本发明属于人类辅助生殖领域，具体涉及一种人精子清洗液以及制备所述人精子清洗液的方法。
背景技术：
精液优化处理作为辅助生殖技术(art)一个非常重要的环节，不仅可以去除精浆、不活动精子、畸形精子、细胞碎片及其它有害的物质，而且还可以制备出含高比例的形态学正常的活动精子。理想的预处理后精子是在加入少量的培养液后去除精浆、白细胞和细菌并富集正常形态和活力的精子。目前，临床上常用的精子优选方法主要包括上游法、密度梯度离心法等。
精子含有大量的多不饱和脂肪酸，而精子细胞由于细胞质明显缺乏而缺乏防御系统，因此它不能有效地修复膜损伤，使精子特别容易受到氧化应激的影响，任何体外的操作都有可能导致活性氧水平升高，从而对精子存活造成影响。
目前使用的精子准备液或洗精液为基础盐缓冲溶液，在精子体外操作过程中难于避免操作过程中带来的损伤和活性氧的水平的升高。在常规的上游法中，功能精子通过离心法与缺陷精子或白细胞进行细胞间的紧密接触，由于精子的浆膜中含有大量的多不饱和脂肪酸，这些活性氧会导致脂质过氧化，从而导致精子功能(包括运动性)的急剧下降，引起活性氧对精子质膜的大量氧化损伤，从而对精子功能造成损害(aitkenrj,etal.significanceofreactiveoxygenspeciesandantioxidantsindefiningtheefficacyofspermpreparationtechniques.jandrol)(mortimerd.spermpreparationtechniquesandiatrogenicfailuresofin-vitrofertilization.humreprod)。
生物素(维生素b7或维生素h)是人体正常生长发育所必需的一种微量营养素，参于在脂肪酸的生物合成、糖异生、支链氨基酸代谢和嘌呤核苷酸的合成等羧化反应。研究表明，生物素在繁殖和发育中发挥作用，妊娠期生物素的缺乏可导致小鼠和仓鼠的致畸(mockdm.marginalbiotindeficiencyiscommoninnormalhumanpregnancyandishighlyteratogenicinmice.jnutrwatanabet.dietarybiotindeficiencyaffectsreproductivefunctionandprenataldevelopmentinhamsters.jnutr)。
硫辛酸(aapaa-aapaacacadaala)是一种有效的生物抗氧化剂之一，由于具有水和脂肪的溶解度，被认为是一种通用的抗氧化剂。这种抗氧化剂可以很容易地穿透不同的组织、细胞，甚至像线粒体这种活性氧主要产生的细胞器。硫辛酸是一种由辛酸衍生而来的有机硫化合物(二硫醇)，对许多酶起着必要的辅助作用。
发明人尝试将上述两种成分用于洗精液，希望能减少精子体外处理过程中的损伤作用，促进体外精子活力，减少活性氧水平，以提高辅助生殖中精子制备效率和质量。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种人类精子清洗液。生物素，如维生素b7或维生素h是人体正常生长发育所必需的一种微量营养素，参于在脂肪酸的生物合成、糖异生、支链氨基酸代谢和嘌呤核苷酸的合成等羧化反应；硫辛酸(ala)是一种有效的生物抗氧化剂之一，由于具有水和脂肪的溶解度，是一种通用的抗氧化剂，这种抗氧化剂可以很容易地穿透不同的组织、细胞，甚至像线粒体这种活性氧主要产生的细胞器，硫辛酸是一种由辛酸衍生而来的有机硫化合物(二硫醇)，对许多酶起着必要的辅助作用。本发明以含缓冲成分无机盐溶液，添加了生物素和硫辛酸，获得了一种性能优越的人精子清洗液。
本发明的具体技术方案为：
一种人精子清洗液，其配方为含缓冲成分的无机盐溶液，生物素8-20nm/l，硫辛酸0.01-0.05mm/l；其中，所述含缓冲成分的无机盐溶液配方为氯化钠100～120mm/l、氯化钾4.10～5.28mm/l、磷酸二氢钾0.25～0.45mm/l二水氯化钙1.70～2.38mm/l、七水硫酸镁0.10～0.30mm/l、碳酸氢钠1～7mm/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸12-15.5mm/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠5-9mm/l、丙酮酸钠0.10～0.56mm/l、乳酸钠5～16.4mm/l、葡萄糖0.5～5.06mm/l、丙胺酰谷氨酰胺0～1.0mm/l、乙二胺四乙酸二钠0～0.02mm/l、牛磺酸0.01～0.19mm/l、硫酸庆大霉素0.01～0.02g/l、人血清蛋白5～10g/l。
本发明的另一个目的是提供所述的人精子清洗液在人类精子体外制备过程中的应用。
本发明的再一个目的是提供一种制备人精子清洗液的方法，包括以下步骤：
a、按配方称量所有固体成分并分开放置，其中生物素及硫辛酸按100倍称量；
b、将除生物素、硫辛酸、硫酸庆大霉素和人血清白蛋白外的所有成分加入并溶解于超纯水中，配成缓冲盐溶液；
c、将生物素及硫辛酸溶解于适量水中配制成100×浓储液；
d、向步骤b获得的缓冲盐溶液中加入硫酸庆大霉素、百分之一生物素及硫辛酸，溶解后得基础液；
e、测量并调节上述基础液ph值在7.4±0.1，渗透压在280～290mosm/kg；
f、将基础液经0.22μm过滤器过滤，按比例加入人血清白蛋白并分装、封口，2-8℃保存。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步对本发明进行说明，不能理解为是对本发明的限制，实施例中使用的材料、试剂，仪器设备如无特殊说明，均可从商业途径得到。
【实施例1】精子清洗液成分含量及制备方法：
a、精子清洗液成分含量：
b、配制方法：
a、按配方称量所有固体成分并分开放置，其中生物素及硫辛酸按100倍；
b、将除生物素、硫辛酸、硫酸庆大霉素和人血清白蛋白外的所有成分加入并溶解于超纯水中，配成缓冲盐溶液；
c、将生物素及硫辛酸溶解于适量水中配制成100×浓储液；
d、向步骤b获得的缓冲盐溶液中加入硫酸庆大霉素、百分之一生物素及硫辛酸，溶解后得基础液；
e、测量并调节上述基础液ph值在7.4±0.1，渗透压在280～290mosm/kg；
f、将基础液经0.22μm过滤器过滤，按比例加入人血清白蛋白并分装、封口，2-8℃保存。
【实施例2】体外受精液的质控检测
1、ph值检测
取适量待测样品用ph计测量三次，取所得三个数据的平均值为结果，在7.4±0.1视为合格。
2、渗透压检测
渗透压仪校正后，取500μa待测样品到测试管中开始测试，当数值稳定后读出数据，按以上方法测出3个数据，取平均值为结果，在280～290mosm/kg视为合格。
3、细菌内毒素检测
根据中华人民共和国药典2015版要求，用鲎试剂凝胶法进行检测，结果≤0.1eu/ma视为合格。
4、细胞毒性
按gb/t16886.5的规定进行检测，细胞毒性分数不应超过1分。
5、致敏检测
按gb/t16886.10的规定进行检测，应无致敏反应。
6、无菌试验
根据中华人民共和国药典2015版要要求，运用薄膜过滤法，待测样品经滤膜过滤后直接接种培养基培养14天，每天观察结果，应无菌。
7、皮内刺激
按gb/t16886.10的规定进行检测，应无皮内刺激反应。
8、人精子存活试验
按照yy/t1535-2017《人类体外辅助生殖技术用医疗器械生物学评价人精子存活试验》进行人精子存活试验，在三份有效试验中，至少就在有两份测试组样品的精子活力系数(smi)≥0.7，且相对精子活力系数≥0.9。
9、检测结果
【实施例3】精子活力试验
(一)、不同配对精子活力的影响
实施例2中各配方配制的精子清洗液，按以下步骤进行精子活力试验：
1.取正常液化后精液于2ml于无生物素和硫辛酸的精子清洗液中，300g离心10man；
2.试管底部精子沉淀重悬于实施例2中各配比精子清洗液，300g离心10man；
3.取出试管，弃上清，分别加入2ml各配比精子清洗液，使精子重悬；
4.各组精子置于37℃中孵育1小时，4小时及24小时；
(二)、生物素及硫辛酸对精子活力的影响
按实施例2中配方3配制精子清洗液，并按以下步骤进行精子活力试验：
1.取正常液化后精液于2ml无生物素和硫辛酸的精子清洗液中，300g离心10man；
2.试管底部精子沉淀重悬于上述洗精液并分为两等份，一份为对照组，另一份为试验组。两份精子悬液300g离心10man；
3.取出试管，弃上清，对照组加入2ml无生物素和硫辛酸的精子清洗液，试验组加入含生物素和硫辛酸的精子清洗液，使精子重悬；
4.两组精子置于37℃中孵育1小时，4小时及24小时；
5.在不同时间点取10μa上游精子于计数板中进行活力观察。
6.试验结果：
上述结果表明，生物素及硫辛酸可明显提高精子总活力和前向运动能力。
1.一种人精子清洗液，包括含缓冲成分的无机盐溶液，其特征在于，在所述无机盐溶液中添加了生物素和硫辛酸。
2.如权利要求1所述的人精子清洗液，其特征在于，所述生物素的含量为8-20nm/l，硫辛酸的含量为0.01-0.05mm/l。
3.如权利要求2所述的人精子清洗液，其特征在于，所述含缓冲成分的无机盐溶液配方为氯化钠100～120mm/l、氯化钾4.10～5.28mm/l、磷酸二氢钾0.25～0.45mm/l二水氯化钙1.70～2.38mm/l、七水硫酸镁0.10～0.30mm/l、碳酸氢钠1～7mm/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸12-15.5mm/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠5-9mm/l、丙酮酸钠0.10～0.56mm/l、乳酸钠5～16.4mm/l、葡萄糖0.5～5.06mm/l、丙胺酰谷氨酰胺0～1.0mm/l、乙二胺四乙酸二钠0～0.02mm/l、牛磺酸0.01～0.19mm/l、硫酸庆大霉素0.01～0.02g/l、人血清蛋白5～10g/l。
4.如权利要求3所述的人精子清洗液，其特征在于，所述人精子清洗液的配方为：氯化钠110mm/l、氯化钾4.69mm/l、磷酸二氢钾0.35mm/l、二水氯化钙2.04mm/l、七水硫酸镁0.2mm/l、碳酸氢钠4mm/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸12mm/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠9mm/l、丙酮酸钠0.33mm/l、乳酸钠10.7mm/l、葡萄糖2.78mm/l、丙胺酰谷氨酰胺0.5mm/l、乙二胺四乙酸二钠0.01mm/l、牛磺酸0.10mm/l、硫酸庆大霉素0.01g/l、人血清蛋白5g/l、生物素10nm/l、硫辛酸0.04mm/l。
5.如权利要求3所述的人精子清洗液，其特征在于，所述人精子清洗液的配方为：氯化钠105mm/l、氯化钾4.4mm/l、磷酸二氢钾0.3mm/l、二水氯化钙1.87mm/l、七水硫酸镁0.15mm/l、碳酸氢钠2.5mm/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸15.5mm/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠6.5mm/l、丙酮酸钠0.22mm/l、乳酸钠7.85mm/l、葡萄糖1.64mm/l、丙胺酰谷氨酰胺0.25mm/l、乙二胺四乙酸二钠0.01mm/l、牛磺酸0.06mm/l、硫酸庆大霉素0.01g/l、人血清蛋白5g/l、生物素9nm/l、硫辛酸0.03mm/l。
6.如权利要求3所述的人精子清洗液，其特征在于，所述人精子清洗液的配方为：氯化钠115mm/l、氯化钾4.99mm/l、磷酸二氢钾0.4mm/l、二水氯化钙2.21mm/l、七水硫酸镁0.25mm/l、碳酸氢钠5.5mm/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸13.5mm/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠7mm/l、丙酮酸钠0.45mm/l、乳酸钠13.55mm/l、葡萄糖3.92mm/l、丙胺酰谷氨酰胺0.75mm/l、乙二胺四乙酸二钠0.01mm/l、牛磺酸0.15mm/l、硫酸庆大霉素0.01g/l、人血清蛋白8.75g/l、生物素15nm/l、硫辛酸0.04mm/l。
7.如权利要求1所述的人精子清洗液在人类精子体外制备过程中的应用。
8.一种制备如权利要求1所述人精子清洗液的方法，包括以下步骤：
a、按配方称量所有固体成分并分开放置，其中生物素及硫辛酸按100倍称量；
b、将除生物素、硫辛酸、硫酸庆大霉素和人血清白蛋白外的所有成分加入并溶解于超纯水中，配成缓冲盐溶液；
c、将生物素及硫辛酸溶解于适量水中配制成100×浓储液；
d、向步骤b获得的缓冲盐溶液中加入硫酸庆大霉素、百分之一生物素及硫辛酸，溶解后得基础液；
e、测量并调节上述基础液ph值在7.4±0.1，渗透压在280～290mosm/kg；
f、将基础液经0.22μm过滤器过滤，按比例加入人血清白蛋白并分装、封口，2-8℃保存。
9.如权利要求8所述的方法获得的人精子清洗液。
10.如权利要求8所述的方法获得的人精子清洗液在人类精子体外制备过程中的应用。
技术总结