本发明涉及细胞分离技术领域，特别涉及混合斑检材精子细胞分离技术领域，具体是指一种基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法。
背景技术：
目前，法医dna检验在刑侦领域的应用越来越广泛，除在重大刑事案件中需要进行dna样本的采集、提取和检验外，小型案件如盗窃等的现场勘查中也普遍进行dna样本的采集、提取和检验。
精阴混合斑检材是性犯罪案件常见的生物物证，将混合斑中男性精子细胞和女性阴道上皮细胞进行有效分离，准确认定其中男性精子细胞的个体来源是案件侦破和诉讼的关键。由于精子细胞膜含有大量硫醇蛋白，需在化学试剂二硫苏糖醇(dtt)的帮助下才能打开其中二硫键，从而破膜释放dna。法医物证学者利用精子细胞和上皮细胞的这一区别，建立了差异裂解法，即先以蛋白酶k和十二烷基硫酸钠(sds)溶解女性上皮细胞外膜，使女性上皮细胞dna溶于悬液，再通过离心弃上清，达到分离精子细胞沉淀物和女性细胞dna的目的，之后精子细胞裂解时加入dtt获得精子dna。在实际检案中，用该方法处理条件较好的混合斑检材时，能够有效去除女性成分，获得男性的准确分型。但是，差异裂解法多次洗涤弃液，易导致精子细胞损失，容易造成微量或陈旧混合斑检材无法检出；且差异裂解法操作复杂，耗时较长，需要精细化操作，无法实现高通量自动化高效提取。
另外，近年来发展的依赖分离膜(或分离柱)的技术，主要依据精子与阴道上皮细胞的大小差异(精子直径约6μm，阴道上皮细胞直径40-60μm)进行孔径筛选，该方法对于精子细胞含量较多、未降解的新鲜混合斑检材有一定的分离效果。但这种仅仅通过孔径的差异进行混合斑分离的技术也存在一些局限性，特别是对于陈旧、干燥、降解严重的疑难混合斑检材，由于精子细胞和阴道上皮细胞都无法保持形态完整性和尺寸的明显差异，往往出现精子细胞回收率不高，使得分型失败，或无法实现混合斑中精子和女性上皮细胞进行有效分离，str谱图混合严重，无法作为案件侦破和诉讼的有效证据。
因此，需要提供一种实现混合斑检材精子细胞分离的方法，其能够有效分离混合斑中男性精子细胞和女性上皮细胞，获得满足法医dna检测所需的男性精子细胞。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法，其能够有效分离混合斑中男性精子细胞和女性上皮细胞，获得满足法医dna检测所需的男性精子细胞，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法，其设计巧妙，操作简便，分离快速，适于大规模推广应用。
为达到以上目的，本发明提供一种基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法，其特点是，包括以下步骤：
(1)采用聚肽对膜进行修饰获得聚肽修饰膜；
(2)将待分离的混合斑检材的分散液或经上皮细胞消化液消化的消化产物和所述聚肽修饰膜混合吸附；
(3)弃去残余溶液，并洗涤所述聚肽修饰膜，获得表面富集男性精子细胞的所述聚肽修饰膜。
较佳地，在所述步骤(1)中，所述聚肽的肽链结构单元包含的氨基酸残基为赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸中的一种或几种。
较佳地，在所述步骤(1)中，所述修饰为物理修饰或共价修饰。
较佳地，在所述步骤(1)中，所述膜是聚乙烯膜、聚丙烯膜、聚氯乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚酰胺类膜、聚碳酸酯膜、聚甲醛膜、聚酯类膜、聚苯醚膜、聚甲基丙烯酸甲酯膜、聚氨酯膜、聚塑料类膜、聚四氟乙烯膜、乙烯-四氟乙烯共聚物膜、聚苯硫醚膜、聚砜膜、聚酰亚胺膜、尼龙膜、羧甲基纤维素膜、硝酸纤维素膜或丙酸纤维素膜。
较佳地，在所述步骤(1)中，所述膜负载在耗材上或者所述膜是所述耗材的一部分。
更佳地，在所述步骤(1)中，所述耗材是管、孔、沟槽或板。
较佳地，在所述步骤(3)中，所述弃去残余溶液通过施加外力实现。
更佳地，在所述步骤(3)中，所述外力是水平或垂直方向上施加的力。
较佳地，在所述步骤(3)中，所述洗涤所述聚肽修饰膜采用缓冲液实现。
更佳地，在所述步骤(3)中，所述缓冲液包含氯化锂、溴化锂、氯化钠、溴化钠、氯化钾、溴化钾、氯化铯、溴化铯、碳酸钠、碳酸钾、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠、氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钾、乙醇、异丙醇、乙二醇、n，n-二甲基甲酰胺、甘露醇、葡萄糖、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、月桂酰基肌氨酸钠、磷酸酰胆碱和甜菜碱中的一种或几种。
本发明的有益效果主要在于：
1、本发明的基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法包括：采用聚肽对膜进行修饰获得聚肽修饰膜；将待分离的混合斑检材的分散液或经上皮细胞消化液消化的消化产物和聚肽修饰膜混合吸附；弃去残余溶液，并洗涤聚肽修饰膜，获得表面富集男性精子细胞的聚肽修饰膜，因此，其能够有效分离混合斑中男性精子细胞和女性上皮细胞，获得满足法医dna检测所需的男性精子细胞，适于大规模推广应用。
2、本发明的基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法包括：采用聚肽对膜进行修饰获得聚肽修饰膜；将待分离的混合斑检材的分散液或经上皮细胞消化液消化的消化产物和聚肽修饰膜混合吸附；弃去残余溶液，并洗涤聚肽修饰膜，获得表面富集男性精子细胞的聚肽修饰膜，因此，其设计巧妙，操作简便，分离快速，适于大规模推广应用。
本发明的这些和其它目的、特点和优势，通过下述的详细说明和附图得以充分体现，并可通过本发明的发明内容特地指出的手段、装置和它们的组合得以实现。
附图说明
图1是本发明使用的待分离的混合斑检材的经上皮细胞消化液消化的消化产物经常规dna提取方法提取的男性dna的str谱图，其中有明显的女性混合干扰。
图2是采用本发明的基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法的一具体实施例获得的男性精子细胞经常规方法提取的男性dna的str谱图。
图3是采用本发明的基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法的另一具体实施例获得的男性精子细胞经常规方法提取的男性dna的str谱图。
图4是采用本发明的基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法的又一具体实施例获得的男性精子细胞经常规方法提取的男性dna的str谱图。
具体实施方式
为了能够快速有效分离获得可满足法医dna检测所需的男性精子细胞，本发明提供一种基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法，包括以下步骤：
(1)采用聚肽对膜进行修饰获得聚肽修饰膜；
(2)将待分离的混合斑检材的分散液或经上皮细胞消化液消化的消化产物和所述聚肽修饰膜混合吸附；
(3)弃去残余溶液，并洗涤所述聚肽修饰膜，获得表面富集男性精子细胞的所述聚肽修饰膜。
在所述步骤(1)中，所述聚肽的肽链结构单元包含的氨基酸残基可以根据需要确定，较佳地，在所述步骤(1)中，所述聚肽的肽链结构单元包含的氨基酸残基为赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸中的一种或几种。
在所述步骤(1)中，所述修饰可以是任何合适形式的修饰，可以是物理修饰，也可以是化学修饰，较佳地，在所述步骤(1)中，所述修饰为物理修饰或共价修饰。
在所述步骤(1)中，所述膜可以是任何合适材质的膜，较佳地，在所述步骤(1)中，所述膜是聚乙烯膜、聚丙烯膜、聚氯乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚酰胺类膜、聚碳酸酯膜、聚甲醛膜、聚酯类膜、聚苯醚膜、聚甲基丙烯酸甲酯膜、聚氨酯膜、聚塑料类膜、聚四氟乙烯膜、乙烯-四氟乙烯共聚物膜、聚苯硫醚膜、聚砜膜、聚酰亚胺膜、尼龙膜、羧甲基纤维素膜、硝酸纤维素膜或丙酸纤维素膜。
在所述步骤(1)中，所述膜可以单独存在，也可以设置在其它东西上，较佳地，在所述步骤(1)中，所述膜负载在耗材上或者所述膜是所述耗材的一部分。
在所述步骤(1)中，所述耗材可以是任何合适的耗材，更佳地，在所述步骤(1)中，所述耗材是管、孔、沟槽或板。
在所述步骤(3)中，所述弃去残余溶液可以采用任何合适的方式进行，较佳地，在所述步骤(3)中，所述弃去残余溶液通过施加外力实现。
在所述步骤(3)中，所述外力可以是任何合适的外力，更佳地，在所述步骤(3)中，所述外力是水平或垂直方向上施加的力，例如离心力、重力、压力和毛细力等。
在所述步骤(3)中，所述洗涤所述聚肽修饰膜可以采用任何合适的溶液进行，较佳地，在所述步骤(3)中，所述洗涤所述聚肽修饰膜采用缓冲液实现。
在所述步骤(3)中，所述缓冲液可以具有任何合适的构成，其目的是将未吸附到所述聚肽修饰膜的其它细胞和/或女性成分dna除去，更佳地，在所述步骤(3)中，所述缓冲液包含氯化锂、溴化锂、氯化钠、溴化钠、氯化钾、溴化钾、氯化铯、溴化铯、碳酸钠、碳酸钾、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠、氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钾、乙醇、异丙醇、乙二醇、n，n-二甲基甲酰胺、甘露醇、葡萄糖、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、月桂酰基肌氨酸钠、磷酸酰胆碱和甜菜碱中的一种或几种。
通过上述方法实现混合斑中男性精子细胞和女性上皮细胞进行有效分离的目的，获得可满足法医dna检测所需的男性精子细胞。所获得的男性精子细胞可用常规商用dna提取试剂进行裂解/消化和纯化，并经pcr扩增，在电泳仪中检测男性dna。
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。
实施例1以聚(ε-赖氨酸)物理修饰的硝酸纤维素膜进行混合斑男性dna提取
在硝酸纤维素膜上喷涂或浸泡聚(ε-赖氨酸)溶液，使硝酸纤维素膜表面吸附一层聚(ε-赖氨酸)，50℃～100℃真空烘箱中干燥4h，按套管的内管的尺寸进行裁剪并装配于内管待用。
将待分离的混合斑检材用200μl～10ml上皮细胞消化液(含5％重量～20％重量三羟甲基氨基甲烷、0.5％重量～10％重量氯化钠、1％重量～10％重量乙二胺四乙酸二钠和10μl～100μl浓度为10mg/ml的蛋白酶k)进行消化，把消化后含精子细胞和其他杂质的产物，转移到上述分离套管内，静置20分钟，必要时可用震摇、翻转等方法促进吸附，然后2000rpm离心3分钟，滤除溶液，再用1ml～20ml缓冲溶液(含1％重量～10％重量氯化钠、5％重量～20％重量三羟甲基氨基甲烷、0.1％重量～0.5％重量十二烷基硫酸钠、0.5％重量～5％重量甜菜碱和2％重量～30％重量乙二醇)反复洗涤、离心三次。
然后将表面富集精子细胞的膜或含膜套管置于200μl～10ml精子细胞裂解液或消化液(主要组分为10％重量～30％重量异硫氰酸胍、0.1％重量～0.5％重量十二烷基硫酸钠、0.1mol/l～1mol/l的dtt)中，加热反应10分钟～60分钟，然后经磁珠或硅膜结合、产物洗涤、dna脱附等过程，获得男性dna模板。所提取的男性dna模板经pcr扩增，电泳仪检测，获得男性dna的str谱图，请参见图2所示。
上述的待分离的混合斑检材的经上皮细胞消化液消化的消化产物不进行聚肽修饰膜分离，而是直接采用上述精子细胞裂解液或消化液消化，加热反应10分钟～60分钟，然后经磁珠或硅膜结合、产物洗涤、dna脱附等过程，获得男性dna模板，经pcr扩增，电泳仪检测，获得男性dna的str谱图，请参见图1所示。
由图1和图2可知，采用本发明的基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法可以实现混合斑中精子和女性上皮细胞进行有效分离，获得的男性精子细胞提取的dna模板的str谱图没有明显的女性混合干扰，可以作为案件侦破和诉讼的有效证据。
实施例2以聚天冬氨酸共价修饰的聚丙烯膜进行混合斑男性dna提取
在聚丙烯膜上预喷涂或浸泡5％重量～40％重量的多巴胺和0.5％重量～20％重量的氨基硅烷偶联剂溶液，并通过碱性(ph8～12)和加热(50℃～100℃)处理，使聚丙烯膜表面修饰一层由聚多巴胺和氨基硅烷偶联剂修饰的过渡层，再用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)/n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)方法共价偶联聚天冬氨酸，经洗涤和50℃～100℃真空烘箱中干燥4h后，按24孔板(含内板架和外板架)的内板架管的尺寸进行裁剪并装配待用，膜装配的个数可以根据混合斑检材个数(1个～24个)进行选择。
将实施例1的待分离的混合斑检材用200μl～10ml上皮细胞消化液(含5％重量～20％重量三羟甲基氨基甲烷、0.5％重量～10％重量氯化钠、1％重量～10％重量乙二胺四乙酸二钠和10μl～100μl浓度为10mg/ml的蛋白酶k)进行消化，把消化后含精子细胞和其他杂质的产物，转移到上述24孔板的内板架管内，静置20分钟后，必要时可用震摇、翻转等方法促进吸附，然后500rpm离心3分钟，滤除溶液，再用1ml～20ml缓冲溶液(含1％重量～10％重量溴化铯、5％重量～20％重量三羟甲基氨基甲烷、0.1％重量～0.5％重量十二烷基硫酸钠、0.5％重量～5％重量磺酸甜菜碱和2％重量～30％重量甘露醇)反复洗涤、离心三次。
然后将表面富集精子细胞的膜或含膜24孔板的内板架置于200μl～10ml精子细胞裂解液或消化液(主要组分为10％重量～30％重量异硫氰酸胍、0.1％重量～0.5％重量十二烷基硫酸钠、0.1mol/l～1mol/l的dtt)中，加热反应10分钟～60分钟，然后经磁珠或硅膜结合、产物洗涤、dna脱附等过程，获得男性dna模板。
所提取的男性dna模板经pcr扩增，电泳仪检测，获得男性dna的str谱图，请参见图3所示。
由图1和图3可知，采用本发明的基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法可以实现混合斑中精子和女性上皮细胞进行有效分离，获得的男性精子细胞提取的dna模板的str谱图没有明显的女性混合干扰，可以作为案件侦破和诉讼的有效证据。
实施例3以聚谷氨酸修饰的碳酸酯微孔沟槽用于混合斑男性dna提取
在碳酸酯微孔沟槽上喷涂或浸泡5％重量～40％重量的多巴胺和0.5％重量～20％重量的氨基硅烷偶联剂溶液，并通过碱性(ph8～12)和加热(50℃～100℃)处理，使碳酸酯微孔沟槽表面修饰一层由聚多巴胺和氨基硅烷偶联剂修饰的过渡层，再用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)/n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)方法共价偶联聚谷氨酸，经洗涤和50℃～100℃真空烘箱中干燥4h后待用。
将实施例1的待分离的混合斑检材用200μl-10ml上皮细胞消化液(含5％重量～20％重量三羟甲基氨基甲烷、0.5％重量～10％重量氯化钠、1％重量～10％重量乙二胺四乙酸二钠和10μl～100μl浓度为10mg/ml的蛋白酶k)进行消化，把消化后含精子细胞和其他杂质的产物，转移到碳酸酯膜微孔沟槽内，静置20分钟后，可通过孔道两端压力差的调节控制孔道内液体的流动来促进吸附，然后利用一定流量的空气流除去沟槽内残余溶液。然后分三次注入2ml～20ml缓冲溶液(含1％重量～10％重量氯化铯、5％重量～20％重量三羟甲基氨基甲烷、0.5％重量～10％重量氯化胍、0.5％重量～5％重量磷酸酰胆碱和2％重量～30％重量葡萄糖)进行洗涤，每次洗涤后再利用空气流排除沟槽内残余溶液。
然后往该沟槽内注入200μl～10ml精子细胞裂解液或消化液(主要组分为10％重量～30％重量异硫氰酸胍、0.1％重量～0.5％重量十二烷基硫酸钠、0.1mol/l～1mol/l的dtt)，加热反应10分钟～60分钟，可通过孔道两端压力差的调节控制孔道内液体的流动来促进裂解，然后经磁珠或硅膜结合、产物洗涤、dna脱附等过程，获得混合斑检材所含男性dna模板。
所提取的男性dna模板经pcr扩增，电泳仪检测，可获得男性dna的str谱图，请参见图4所示。
由图1和图4可知，采用本发明的基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法可以实现混合斑中精子和女性上皮细胞进行有效分离，获得的男性精子细胞提取的dna模板的str谱图没有明显的女性混合干扰，可以作为案件侦破和诉讼的有效证据。
因此，本发明通过在膜表面共价或物理修饰一层聚肽，用于男性精子细胞的吸附，利用精子细胞和其它细胞/女性成分dna与聚肽的亲和力差异，可在外力和缓冲液洗涤的辅助下，除去其它细胞和女性成分dna，以实现混合斑中男性精子细胞和女性上皮细胞进行有效分离的目的，获得可满足法医dna检测所需的男性精子细胞。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)可实现男性精子细胞的快速分离，操作简便；
2)该方法不依赖于精子细胞和阴道上皮细胞的尺寸和形态的差异，无需要求保持精子细胞形态的完整性，且精子细胞回收率高；
3)聚肽修饰膜可用于管，孔、沟槽或板表面等不同形状的耗材上，可与自动化提取设备和微流控提取设备兼容；
4)该方法适用检材范围广，不仅适用于常规新鲜混合斑检材，也适用于陈旧、干燥、降解严重的疑难混合斑检材。
综上，本发明的基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法能够有效分离混合斑中男性精子细胞和女性上皮细胞，获得满足法医dna检测所需的男性精子细胞，设计巧妙，操作简便，分离快速，适于大规模推广应用。
由此可见，本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中予以展示和说明，在不背离所述原理下，实施方式可作任意修改。所以，本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。
1.一种基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用聚肽对膜进行修饰获得聚肽修饰膜；
(2)将待分离的混合斑检材的分散液或经上皮细胞消化液消化的消化产物和所述聚肽修饰膜混合吸附；
(3)弃去残余溶液，并洗涤所述聚肽修饰膜，获得表面富集男性精子细胞的所述聚肽修饰膜。
2.如权利要求1所述的基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述聚肽的肽链结构单元包含的氨基酸残基为赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸中的一种或几种。
3.如权利要求1所述的基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述修饰为物理修饰或共价修饰。
4.如权利要求1所述的基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述膜是聚乙烯膜、聚丙烯膜、聚氯乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚酰胺类膜、聚碳酸酯膜、聚甲醛膜、聚酯类膜、聚苯醚膜、聚甲基丙烯酸甲酯膜、聚氨酯膜、聚塑料类膜、聚四氟乙烯膜、乙烯-四氟乙烯共聚物膜、聚苯硫醚膜、聚砜膜、聚酰亚胺膜、尼龙膜、羧甲基纤维素膜、硝酸纤维素膜或丙酸纤维素膜。
5.如权利要求1所述的基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述膜负载在耗材上或者所述膜是所述耗材的一部分。
6.如权利要求5所述的基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述耗材是管、孔、沟槽或板。
7.如权利要求1所述的基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述弃去残余溶液通过施加外力实现。
8.如权利要求7所述的基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述外力是水平或垂直方向上施加的力。
9.如权利要求1所述的基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述洗涤所述聚肽修饰膜采用缓冲液实现。
10.如权利要求9所述的基于聚肽修饰膜实现混合斑检材精子细胞分离的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述缓冲液包含氯化锂、溴化锂、氯化钠、溴化钠、氯化钾、溴化钾、氯化铯、溴化铯、碳酸钠、碳酸钾、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠、氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钾、乙醇、异丙醇、乙二醇、n，n-二甲基甲酰胺、甘露醇、葡萄糖、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、月桂酰基肌氨酸钠、磷酸酰胆碱和甜菜碱中的一种或几种。
技术总结