定，包括：
用pbs将台盼蓝稀释至质量分数为0.4％；
将完全培养基与0.4％台盼蓝溶液以9∶1的比例加入150ul台盼蓝；
置于显微镜下观察；其中，死细胞被染成蓝色，而活细胞拒染呈无色透明。
技术总结