本发明涉及干细胞生物学与再生医学领域，具体地涉及一种制备感光细胞的方法。
背景技术：
视网膜退行性疾病是由于先天性或后天性眼病引起感光细胞功能障碍的一类疾病，主要包括年龄性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration，amd)、视网膜色素上皮变形(retinitispigmentosa，rp)及少年型黄斑营养不良(stargardt病)等。尽管这些疾病的发病机制和病程进展不同，但共同的结局都是视网膜色素上皮细胞(retinitispigmentosaepithelium，rpe)及感光细胞损伤、丢失而引起视网膜功能障碍，最终导致患者视力丧失至失明。
目前视网膜退行性疾病尚无有效的治疗措施，多种治疗方式仍处于探索阶段，例如基因疗法、细胞疗法及药物的研发。治疗视网膜退行性疾病的药物以神经营养和抗炎作用为主，或者通过抗血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)治疗视网膜退行性疾病导致的脉络膜新生血管(choroidalneovascularization，cnv)。对于stargardt病而言，基因疗法未尝不是一个好的治疗方式。rp是单基因突变性疾病，符合基因治疗的适应证，但是对于大多数视网膜退行性疾病而言，基因治疗的局限性还很大。而且，药物及基因治疗无法恢复已受损的rpe及感光细胞。
虽然视网膜退行性疾病患者的视觉受损，但是其视网膜至脑的投射和连接仍然是相对完整的，在此基础上“替代治疗”—移植正常视网膜细胞或者可以替代视网膜细胞功能的细胞，是恢复视网膜功能的有效途径。因此，细胞替代治疗被认为是目前最有应用前景和临床转化潜能的治疗策略之一。
细胞替代治疗中靶细胞的类型主要有rpe细胞和感光细胞。rpe细胞具有保护和支持感光细胞，维持神经视网膜的功能，并且在退行性眼病中较早受累，对于晚期视网膜疾病常伴随着感光细胞的不可逆性损伤，单纯的rpe移植对于此阶段的视功能改善程度非常有限。因此，感光细胞替代治疗研究是晚期视网膜退行性疾病的关键。而且，眼的层次结构明确，屈光介质透明，操作定位方便，利用光学成像技术可以直接进行结果观察，诸多优势使得细胞替代治疗在视网膜疾病研究领域发展更为迅速。
细胞移植的治疗机制主要为神经营养、免疫调节、细胞替代和突触形成。干细胞具有无限增殖和产生各种细胞的潜能，是细胞替代治疗的一种有前途的细胞。细胞移植早期，移植的干细胞/前体细胞主要通过分泌营养因子促进视网膜残留细胞的存活和残余视功能的部分恢复；同时移植细胞也可通过免疫调节，抑制小胶质细胞的激活，保护视功能。此外，移植细胞也可释放免疫调节性细胞因子和趋化因子，以及表达免疫调节相关受体以减轻免疫反应。移植干细胞/前体细胞的神经营养效应和免疫调节效应在细胞移植早期对视功能的保护起到了关键作用，而细胞移植治疗的长效机制主要基于细胞替代和突触形成，其过程为移植细胞从移植区域迁徙至外核层，分化为感光细胞，与宿主视网膜形成突触连接，并整合进入视网膜环路。种子细胞的选择对整合效果至关重要。多能干细胞因其具有多潜能分化特性及体外无限增殖能力而被广泛认为是种子细胞来源的理想选择。多能干细胞来源的感光细胞在治疗视网膜变性疾病方面展现了巨大的潜力。
但是干细胞的移植也具有一定的劣势。在干细胞定向诱导分化过程为感光细胞的过程中，如果感光细胞的纯度不高，残存的未分化细胞具有致瘤的可能性，其临床使用安全性有待进一步评估。另一方面，干细胞在定向诱导分化过程中，普遍存在着分化效率低的问题，高效诱导分化方案的确立需要进一步探索。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的局限，提供一种制备感光细胞的方法，提高感光细胞的移植纯度，降低非感光性细胞植入引发的致瘤性概率；并且进一步提高移植细胞与宿主细胞的整合效率，减少排异反应。
本发明的技术方案如下：
一种制备感光细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将人源多能干细胞诱导分化为成纤维细胞；
(2)在步骤(1)所得的成纤维细胞中转染nrl-trfp基因，得到nrl-trfp成纤维细胞；
(3)将步骤(2)所得的nrl-trfp成纤维细胞诱导分化为感光细胞；
其中步骤(3)具体包括以下操作：
第一阶段：在nrl-trfp成纤维细胞中加入第一培养基，每100ml所述第一培养基包括：
kosr(干细胞培养基):10ml；
b27(神经细胞生长添加剂，50×):2ml；
noggin(noggin是bmp信号的一种蛋白抑制剂):25μl；
igf1(胰岛素样生长因子1):2.5μl；
dmem/f12(商业化培养基):88ml；
valproicacid(丙戊酸)：0.5mm；
chir99021(小分子抑制剂，抑制gsk-3α/β信号通路)：4.8μm；
repsox(小分子抑制剂，选择性抑制tgfβr-1/alk5信号通路)：2μm；
forskolin(腺苷酸环化酶激活剂)：10μm；
第二阶段：将第一培养基更换为第二培养基，每100ml所述第二培养基包括：
kosr:10ml；
b27:2ml；
noggin:25μl；
igf1:2.5μl；
dmem/f12:88ml；
valproicacid：0.5mm；
chir99021：4.8μm；
repsox：2μm；
forskolin：10μm；
iwr1(端锚聚合酶抑制剂，抑制wnt/β-catenin信号传导途径)：10μm；
第三阶段：将第二培养基更换为第三培养基，每100ml所述第三培养基包括：
kosr:10ml；
b27:2ml；
noggin:25μl；
igf1:2.5μl；
dmem/f12:88ml；
valproicacid：0.5mm；
chir99021：4.8μm；
repsox：2μm；
forskolin：10μm；
iwr1：10μm；
sonichedgehog(神经元细胞的促分裂因子，能够直接促进螺旋神经元细胞的发育)：3nm；
taurine(牛磺酸)：100μm；
视黄酸：1μm。
作为上述技术方案的进一步改进，所述步骤(3)进一步包括第四阶段：将第三培养基更换为第四培养基，每100ml所述第四培养基包括：
b27:2ml；
n2(无血清细胞培养添加剂):1ml；
noggin:50μl；
iwr1:100μl；
igf1:5μl；
bfgf(碱性成纤维细胞生长因子):80μl；
dmem/f12:97ml；
丙戊酸：0.5mm；
chir99021：4.8μm；
repsox：2μm；
forskolin：10μm。
本发明人经过多次改进和调整，终于发现按照本发明的方法制备感光细胞时，感光细胞的定向分化比例高，降低了细胞移植治疗过程中的临床使用风险性。虽然目前无法确定感光细胞定向分化的明确机制，但推测应该跟分化过程中加入的不同组分各自调节的基因、蛋白以及信号通路的相互协同的综合作用相关。
nrl基因定位于人染色体14q11.1-q11.27，共包含4474bp的dna，含3个外显子，大小分别为90bp,381bp和333bp，编码碱性亮氨酸拉链蛋白(basicmotif-leucinezipper,bzip)，在视网膜的发育和分化、成人视网膜的其他基因表达方面起重要的作用。本发明人发现，在成纤维细胞中转染nrl-trfp基因后，后续感光细胞的定向分化效率会明显提高。而且，红色荧光基因只有在纤维细胞诱导为感光细胞后才会被激发，进一步验证了感光细胞已经被成功诱导出来。
作为上述技术方案的进一步改进，其中，第一阶段为2～3天；第二阶段为4～5天；第三阶段为3～4天；第四阶段为4～5天。
作为上述技术方案的进一步改进，其中步骤(1)具体包括以下操作：
(1)用gelatin胶(gelatin聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化)包被培养瓶，用mtesr1培养基或e8培养基培养人源多能干细胞(mtesr1培养基或e8培养基是商业化的干细胞培养基)；
(2)待人源多能干细胞贴壁生长至80％，清洗后，加入mef培养基(小鼠胚胎成纤维细胞完全培养基)；
(3)培养6～12天，期间要换液；
(4)消化细胞，离心，按照细胞密度1×106/孔，将细胞铺在用gelatin基质胶包被6孔板中；
(5)培养5天左右，消化细胞，离心，按照细胞密度2×105/孔，将细胞铺在用0.1％gelatin胶包被的6孔板中；
(6)细胞培养3～5天，即可得到成纤维细胞。
作为上述技术方案的进一步改进，其中步骤(2)具体包括以下操作：
(1)用携带nrl-trfp(氨苄青霉素抗性基因)基因的慢病毒颗粒转染步骤(1)所得的成纤维细胞；
(2)转染24h后，去除慢病毒颗粒，加入mef培养基；
(3)转染48h后，更换为含有1ug/ml嘌呤霉素的mef培养基，待细胞长满后，消化细胞，然后将细胞按照1：2的比例重新铺在被0.1％gelatin胶包被的6孔板中；
(4)每隔一天更换一次含有1ug/ml嘌呤霉素的mef培养基，培养4～6天；
(5)收集细胞，将细胞转移至被0.1％gelatin胶包被的6孔板，用第五培养基再培养3～5天；
第五培养基包括：
mem(商业化培养基):88vol％；
neaa(non-essentialaminoacids，细胞培养添加物，含7种细胞培养所需非必需氨基酸，l-丙氨酸、l-谷氨酸、l-天(门)冬酰胺、l-天(门)冬氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸和甘氨酸):1vol％；
fbs:10％；
pen/strep(青霉素-链霉素):1vol％。
作为上述技术方案的进一步改进，进一步包括步骤(4)：将步骤(3)所得的感光细胞包覆在水凝胶内部或者表面。感光细胞就像“种子”，其所处的微环境水凝胶片材就像“土壤”，这样制备了一个组织工程感光细胞产品，可以提高移植细胞与宿主细胞的整合效率，减少排异反应。
另一方面，本发明还提供了一种采用上述制备感光细胞的方法制备的感光细胞。
另一方面，本发明还提供了感光细胞在制备用于治疗视网膜退行性疾病的药物/生物制品中的应用。
采用本发明方法制备的感光细胞，纯度高，能够降低非感光细胞植入引发的致瘤性，而且能够提高移植感光细胞与宿主细胞的整合效率，减少排斥反应。
附图说明
图1为人源多能干细胞诱导分化为成纤维细胞的显微镜图片。
图2为水凝胶片材。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。
本文使用的术语“感光细胞”指能够进行光转染的生物细胞，感光细胞可以是视杆细胞和视锥细胞。优选地，眼内移植后，其显示出与天然感光细胞的那些类似的功能性活性。
在本发明中，本文使用的术语“分化”指的是在体外培养时，在控制条件下，通过非特化的多能干细胞获得特化细胞(例如感光细胞)的生物过程。分化受细胞基因与细胞外的物理和化学条件的相互作用的控制，通常经由涉及嵌入细胞表面的蛋白质的信号通路。
本文使用的术语“约"，除非明确地指出或从上下文明显得到，应理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均值的2个标准差内。约可被理解为在规定值的10％，9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％或0.01％内。
本发明培养基的配置按照各组分的比例采用常规的方法配置即可。
下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：多能干细胞(hpscs)诱导为成纤维细胞(flcs)
1、复苏hpscs细胞(可以商业化购买)前，准备好稀释液,复苏液，并用geltrex包被培养瓶。
2、用mtesr1或e8培养基培养hpscs，每天换液；
3、细胞生长至80％时，用1×pbs清洗两次，加入mef培养基；
4、前四天每天换液，之后每两天换一次液，培养至6～12天；
5、用0.05％trypsin-edta消化细胞，离心，细胞密度1×106/孔，将细胞铺在用geltrex包被6孔板中；
6、细胞长至5天左右，用0.05％trypsin-edta消化细胞，离心后将细胞铺在用0.1％gelatin胶包被的6孔板，细胞密度2×105；
7、细胞培养3～5天，细胞形态均匀，呈成纤维细胞样，如图1所示；
8、每隔3～4天可以进行传代或冻存(冻存液10％dmso 90％mef培养基)。
实施例2：携带nrl-trfp基因的慢病毒转染flcs
1、将hflcs培养在用0.1％gelatin胶包被的6孔板，细胞密度2×105；
2、当细胞密度达到50～60％时，用携带nrl-trfp基因的慢病毒颗粒转染hflcs；
3、转染24h后，去除慢病毒颗粒，加入mef培养基；
4、转染48h后，加入嘌呤霉素(终浓度1ug/ml)的mef培养基，如果细胞长至100％，用0.05％trypsin-edta消化细胞，然后将细胞按照1：2的比例重新铺在一个0.1％gelatin胶包被的6孔板；
5、每隔一天更换一次含有嘌呤霉素的mef培养基，培养4～6天；
6、收集嘌呤霉素药物处理过的细胞；
7、将细胞转移至一个0.1％gelatin胶包被的6孔板，培养3-5天；
8、慢病毒转染的nrl-trfpflcs每3～4天传一次代，如若冻存，冻存液(10％dmso 90％mef培养基)。
实施例3：nrl-trfpflcs细胞诱导为化学重编程的感光细胞；
注：在细胞诱导整个过程中，所有的小分子或者培养基根据细胞的形态，每日补充。
1、nrl-trfphflcs培养在用0.1％gelatin胶包被的12孔板中，培养基为第五培养基，细胞密度50～80×103；
2、第1天：将培养液换为第一培养基；
3、第3天：将第一培养基更换为第二培养基；
4、第4～7天：根据细胞的状态更换第二培养基；
5、第8天：将第二培养基更换为第三培养基；
6、第10～11天：可以观察、收集；
7、第15-16天：可以进一步将第三培养基更换为第四培养基，进一步提高感光细胞的分化比例和分化效率。
感光细胞会表达多种感光细胞标志物，例如：nrl(神经视网膜特异性亮氨酸拉链蛋白)、视紫红质、视蛋白、抑制蛋白等，通过rt-pcr或流式细胞仪检测这些感光细胞的标志物，即可检测所得的感光细胞的分化情况。
实施例4：组织工程感光细胞产品
将诱导分化的感光细胞，通过包覆在水凝胶片材(如图2所示，直径10mm，厚度1mm的圆形的水凝胶片材)内部或水凝胶片材的表面，感光细胞就像“种子”，其所处的微环境水凝胶片材就像“土壤”，制备了一个组织工程感光细胞产品。
所制备的感光细胞产品可以移植入受试者眼内的各种靶位点，例如，感光细胞的移植到达眼的视网膜下腔。此外，由于细胞的迁移能力和积极的旁分泌作用，可以将向其他眼部隔室中的移植视为包括玻璃体腔、视网膜的内部或外部、视网膜周围和脉络膜内。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
1.一种制备感光细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将人源多能干细胞诱导分化为成纤维细胞；
(2)在步骤(1)所得的成纤维细胞中转染nrl-trfp基因，得到nrl-trfp成纤维细胞；
(3)将步骤(2)所得的nrl-trfp成纤维细胞诱导分化为感光细胞；
其中步骤(3)具体包括以下操作：
第一阶段：在nrl-trfp成纤维细胞中加入第一培养基，每100ml所述第一培养基包括：
kosr:10ml；
b27:2ml；
noggin:25μl；
igf1:2.5μl；
dmem/f12:88ml；
丙戊酸：0.5mm；
chir99021：4.8μm；
repsox：2μm；
forskolin：10μm；
第二阶段：将第一培养基更换为第二培养基，每100ml所述第二培养基包括：
kosr:10ml；
b27:2ml；
noggin:25μl；
igf1:2.5μl；
dmem/f12:88ml；
丙戊酸：0.5mm；
chir99021：4.8μm；
repsox：2μm；
forskolin：10μm；
iwr1：10μm；
第三阶段：将第二培养基更换为第三培养基，每100ml所述第三培养基包括：
kosr:10ml；
b27:2ml；
noggin:25μl；
igf1:2.5μl；
dmem/f12:88ml；
丙戊酸：0.5mm；
chir99021：4.8μm；
repsox：2μm；
forskolin：10μm；
iwr1：10μm；
sonichedgehog：3nm；
牛磺酸：100μm；
视黄酸：1μm。
第四阶段：将第三培养基更换为第四培养基，每100ml所述第四培养基包括：
b27:2ml；
n2:1ml；
noggin:50μl；
iwr1:100μl；
igf1:5μl；
bfgf:80μl；
dmem/f12:97ml；
丙戊酸：0.5mm；
chir99021：4.8μm；
repsox：2μm；
forskolin：10μm。
2.如权利要求1所述的制备感光细胞的方法，其中，第一阶段为2～3天；第二阶段为4～5天；第三阶段为3～4天；第四阶段为4～5天。
3.如权利要求1所述的制备感光细胞的方法，其中步骤(1)具体包括以下操作：
(1)用matrigel胶包被培养瓶，用mtesr1培养基或e8培养基培养人源多能干细胞；
(2)待人源多能干细胞贴壁生长至80％，清洗后，加入mef培养基；
(3)培养6～12天，期间要换液；
(4)消化细胞，离心，按照细胞密度1×106/孔，将细胞铺在用matrigel胶包被6孔板中；
(5)培养5天左右，消化细胞，离心，按照细胞密度2×105/孔，将细胞铺在用0.1％gelatin胶包被的6孔板中；
(6)细胞培养3～5天，即可得到成纤维细胞。
4.如权利要求1所述的制备感光细胞的方法，其中步骤(2)具体包括以下操作：
(1)用携带nrl-trfp基因的慢病毒颗粒转染步骤(1)所得的成纤维细胞；
(2)转染24h后，去除慢病毒颗粒，加入mef培养基；
(3)转染48h后，更换为含有1ug/ml嘌呤霉素的mef培养基，待细胞长满后，消化细胞，然后将细胞按照1：2的比例重新铺在被0.1％gelatin胶包被的6孔板中；
(4)每隔一天更换一次含有1ug/ml嘌呤霉素的mef培养基，培养4～6天；
(5)收集细胞，将细胞转移至被0.1％gelatin包被的6孔板，用第五培养基再培养3～5天；
第五培养基包括：
mem:88vol％；
neaa:1vol％；
fbs:10vol％；
pen/strep:1vol％。
5.如权利要求1所述的制备感光细胞的方法，进一步包括步骤(4)：将步骤(3)所得的感光细胞包覆在水凝胶内部或者表面。
6.如权利要求5所述的制备感光细胞的方法，所述水凝胶为直径10mm，厚度1mm的圆形水凝胶片材。
7.一种采用如权利要求1～6任一项所述的制备感光细胞的方法制备的感光细胞。
8.如权利要求7所述的感光细胞在制备用于治疗视网膜退行性疾病的药物/生物制品中的应用。
技术总结