本发明属于生物技术领域，涉及一种从脐带中分离脐带间充质干细胞的方法。本发明还涉及上述脐带间充质干细胞培养中所用的培养基及相关试液。使用本发明方法分离培养所述脐带间充质干细胞时，能够呈现本发明所述优异技术效果。特别是，本发明涉及使用无血清的培养基从脐带中分离培养间充质干细胞的方法。特别是，在本发明分离培养所述脐带间充质干细胞中所用的无血清培养基中包含血小板裂解物。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymalstemcell，msc)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(caplanai.mesenchymalstemcells.jorthopres.1991,9:641-650.pittengermf,mackayam,becksc,etal.multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells.science.1999；284:143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。
干细胞是人体细胞的祖先，我们体内的所有细胞均来自于干细胞。当体内的细胞衰老死亡或者损伤变性时，干细胞就会生长和转变出可以替代它们的细胞。作为种子细胞，临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。人间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，msc最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。最初的临床研究是1995年由lazarus等人进行的，他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体msc，在体外扩增培养4～7周，然后再静脉注射入患者体内，患者被分为3组，分别给予不同剂量的msc，注射后没有观察到毒副作用，提示msc用于移植治疗安全可靠。随后自体msc的临床报道逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病(gvhd)、心脏系统疾病等，在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。
间充质干细胞的分离培养以及传代培养工艺是关系到干细胞作为治疗药物使用安全性的关键步骤。培养工艺中尤其是培养基的成分是主要的影响参数。在已有的文献记载的方法中，对间充质干细胞进行分离培养和传代培养时，所用的培养基多需要添加血清，例如胎牛血清，特别是通常需要添加10％胎牛血清，例如通常采用msc完全培养基(其为包含10％胎牛血清的dmem-f12培养基)对间充质干细胞进行分离和培养传代。
然而，一方面，胎牛血清的成本相当高，这对于间充质干细胞的培养是不利的；另一方面，胎牛血清作为一种动物来源的外源性物质，其存在于干细胞中会对细胞的临床使用的安全性产生潜在风险。因此，无血清的分离和传代培养间充质干细胞是有意义的。
脐带间充质干细胞(umbilicalcordmesenchymalstemcells，ucmscs)是存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。应用灭活脐带血清培养体系可成功扩增人脐带间充质干细胞，培养的细胞具有间充质干细胞的基本特性，为建立间充质干细胞库和临床应用提供了理论依据，然而此法的收率相当有限。脐带间充质干细胞(mscs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。有报道从人脐带中分离出mscs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓mscs，免疫原性比骨髓mscs低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。脐带间充质干细胞的主要用途包括：能具有较强的免疫调节作用，可用于治疗红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病，降低细胞或器官移植后的免疫排斥反应，提高细胞或器官移植的成功率；能促进造血恢复功能，与单一造血干细胞移植比较，间充质干细胞和造血干细胞共移植能显著提高白血病和难治性贫血等疾病的治疗效果；能修复损伤或病变的组织器官，用于治疗骨和肌肉衰退性疾病、心脑血管疾病、肝病、脑及脊髓神经损伤和老年痴呆等。脐带间充质干细胞的一种典型分离培养方法是，取新鲜健康脐带，用pbs冲洗干净后，用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织，将所得组织充分剪碎，加入α-mem培养液置于37℃，5％的co2培养箱培养，培养液中含10％fbs，100u/ml青霉素，100u/ml链霉素。脐带组织培养5-7天后，可见有部分细胞从组织块周围爬出，形态呈细小的梭形，一周后，细胞开始迅速增殖，形成大小不等的细胞集落，待细胞长满后，用0.25％胰蛋白酶消化传代。
现有技术公开了诸多有关分离培养脐带间充质干细胞的培养方法。例如，cn102965338a(申请号：2012105103791)公开了一种人脐带间充质干细胞的提取和培养方法。脐带组织切碎后经i型胶原酶消化后移入含培养基的培养瓶中持续培养。所用培养基为低糖dmem基础培养基并且添加了胎牛血清、成纤维生长因子、上皮细胞生长因子、细胞转录因子、胆固醇。使用该发明的提取和培养方法可以长期培养人的脐带间充质干细胞，并且维持干细胞活性。据信该发明解决了目前人脐带间充质干细胞培养中细胞衰老过快以及分化问题，能够长期获得具有干细胞特性的人脐带间充质干细胞。
cn103421739a(申请号：2013101962521)提供了一种简单、高效分离脐带间充质干细胞的方法，包括：使用插管分离脐带间充质干细胞以及使用trypletm消化和无血清培养基培养脐带间充质干细胞的步骤。据信该发明能够更快的得到完全来自母体的脐带间充质干细胞，而且对细胞的损伤更小；经试验证明发明的方法能最大可能的保护间充质干细胞，具有更高活率，以及有更高的活性，可以更加有效进行成脂、成骨诱导分化。
cn104232573a(申请号：2014104597914)公开了一种用于培养干细胞的生长培养基，该生长培养基含有基础培养基和添加剂，所述添加剂含有抗人血管内皮生长因子的抗体、抗人类表皮生长因子受体1的抗体、抗人类表皮生长因子受体2的抗体和鸟苷-5-三磷酸三钠盐。该发明还提供了所述的生长培养基在培养脐带间充质干细胞中的用途。发明还提供了一种培养脐带间充质干细胞的方法，该方法包括：将脐带间充质干细胞接种于如上所述的生长培养基中进行培养。通过上述技术方案，据信该发明能够大幅度地提升脐带间充质干细胞在体外的扩增能力。
cn105112365a(申请号：2015105051216)提供一种人脐带间充质干细胞的无血清培养基，属于干细胞技术领域，包括dmem基础培养基，还包括如下组分：重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白、纤维连接蛋白、维生素c、生物素、干细胞生长因子和干细胞因子。据信该发明提供的人脐带间充质干细胞的无血清培养基无需进行培养瓶包被，操作简便，细胞增殖速率高，且保持了良好的干细胞幼稚形态和干细胞特性，具有良好的细胞诱导分化潜能，降低了成本。
cn105112360a(申请号：2015104231387)提供了一种脐带间充质干细胞的大量培养方法，包括：获取脐带沃顿胶；将脐带沃顿胶进行p0代培养至细胞融合度为40％～50％后，传p1代培养至细胞融合度为85％～95％；将p1代细胞于平板培养基进行接种培养，分离未被平板培养基粘附的悬浮细胞；将悬浮细胞于含有白血病抑制因子和成纤维样生长因子的培养基传p2代培养。据信该发明的上述组织贴壁培养的方法，将早期发生多向性变化较低的p0细胞直接培养至p1代后，用组织培养平板进行粘附筛选，保持细胞分化度的均一；之后用白血病抑制因子和成纤维样生长因子增加细胞在p2代培养中的贴壁性能以及抑制分化，从而得到分化度较低且趋于一致、贴壁能力较强利于收集的脐带间充质干细胞的。
cn105602893a(2015109956392)公开了一种无血清培养脐带间充质干细胞方法，发明的步骤包括：(1)配制纤维连接蛋白、重组人表皮生长因子和重组人成纤维生长因子的包被液，包被塑料培养瓶；(2)取人脐带组织华尔通氏胶，剪碎，加入步骤(1)；(3)步骤(2)所得，加入无血清培养基；(4)置37℃、5％二氧化碳培养箱培养，10～12天长满间充质干细胞；(5)磷酸盐缓冲液洗涤、triple酶消化；(6)加入磷酸盐缓冲液，终止消化；(7)收集间充质干细胞上清液；(8)离心；(9)收集沉淀，获得所需间充质干细胞。据信该发明的方法，间充质细胞能够传代20代，保持间充质干细胞特性，可以治疗疾病，具有应用前景。
cn106399237a(申请号：2016110843258)公开了一种脐带间充质干细胞的原代分离方法。发明所述分离方法先从脐带上获得华通氏胶，然后与含有20％fbs的dmem/f12培养基混合，在研钵中十字交叉研磨30～50个回合，期间每10个回合暂停15s，重新聚拢华通氏胶；研磨后的华通氏胶用培养基重悬并过滤，滤液在培养基中培养至获得间充质干细胞。据信该发明以特定的研磨方式和频率替换组织块贴壁培养法中的剪刀剪碎操作，达到快速处理脐带组织的目的，并且显著缩短了爬出细胞的出现时间，同时对传代细胞的增殖能力无影响，在整体上提高了脐带间充质干细胞原代分离的效率。
cn107653226a(申请号：2017111313893)涉及一种人脐带间充质干细胞分离培养方法，包括如下步骤：取足月剖宫产胎儿离体脐带，放入无菌的组织保存液中保存；用生理盐水冲洗数次，去除残留血迹；用带齿镊子剔除组织块的两条脐静脉和两条脐动脉，用无菌剪刀将华通胶完全剪碎；将步骤剪碎的华通胶转移至培养基中振荡后离心；将离心沉淀部分转移至细胞培养瓶中；培养第5-6天可见部分细胞从组织小块周围爬出，之后每隔3天更换一次培养基，继续培养；在第14天左右可见细胞融合度达80％以上，呈漩涡式生长；之后每3天传一代，可得到充足的间充质干细胞。据信该发明比传统的组织块法更加容易，干细胞纯度和得率更高。
尽管现有技术公开了一些诸如上述的有关脐带间充质干细胞的培养方法，然而这些方法多需要使用包含较浓度胎牛血清的培养基。
本领域仍然期待提供一种新的方法来分离培养甚至传代培养间充质干细胞，尤其是提供一种无胎牛血清的新方法进行间充质干细胞分离培养甚至传代培养。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种新的方法来制备脐带间充质干细胞，特别是提供一种适用于从脐带中分离获取脐带间充质干细胞的方法，并且期待这种方法能够呈现出细胞收率高和/或细胞活率高等特性和/或其它优异性能。本发明已经出人意料的发现使用本发明方法能够获得如本发明所述一个或多个方面的技术效果。本发明基于此发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了分离培养原代脐带间充质干细胞的方法，包括如下步骤：
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的脐带样本；
(2)d-hanks充分清洗以去除表面血污，使用手术剪将脐带剪成小段，置于平皿中，用手术镊反复挤压，清除组织中的残留血块，用d-hanks清洗；
(3)剪开组织，剥除表皮，剔除动脉和静脉，得到华通氏胶组织，将华通氏胶切割成小块，称重；
(4)按照规定组织量接种至培养瓶，再添加原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱中培养；
(5)培养至第3d补充完全培养基继续培养，至第5d补充原代完全培养基继续培养，至第7d全换液，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入d-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，将华通氏胶切割成0.25cm2大小的小块。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，按照规定组织量接种至培养瓶是指称取步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g接种至t225培养瓶。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，每瓶添加15ml原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱中培养。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，co2培养箱中培养的条件为：5％co2，37℃，饱和湿度。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，培养至第3d补充10ml原代完全培养基继续培养。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，培养至第5d补充10ml原代完全培养基继续培养。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，以100xg离心10min。
根据本发明第一方面的方法，其中所述d-hanks液的配方组成如下：8.0g的nacl、0.4g的kcl、0.06g的kh2po4、0.08g的na2hpo4.12h2o、0.35g的nahco3、水至1000ml。例如，其配制方法如下：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。
根据本发明第一方面的方法，其中所述原代完全培养基是以dmem-f12培养基为基质配制并包含：0.8％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的egf、25ng/ml的bfgf。
根据本发明第一方面的方法，其中所述原代完全培养基改用原代增补培养基代替。根据本发明第一方面的方法，其中所述原代增补培养基是以dmem-f12培养基为基质配制并包含：0.8％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的egf、25ng/ml的bfgf、0.1％硫代甘油、1％果糖。
根据本发明第一方面的方法，其中所述dmem-f12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、l-亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、l-赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、l-蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、l-苯丙氨酸35.48mg、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、l-丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、l-苏氨酸53.45mg、维生素h0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、l-丙氨酸4.45mg、d-泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、l-天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、l-天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、l-半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i-肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、l-谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、l-精氨酸盐酸盐147.5mg、l-脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、l-胱氨酸盐酸盐31.29mg、l-色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、l-谷氨酰胺365mg、l-酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、l-缬氨酸52.85mg、盐酸硫胺2.17mg、l-组氨酸盐酸盐31.48mg、d-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、l-异亮氨酸54.47mg、次黄嘌呤2mg、维生素b12为0.68mg、水适量加至1000ml；配制：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。
根据本发明第一方面的方法，其中还包括对分离培养获得的原代脐带间充质干细胞进行检测。例如检测细胞形态和/或免疫表型鉴定。在一个实施方案中，所述免疫表型鉴定是指对cd73、cd90、cd105和cd19、cd11b、cd31、cd45、hladr、cd34进行检测。本发明所得原代脐带间充质干细胞的cd73、cd90、cd105均呈阳性(均大于98％)，cd19、cd11b、cd31、cd45、hladr、cd34均呈阴性(均小于2％)。
进一步的，本发明第二方面提供了一种用于间充质干细胞分离培养的培养基，其亦可称为原代完全培养基，其是以dmem-f12培养基为基质配制并包含：0.8％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的egf、25ng/ml的bfgf。
根据本发明第二方面的培养基，其是以dmem-f12培养基为基质配制并包含：0.8％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的egf、25ng/ml的bfgf、0.1％硫代甘油、1％果糖。
根据本发明第二方面的培养基，其中所述间充质干细胞分离培养是照包括如下步骤的方法进行的：
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的脐带样本；
(2)d-hanks充分清洗以去除表面血污，使用手术剪将脐带剪成小段，置于平皿中，用手术镊反复挤压，清除组织中的残留血块，用d-hanks清洗；
(3)剪开组织，剥除表皮，剔除动脉和静脉，得到华通氏胶组织，将华通氏胶切割成小块，称重；
(4)按照规定组织量接种至培养瓶，再添加原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱中培养；
(5)培养至第3d补充完全培养基继续培养，至第5d补充原代完全培养基继续培养，至第7d全换液，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入d-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
根据本发明第二方面的培养基，其中所述间充质干细胞分离培养的步骤(3)中，将华通氏胶切割成0.25cm2大小的小块。
根据本发明第二方面的培养基，其中所述间充质干细胞分离培养的步骤(4)中，按照规定组织量接种至培养瓶是指称取步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g接种至t225培养瓶。
根据本发明第二方面的培养基，其中所述间充质干细胞分离培养的步骤(4)中，每瓶添加15ml原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱中培养。
根据本发明第二方面的培养基，其中所述间充质干细胞分离培养的步骤(4)中，co2培养箱中培养的条件为：5％co2，37℃，饱和湿度。
根据本发明第二方面的培养基，其中所述间充质干细胞分离培养的步骤(5)中，培养至第3d补充10ml原代完全培养基继续培养。
根据本发明第二方面的培养基，其中所述间充质干细胞分离培养的步骤(5)中，培养至第5d补充10ml原代完全培养基继续培养。
根据本发明第二方面的培养基，其中所述间充质干细胞分离培养的步骤(5)中，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min。
根据本发明第二方面的培养基，其中所述间充质干细胞分离培养的步骤(5)中，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释。
根据本发明第二方面的培养基，其中所述间充质干细胞分离培养的步骤(5)中，以100xg离心10min。
根据本发明第二方面的培养基，其中所述间充质干细胞分离培养是所述d-hanks液的配方组成如下：8.0g的nacl、0.4g的kcl、0.06g的kh2po4、0.08g的na2hpo4.12h2o、0.35g的nahco3、水至1000ml。例如，其配制方法如下：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。
根据本发明第二方面的培养基，其中所述dmem-f12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、l-亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、l-赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、l-蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、l-苯丙氨酸35.48mg、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、l-丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、l-苏氨酸53.45mg、维生素h0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、l-丙氨酸4.45mg、d-泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、l-天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、l-天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、l-半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i-肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、l-谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、l-精氨酸盐酸盐147.5mg、l-脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、l-胱氨酸盐酸盐31.29mg、l-色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、l-谷氨酰胺365mg、l-酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、l-缬氨酸52.85mg、盐酸硫胺2.17mg、l-组氨酸盐酸盐31.48mg、d-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、l-异亮氨酸54.47mg、次黄嘌呤2mg、维生素b12为0.68mg、水适量加至1000ml；配制：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。
根据本发明第二方面的培养基，其中所述间充质干细胞分离培养的步骤中，还包括对分离培养获得的原代脐带间充质干细胞进行检测。例如检测细胞形态和/或免疫表型鉴定。在一个实施方案中，所述免疫表型鉴定是指对cd73、cd90、cd105和cd19、cd11b、cd31、cd45、hladr、cd34进行检测。本发明所得原代脐带间充质干细胞的cd73、cd90、cd105均呈阳性(均大于98％)，cd19、cd11b、cd31、cd45、hladr、cd34均呈阴性(均小于2％)。
进一步的，本发明第三方面提供了一种原代脐带间充质干细胞，其cd73、cd90、cd105均呈阳性，cd19、cd11b、cd31、cd45、hladr、cd34均呈阴性，其是照如下步骤的方法分离培养获得的：
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的脐带样本；
(2)d-hanks充分清洗以去除表面血污，使用手术剪将脐带剪成小段，置于平皿中，用手术镊反复挤压，清除组织中的残留血块，用d-hanks清洗；
(3)剪开组织，剥除表皮，剔除动脉和静脉，得到华通氏胶组织，将华通氏胶切割成小块，称重；
(4)按照规定组织量接种至培养瓶，再添加原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱中培养；
(5)培养至第3d补充完全培养基继续培养，至第5d补充原代完全培养基继续培养，至第7d全换液，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入d-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
根据本发明第三方面的原代脐带间充质干细胞，其中步骤(3)中，将华通氏胶切割成0.25cm2大小的小块。
根据本发明第三方面的原代脐带间充质干细胞，其中步骤(4)中，按照规定组织量接种至培养瓶是指称取步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g接种至t225培养瓶。
根据本发明第三方面的原代脐带间充质干细胞，其中步骤(4)中，每瓶添加15ml原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱中培养。
根据本发明第三方面的原代脐带间充质干细胞，其中步骤(4)中，co2培养箱中培养的条件为：5％co2，37℃，饱和湿度。
根据本发明第三方面的原代脐带间充质干细胞，其中步骤(5)中，培养至第3d补充10ml原代完全培养基继续培养。
根据本发明第三方面的原代脐带间充质干细胞，其中步骤(5)中，培养至第5d补充10ml原代完全培养基继续培养。
根据本发明第三方面的原代脐带间充质干细胞，其中步骤(5)中，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min。
根据本发明第三方面的原代脐带间充质干细胞，其中步骤(5)中，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释。
根据本发明第三方面的原代脐带间充质干细胞，其中步骤(5)中，以100xg离心10min。
根据本发明第三方面的原代脐带间充质干细胞，其中所述d-hanks液的配方组成如下：8.0g的nacl、0.4g的kcl、0.06g的kh2po4、0.08g的na2hpo4.12h2o、0.35g的nahco3、水至1000ml。例如，其配制方法如下：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。
根据本发明第三方面的原代脐带间充质干细胞，其中所述原代完全培养基是以dmem-f12培养基为基质配制并包含：0.8％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的egf、25ng/ml的bfgf。
根据本发明第三方面的原代脐带间充质干细胞，其中所述原代完全培养基改用原代增补培养基代替。根据本发明第一方面的方法，其中所述原代增补培养基是以dmem-f12培养基为基质配制并包含：0.8％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的egf、25ng/ml的bfgf、0.1％硫代甘油、1％果糖。
在本发明中，表示细胞数量时，“10^6”表示10的6次方；在本发明中，表示培养面积时，“cm^2”表示平方厘米；其它涉及“^”符号的情形，均具有类似含义；此符号的含义在本领域中亦是公知的。
在本发明上述各种操作步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
在本发明中，术语“脐带间充质干细胞”是指来源于脐带的间充质干细胞。因此在本发明中，特别是涉及本发明的语境中，术语“脐带间充质干细胞”可以与“脐带干细胞”、“干细胞”、“间充质干细胞”互换使用，除非另有明确指明。
在本发明中，术语“pbs缓冲液”或者“pbs”是指磷酸盐缓冲液。本领域技术人员熟知在本发明情形下使用的pbs的一般性配方和配制方法以及它们的一般性质例如ph值或ph范围，并且这些pbs缓冲液通常是可以通过商业途径获得的预配液(或预配粉)，例如用于本发明领域的pbs通常是ph7.4(±0.1)的商品化缓冲液，例如hyclone品牌的pbs缓冲液；本领域经典的应用时的pbs缓冲液组成中包括137mm氯化钠、2.7nm氯化钾和10mm磷酸根，在本发明中如未另外特别说明，所用pbs使用时的组成均为该组成。
本发明方法分离培养脐带间充质干细胞，所得脐带间充质干细胞具有非常高的活率且具有非常高的收率。本发明方法呈现如本文描述的一个或多个方面的优异技术效果。
附图说明
图1：间充质干细胞的显微镜下细胞形态(100×)。
图2：细胞定向分化潜能，a)成脂对照，b)成脂诱导；c)成骨对照，d)成骨诱导；e)成软骨对照，f)成软骨诱导。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。
在本发明中，如未特别说明，试验中用到的dmem-f12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、l-亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、l-赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、l-蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、l-苯丙氨酸35.48mg、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、l-丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、l-苏氨酸53.45mg、维生素h0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、l-丙氨酸4.45mg、d-泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、l-天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、l-天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、l-半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i-肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、l-谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、l-精氨酸盐酸盐147.5mg、l-脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、l-胱氨酸盐酸盐31.29mg、l-色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、l-谷氨酰胺365mg、l-酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、l-缬氨酸52.85mg、盐酸硫胺2.17mg、l-组氨酸盐酸盐31.48mg、d-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、l-异亮氨酸54.47mg、次黄嘌呤2mg、维生素b12为0.68mg、水适量加至1000ml；配制：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。
在本发明中，试验中用到的血小板裂解物可以容易从市场购得，如未特别说明，本文试验中使用的是购自sigma-aldrich的pltgoldhumanplateletlysate，其货号为scm151。
在本发明中，试验中用到的ⅱ型胶原酶可以容易从市场购得，如未特别说明，本文试验中使用的是购自gibco。
在本发明中，试验中用到的bfgf(碱性成纤维细胞生长因子)可以容易从市场购得，如未特别说明，本文试验中使用的是购自sigma-aldrich，其货号为gf003。
在本发明中，试验中用到的egf(表皮生长因子)可以容易从市场购得，如未特别说明，本文试验中使用的是购自gibco，其货号为phg0311l。
在本发明中，试验中用到的重组胰岛素可以容易从市场购得，如未特别说明，本文试验中使用的是购自solarbio，其货号为i8830。
在本发明中，试验中用到的重组胰酶溶液可以容易从市场购得，如未特别说明，本文试验中使用的是购自兰博康斯公司的2000u/ml浓度的重组胰酶溶液，货号rt2s01。
在本发明中，如未特别说明，试验中用到的d-hanks液其配方组成和制法如下：8.0g的nacl、0.4g的kcl、0.06g的kh2po4、0.08g的na2hpo4.12h2o、0.35g的nahco3、水至1000ml；配制：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。
在本发明中，如未特别说明，试验中用到的原代完全培养基是以dmem-f12培养基为基质配制并包含：0.8％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的egf、25ng/ml的bfgf。
在本发明中，如未特别说明，试验中用到的原代增补培养基是以dmem-f12培养基为基质配制并包含：0.8％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的egf、25ng/ml的bfgf、0.1％硫代甘油、1％果糖。
在本发明的具体实验中，对所制得的某代次干细胞取样，用sysmex血球计数仪进行有核细胞即msc细胞计数，通过台盼兰染色检测细胞活率，并取样用于微生物检测。
实施例1：分离培养原代脐带间充质干细胞
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的脐带(样本qa)；
(2)d-hanks充分清洗以去除表面血污，使用手术剪将脐带剪成3cm长的小段，置于100mm平皿中，用手术镊反复挤压，清除组织中的残留血块，用d-hanks清洗；
(3)剪开组织，剥除表皮，剔除动脉和静脉，得到华通氏胶组织，将华通氏胶切割成0.25cm2大小的小块，称重；
(4)称取步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第5d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
上述步骤(1)～(5)在步骤(4)中以每1.5g/瓶华通氏胶组织块的量(以实际接种量精确折算成1.5g/瓶)接种至t225瓶后，每瓶获得有核细胞数量(重复执行5次的均值)为0.618×10^6(n＝5)(本文中，此数据可称为细胞收获量)，且细胞活率95.3％(n＝5)。
实施例1a：分离培养原代脐带间充质干细胞
步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例1；
(4)称取实施例1之步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代增补培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第5d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
本实施例1a上述步骤(1)～(5)在步骤(4)中以每1.5g/瓶华通氏胶组织块的量(以实际接种量精确折算成1.5g/瓶)接种至t225瓶后，每瓶获得有核细胞数量(重复执行5次的均值)为3.84×10^6(n＝5)(本文中，此数据可称为细胞收获量)，且细胞活率94.6％(n＝5)。
实施例1b：照实施例1a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。本实施例1b的原代脐带间充质干细胞的细胞收获量为0.642×10^6(n＝5)、细胞活率92.6％(n＝5)。
实施例1c：照实施例1a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。本实施例1b的原代脐带间充质干细胞的细胞收获量为0.511×10^6(n＝5)、细胞活率93.1％(n＝5)。
在本文中，实施例1a、实施例1b、实施例1c亦可以称为实施例1的附属实例，而实施例1可称为主实例，它们相互之间可称为实例族。
与实施例1相比，实施例1a、实施例1b、实施例1c细胞活率基本相同，均在92～96％范围内；但是，实施例1a细胞收获量是实施例1的大约6.21倍，实施例1b细胞收获量是实施例1的大约1.04倍，实施例1c细胞收获量是实施例1的大约0.83倍；这些出人意料的发现表明，在原代完全培养基中额外添加少量价格低廉的硫代甘油和果糖，不但可以获得细胞活率基本相当的原代干细胞，更令人鼓舞的是细胞收获量显著增加达4倍之多，在生产成本基本不变的情况下细胞收获量显著增加。但是，当仅仅添加硫代甘油或者仅仅添加果糖时虽然细胞活率未见改变，细胞收获量却并未增加，甚至在仅额外添加硫代甘油时细胞收获量还有明显的降低。
在细胞活率方面，本文主实例实施例2～12以及它们各自的附属a、b、c实例亦呈现与上述实施例1及其附属实例(实施例1a、实施例1b、实施例1c)基本相同的结果，细胞活率均在92～96％范围内，例如实施例2和实施例2a、实施例2b、实施例2c四者所得原代间充质干细胞的细胞活率分别为94.7％、93.2％、95.3％、92.8％。
在细胞收获量方面，本文主实例实施例2～12以及它们各自的附属a、b、c实例亦呈现与上述实施例1及其附属实例(实施例1a、实施例1b、实施例1c)基本相同的趋势甚至结果，主实例实施例2～12的细胞收获量均在(0.577～0.653)×10^6范围内，a组附属实例的细胞收获量均是其各自主实例的5.83～7.06倍，b组附属实例的细胞收获量均是其各自主实例的0.93～1.21倍，c组附属实例的细胞收获量均是其各自主实例的0.77～0.86倍；例如实施例2、实施例2a、实施例2b、实施例2c的细胞收获量(n＝5)分别为0.627×10^6、3.73×10^6(5.95倍)、0.644×10^6(1.03倍)、0.517×10^6(0.82倍)。
对本文主实例实施例1～12以及它们各自的附属a、b、c实例所得原代胎盘间充质干细胞进行检测，细胞形态均正常，免疫表型鉴定显示各原代胎盘间充质干细胞的cd73、cd90、cd105均呈阳性(均大于98％，例如实施例1所得干细胞cd73均大于99.5％)，cd19、cd11b、cd31、cd45、hladr、cd34均呈阴性(均小于2％，例如实施例1所得干细胞cd19均小于0.24％)。
实施例2：分离培养原代脐带间充质干细胞
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的脐带(样本qb)；
(2)d-hanks充分清洗以去除表面血污，使用手术剪将脐带剪成3cm长的小段，置于100mm平皿中，用手术镊反复挤压，清除组织中的残留血块，用d-hanks清洗；
(3)剪开组织，剥除表皮，剔除动脉和静脉，得到华通氏胶组织，将华通氏胶切割成0.25cm2大小的小块，称重；
(4)称取步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第5d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
实施例2a：分离培养原代脐带间充质干细胞
步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例2；
(4)称取实施例2之步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代增补培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第5d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
实施例2b：照实施例2a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。
实施例2c：照实施例2a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。
实施例3：分离培养原代脐带间充质干细胞
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的脐带(样本qc)；
(2)d-hanks充分清洗以去除表面血污，使用手术剪将脐带剪成3cm长的小段，置于100mm平皿中，用手术镊反复挤压，清除组织中的残留血块，用d-hanks清洗；
(3)剪开组织，剥除表皮，剔除动脉和静脉，得到华通氏胶组织，将华通氏胶切割成0.25cm2大小的小块，称重；
(4)称取步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第5d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
实施例3a：分离培养原代脐带间充质干细胞
步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例3；
(4)称取实施例3之步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代增补培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第5d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
实施例3b：照实施例3a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。
实施例3c：照实施例3a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。
实施例4：分离培养原代脐带间充质干细胞
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的脐带(样本qd)；
(2)d-hanks充分清洗以去除表面血污，使用手术剪将脐带剪成3cm长的小段，置于100mm平皿中，用手术镊反复挤压，清除组织中的残留血块，用d-hanks清洗；
(3)剪开组织，剥除表皮，剔除动脉和静脉，得到华通氏胶组织，将华通氏胶切割成0.25cm2大小的小块，称重；
(4)称取步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第5d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
实施例4a：分离培养原代脐带间充质干细胞
步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例4；
(4)称取实施例4之步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代增补培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第5d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
实施例4b：照实施例4a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。
实施例4c：照实施例4a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。
实施例5：分离培养原代脐带间充质干细胞
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的脐带(样本qe)；
(2)d-hanks充分清洗以去除表面血污，使用手术剪将脐带剪成3cm长的小段，置于100mm平皿中，用手术镊反复挤压，清除组织中的残留血块，用d-hanks清洗；
(3)剪开组织，剥除表皮，剔除动脉和静脉，得到华通氏胶组织，将华通氏胶切割成0.25cm2大小的小块，称重；
(4)称取步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第5d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
实施例5a：分离培养原代脐带间充质干细胞
步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例5；
(4)称取实施例5之步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代增补培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第5d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
实施例5b：照实施例5a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。
实施例5c：照实施例5a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。
实施例6：分离培养原代脐带间充质干细胞
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的脐带(样本qf)；
(2)d-hanks充分清洗以去除表面血污，使用手术剪将脐带剪成3cm长的小段，置于100mm平皿中，用手术镊反复挤压，清除组织中的残留血块，用d-hanks清洗；
(3)剪开组织，剥除表皮，剔除动脉和静脉，得到华通氏胶组织，将华通氏胶切割成0.25cm2大小的小块，称重；
(4)称取步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第5d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
实施例6a：分离培养原代脐带间充质干细胞
步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例6；
(4)称取实施例6之步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代增补培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第5d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
实施例6b：照实施例6a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。
实施例6c：照实施例6a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。
实施例7：分离培养原代脐带间充质干细胞
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的脐带(样本qg)；
(2)d-hanks充分清洗以去除表面血污，使用手术剪将脐带剪成3cm长的小段，置于100mm平皿中，用手术镊反复挤压，清除组织中的残留血块，用d-hanks清洗；
(3)剪开组织，剥除表皮，剔除动脉和静脉，得到华通氏胶组织，将华通氏胶切割成0.25cm2大小的小块，称重；
(4)称取步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第5d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
实施例7a：分离培养原代脐带间充质干细胞
步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例7；
(4)称取实施例7之步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代增补培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第5d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
实施例7b：照实施例7a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。
实施例7c：照实施例7a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。
实施例8：分离培养原代脐带间充质干细胞
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的脐带(样本qh)；
(2)d-hanks充分清洗以去除表面血污，使用手术剪将脐带剪成3cm长的小段，置于100mm平皿中，用手术镊反复挤压，清除组织中的残留血块，用d-hanks清洗；
(3)剪开组织，剥除表皮，剔除动脉和静脉，得到华通氏胶组织，将华通氏胶切割成0.25cm2大小的小块，称重；
(4)称取步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第5d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
实施例8a：分离培养原代脐带间充质干细胞
步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例8；
(4)称取实施例8之步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代增补培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第5d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
实施例8b：照实施例8a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。
实施例8c：照实施例8a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。
实施例9：分离培养原代脐带间充质干细胞
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的脐带(样本qi)；
(2)d-hanks充分清洗以去除表面血污，使用手术剪将脐带剪成3cm长的小段，置于100mm平皿中，用手术镊反复挤压，清除组织中的残留血块，用d-hanks清洗；
(3)剪开组织，剥除表皮，剔除动脉和静脉，得到华通氏胶组织，将华通氏胶切割成0.25cm2大小的小块，称重；
(4)称取步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第5d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
实施例9a：分离培养原代脐带间充质干细胞
步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例9；
(4)称取实施例9之步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代增补培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第5d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
实施例9b：照实施例9a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。
实施例9c：照实施例9a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。
实施例10：分离培养原代脐带间充质干细胞
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的脐带(样本qj)；
(2)d-hanks充分清洗以去除表面血污，使用手术剪将脐带剪成3cm长的小段，置于100mm平皿中，用手术镊反复挤压，清除组织中的残留血块，用d-hanks清洗；
(3)剪开组织，剥除表皮，剔除动脉和静脉，得到华通氏胶组织，将华通氏胶切割成0.25cm2大小的小块，称重；
(4)称取步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第5d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
实施例10a：分离培养原代脐带间充质干细胞
步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例10；
(4)称取实施例10之步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代增补培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第5d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
实施例10b：照实施例10a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。
实施例10c：照实施例10a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。
实施例11：分离培养原代脐带间充质干细胞
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的脐带(样本qk)；
(2)d-hanks充分清洗以去除表面血污，使用手术剪将脐带剪成3cm长的小段，置于100mm平皿中，用手术镊反复挤压，清除组织中的残留血块，用d-hanks清洗；
(3)剪开组织，剥除表皮，剔除动脉和静脉，得到华通氏胶组织，将华通氏胶切割成0.25cm2大小的小块，称重；
(4)称取步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第5d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
实施例11a：分离培养原代脐带间充质干细胞
步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例11；
(4)称取实施例11之步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代增补培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第5d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
实施例11b：照实施例11a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。
实施例11c：照实施例11a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。
实施例12：分离培养原代脐带间充质干细胞
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的脐带(样本ql)；
(2)d-hanks充分清洗以去除表面血污，使用手术剪将脐带剪成3cm长的小段，置于100mm平皿中，用手术镊反复挤压，清除组织中的残留血块，用d-hanks清洗；
(3)剪开组织，剥除表皮，剔除动脉和静脉，得到华通氏胶组织，将华通氏胶切割成0.25cm2大小的小块，称重；
(4)称取步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第5d补充10ml原代完全培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
实施例12a：分离培养原代脐带间充质干细胞
步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例12；
(4)称取实施例12之步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g(接种量1.5g/瓶，精密称重组织块)接种至t225培养瓶，再添加15ml原代增补培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱(5％co2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第3d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第5d补充10ml原代增补培养基继续培养，至第7d全换液，至(10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
实施例12b：照实施例12a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。
实施例12c：照实施例12a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代脐带间充质干细胞。
对本发明实施例1～12以及它们各自的附属a、b、c实例制得的p0代间充质干细胞进行传代培养，结果显示全部细胞均可持续传代至p10代以上，细胞均仍保持稳定的持续增殖能力，并且持续传代过程中各代次细胞活率稳定在90％之上，例如实施例1a所得一个批次p0代间充质干细胞持续传代至p10代时细胞活率稳定在93.3％。
试验例1：间充质干细胞的检测
间充质干细胞的典型特征包括：显微镜下呈梭形并贴壁生长，流式细胞术鉴定cd73、cd90、cd105均呈阳性且cd19、cd11b、cd31、cd45、hladr、cd34均呈阴性，定向分化潜能试验显示细胞呈现成骨、成软骨、成脂的分化潜能。
使用本领域公知的方法对本发明实施例1～12以及它们各自的附属a、b、c实例制得的间充质干细胞进行检测，结果：全部间充质干细胞均呈现梭形并贴壁生长(例如实施例1a所得p0代间充质干细胞的显微镜下细胞形态如图1所示)，全部间充质干细胞的cd73、cd90和cd105均大于98％(例如实施例1a所得一个批次p0代间充质干细胞的cd73＝99.1％、cd90＝98.7％、cd105＝99.6％)，全部间充质干细胞的cd19、cd11b、cd31、cd45、hladr、cd34均小于2％(例如实施例1a所得一个批次p0代间充质干细胞的cd19＝0.11％、cd11b＝0.23％、cd31＝0.07％、cd45＝0.12％、hladr＝0.08％、cd34＝0.14％)，定向分化潜能试验显示全部间充质干细胞均有成骨、成软骨、成脂的分化潜能(例如实施例1a所得一个批次p0代间充质干细胞的成骨、成软骨、成脂的分化潜能结果如图2所示)。
以上所述实施例仅是为充分说明本申请而所举的较佳的实施例，本申请的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本申请基础上所作的等同替代或变换，均在本申请的保护范围之内。本申请的保护范围以权利要求书为准。
1.分离培养原代脐带间充质干细胞的方法，包括如下步骤：
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的脐带样本；
(2)d-hanks充分清洗以去除表面血污，使用手术剪将脐带剪成小段，置于平皿中，用手术镊反复挤压，清除组织中的残留血块，用d-hanks清洗；
(3)剪开组织，剥除表皮，剔除动脉和静脉，得到华通氏胶组织，将华通氏胶切割成小块，称重；
(4)按照规定组织量接种至培养瓶，再添加原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱中培养；
(5)培养至第3d补充完全培养基继续培养，至第5d补充原代完全培养基继续培养，至第7d全换液，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入d-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)中，将华通氏胶切割成0.25cm2大小的小块。
3.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中，按照规定组织量接种至培养瓶是指称取步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g接种至t225培养瓶；或者，步骤(4)中，每瓶添加15ml原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱中培养；或者，步骤(4)中，co2培养箱中培养的条件为：5％co2，37℃，饱和湿度。
4.根据权利要求1的方法，其中步骤(5)中，培养至第3d补充10ml原代完全培养基继续培养；或者，步骤(5)中，培养至第5d补充10ml原代完全培养基继续培养；或者，步骤(5)中，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min；或者，步骤(5)中，每瓶加入25ml的d-hanks液稀释；或者，步骤(5)中，以100xg离心10min。
5.根据权利要求1的方法，其中所述d-hanks液的配方组成如下：8.0g的nacl、0.4g的kcl、0.06g的kh2po4、0.08g的na2hpo4.12h2o、0.35g的nahco3、水至1000ml；例如，其配制方法如下：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。
6.根据权利要求1的方法，其中所述原代完全培养基是以dmem-f12培养基为基质配制并包含：0.8％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的egf、25ng/ml的bfgf；或者，其是以dmem-f12培养基为基质配制并包含：0.8％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的egf、25ng/ml的bfgf、0.1％硫代甘油、1％果糖。
7.根据权利要求1的方法，其中所述dmem-f12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、l-亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、l-赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、l-蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、l-苯丙氨酸35.48mg、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、l-丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、l-苏氨酸53.45mg、维生素h0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、l-丙氨酸4.45mg、d-泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、l-天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、l-天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、l-半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i-肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、l-谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、l-精氨酸盐酸盐147.5mg、l-脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、l-胱氨酸盐酸盐31.29mg、l-色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、l-谷氨酰胺365mg、l-酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、l-缬氨酸52.85mg、盐酸硫胺2.17mg、l-组氨酸盐酸盐31.48mg、d-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、l-异亮氨酸54.47mg、次黄嘌呤2mg、维生素b12为0.68mg、水适量加至1000ml；配制：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得；或者，该方法还包括对分离培养获得的原代脐带间充质干细胞进行检测；或者，检测细胞形态和/或免疫表型鉴定；或者，所述免疫表型鉴定是指对cd73、cd90、cd105和cd19、cd11b、cd31、cd45、hladr、cd34进行检测；或者，所得原代脐带间充质干细胞的cd73、cd90、cd105均呈阳性(均大于98％)，cd19、cd11b、cd31、cd45、hladr、cd34均呈阴性(均小于2％)。
8.一种用于间充质干细胞分离培养的培养基，其亦可称为原代完全培养基，其是以dmem-f12培养基为基质配制并包含：0.8％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的egf、25ng/ml的bfgf；或者，其是以dmem-f12培养基为基质配制并包含：0.8％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的egf、25ng/ml的bfgf、0.1％硫代甘油、1％果糖。
9.一种原代脐带间充质干细胞，其cd73、cd90、cd105均呈阳性，cd19、cd11b、cd31、cd45、hladr、cd34均呈阴性，其是照如下步骤的方法分离培养获得的：
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的脐带样本；
(2)d-hanks充分清洗以去除表面血污，使用手术剪将脐带剪成小段，置于平皿中，用手术镊反复挤压，清除组织中的残留血块，用d-hanks清洗；
(3)剪开组织，剥除表皮，剔除动脉和静脉，得到华通氏胶组织，将华通氏胶切割成小块，称重；
(4)按照规定组织量接种至培养瓶，再添加原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置co2培养箱中培养；
(5)培养至第3d补充完全培养基继续培养，至第5d补充原代完全培养基继续培养，至第7d全换液，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用d-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入d-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即p0代)。
10.根据权利要求9的原代脐带间充质干细胞，其中所述原代完全培养基是以dmem-f12培养基为基质配制并包含：0.8％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的egf、25ng/ml的bfgf；例如，其是以dmem-f12培养基为基质配制并包含：0.8％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、0.1％硫代甘油、1％果糖、15ng/ml的egf、25ng/ml的bfgf。
技术总结