本发明属于细胞库构建的技术领域，具体是指一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法。
背景技术：
干细胞治疗技术是近年来生命科学领域的新兴技术，已经被应用到了多种难治性疾病的治疗研究中，并取得了积极的进展。目前，全球干细胞治疗市场可分为地中海贫血、脑瘫、糖尿病、白血病、自闭症等等。随着糖尿病等许多疾病的发病率逐年攀升，增加了对干细胞的临床需求，从而推动了干细胞治疗市场的发展。根据全球知名调研机构technavio发布的报告，全球干细胞治疗市场有望在2020年至2024年间增长5.8亿美元左右，预计将以7％的复合年增长率增长。由此可见，临床需求的增加给干细胞的市场发展带来了更大的空间。
间充质干细胞(mesenchymalstemcell，msc)为干细胞家族重要成员之一，起源于早期发育的中、外胚层，是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，它来源广泛、取材方便、可以大规模扩增，同时具有造血支持及免疫调节功能，使其成为最有前途的临床使用种子细胞。
随着近年来间充质干细胞全领域的快速发展，建立并优化间充质干细胞建库方法，对于开展干细胞研究、推动其临床应用都具有重要意义。
技术实现要素：
为了解决上述难题，本发明提供了一种可以提高干细胞的安全性，简化操作步骤的围产期间充质干细胞种子库的构建方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法，包括如下步骤：
1)产妇筛查；
2)样本采集；
3)样本检测；
4)样本预处理；
5)细胞分离制备；
6)原代培养；
7)传代培养；
8)细胞检测；
9)细胞冻存；
10)建立可供检索的细胞信息档案；
11)编码入库并上传细胞信息档案。
进一步地，所述步骤1)中产妇筛查是指在充分了解产妇及其丈夫家族病史及旅居史的情况符合供者条件后，取5ml产妇外周血及5ml脐血进行病原微生物检测，包括但不限于乙肝、丙肝、梅毒、艾滋等传染病检测。
进一步地，所述步骤2)中样本采集为将正常足月分娩健康新生儿胎盘、脐带进行无菌采集；包括如下步骤：
1)在距脐带两端2-3cm处结扎；
2)剪下结扎好的脐带置于装有30-50ml储存液的采集瓶中；
3)将去掉脐带后的胎盘置于装有400-600ml储存液的采集盒中。
进一步地，所述储存液为含40ui/ml庆大霉素的生理盐水。
进一步地，所述步骤3)中样本检测为对胎盘、脐带进行无菌检测，包括但不限于支原体、真菌、细菌、微生物等，具体的为取储存液及清洗液(即步骤4中最后一步清洗用生理盐水)进行检测。
进一步地，所述步骤4)中样本预处理包括如下步骤：
1)将样本在生理盐水中洗净残血；
2)用75％医用酒精消毒浸泡；
3)再用生理盐水漂洗2-3次。
进一步地，所述步骤5)中的细胞分离制备，包括如下步骤：
1)将预处理后的新鲜胎盘胎儿面(光滑面)朝上，以脐带根部为中心划十字切口，剥离羊膜；
2)将羊膜用生理盐水清洗干净，沥干水分；
3)用眼科弯剪剪碎呈肉糜状转移至50ml离心管内；加入含有5-20倍体积的0.05％-0.25％的酶消化10-120min后，加入5-10倍体积的生理盐水终止消化，吹打混匀，离心机升9降9，1000-2500rpm，4℃离心3-10min洗涤，去除上清后再用生理盐水离心洗涤两次，离心机升9降9，1000-2500rpm，4℃离心3-10min；
4)剥离羊膜后，分离绒毛膜，将剥离的绒毛膜再次用生理盐水清洗干净，沥干水分；
5)用眼科弯剪剪碎呈肉糜状转移至50ml离心管内；加入含有5-20倍体积的0.05％-0.25％的酶消化10-120min后，加入5-10倍体积的生理盐水终止消化，吹打混匀，按照1：(1-3)的比例缓慢加入到分装好的淋巴细胞分离液中，离心机升1降1，1000-2000rpm，4℃离心20分钟，取中间白膜层及以上细胞组织，再用生理盐水离心洗涤两次，离心机升9降9，1000-2500rpm，4℃离心3-10min；
6)将预处理后的脐带样本用手术剪剪成小段，再次用生理盐水清洗干净，剥取华通氏胶，用眼科弯剪剪碎呈肉糜状。
进一步地，所述酶优先选择0.1％胶原酶iv。
进一步地，所述在使用眼科弯剪处理组织块时宜采用弯剪挑起剪10-40min，剪成0.5-1.2mm3大小的组织碎块为宜。
进一步地，所述步骤6)中原代培养包括如下步骤：
1)用适量间充质干细胞原代培养液重悬处理好的组织块或细胞后接种至培养皿中，间充质干细胞原代培养液没过细胞或组织块2-5mm；
2)放置37℃，5％co2培养箱中培养，每隔3天观察一次，每隔5-7天根据细胞爬出情况补液或者换液。
进一步地，所述间充质干细胞原代培养液优先选择添加了干细胞培养因子的无血清培养液，为了进一步防止操作不当引起的细胞污染，间充质干细胞原代培养液中需添加庆大霉素(40ui/ml)。
进一步地，所述步骤7)中传代培养为待细胞爬出融合度达到25-40％后进行传代，包括如下步骤：
1)去除培养液，加入适量生理盐水清洗1-3次，彻底去除残留的组织块；
2)加入1-5ml干细胞温和酶干细胞温和酶或胰酶室温消化1-5min后，加入5倍体积生理盐水终止消化；
3)收集细胞悬液1200-1700rpm离心3-15min弃上清液，所得细胞沉淀记为p0代细胞；
4)将p0代细胞接种至含20-25ml无血清完全培养基的150mm培养皿中，放入co2浓度5％，温度37℃培养箱中培养中继续培养；
5)待细胞增殖融合度达到85-95％后，按照上述处理步骤进行消化收集得到p1代细胞，即为种子细胞。
进一步地，所述细胞消化优先选择干细胞温和酶；细胞消化酶用量以覆盖全部细胞为宜；细胞消化时间以细胞全部变圆可以砂状下滑为宜；
进一步地，所述为了进一步防止操作不当引起的细胞污染，无血清完全培养基需添加庆大霉素(40ui/ml)。
进一步地，所述步骤8)中细胞检测，包括如下步骤：
1)在细胞入库前对细胞培养上清进行细菌、内毒素、支原体检测；
2)采用血球计数板对收获的细胞进行计数并利用台盼蓝染色测定细胞活性，同时利用流式细胞仪检测细胞表面标志物；
3)判定是否符合入库标准。
进一步地，所述步骤9)中细胞冻存，包括如下步骤：
1)将收集的细胞取样计数后，1200-1700rpm离心3-15min，弃上清液；
2)根据细胞数目加入干细胞冻存液重悬细胞，混匀后按每管0.8-1.2×107cells/ml的细胞密度分装至做好标记的2ml冻存管内；
3)将上述2ml冻存管装入程序降温盒后置于-80℃保存，12-24h后，转移至液氮中长期储存，即得到种子细胞库。
进一步地，所述干细胞冻存液为无血清干细胞冻存液，干细胞冻存液中不含二甲基亚砜，其成分为多种氨基酸、羟乙基淀粉和甘油。
进一步地，所述步骤10)、步骤11)中建立可供检索的细胞信息档案、编码入库并上传细胞信息档案，包括如下步骤：
1)按照每人一组系统编号；
2)将相关信息包括编码、制备培养冻存记录和保存位置信息纸质版归档并统一输入计算机记录。
本发明采取上述结构取得有益效果如下：本发明一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法，可以提高干细胞的安全性，简化操作步骤，适用于但不限于科学研究、临床试验及临床应用。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法，包括如下步骤：
1)产妇筛查；
2)样本采集；
3)样本检测；
4)样本预处理；
5)细胞分离制备；
6)原代培养；
7)传代培养；
8)细胞检测；
9)细胞冻存；
10)建立可供检索的细胞信息档案；
11)编码入库并上传细胞信息档案。
所述步骤1)中产妇筛查是指在充分了解产妇及其丈夫家族病史及旅居史的情况符合供者条件后，取5ml产妇外周血及5ml脐血进行病原微生物检测，包括但不限于乙肝、丙肝、梅毒、艾滋等传染病检测。
所述步骤2)中样本采集为将正常足月分娩健康新生儿胎盘、脐带进行无菌采集；包括如下步骤：
1)在距脐带两端2-3cm处结扎；
2)剪下结扎好的脐带置于装有30-50ml储存液的采集瓶中；
3)将去掉脐带后的胎盘置于装有400-600ml储存液的采集盒中。
所述步骤3)中样本检测为对胎盘、脐带进行无菌检测，包括但不限于支原体、真菌、细菌、微生物等，具体的为取储存液及清洗液(即步骤4中最后一步清洗用生理盐水)进行检测。
所述步骤4)中样本预处理包括如下步骤：
1)将样本在生理盐水中洗净残血；
2)用75％医用酒精消毒浸泡；
3)再用生理盐水漂洗2-3次。
所述步骤5)中的细胞分离制备，包括如下步骤：
1)将预处理后的新鲜胎盘胎儿光滑面朝上，以脐带根部为中心划十字切口，剥离羊膜；
2)将羊膜用生理盐水清洗干净，沥干水分；
3)用眼科弯剪剪碎呈肉糜状转移至50ml离心管内；加入含有5-20倍体积的0.05％-0.25％的i型胶原酶消化30-120min后，加入5-10倍体积的生理盐水终止消化，吹打混匀，离心机升9降9，1000-2500rpm，4℃离心3-10min洗涤，再用生理盐水离心洗涤两次；
4)剥离羊膜后，分离绒毛膜，将剥离的绒毛膜再次用生理盐水清洗干净，沥干水分；
5)用眼科弯剪剪碎呈肉糜状转移至50ml离心管内；加入含有5-20倍体积的0.05％-0.25％的i型胶原酶消化30-120min后，加入5-10倍体积的生理盐水终止消化，吹打混匀，按照1：(1-3)的比例缓慢加入到分装好的淋巴细胞分离液中，离心机升1降1，1000-2000rpm，4℃离心20分钟，取中间白膜层及以上细胞组织，再用生理盐水离心洗涤两次，离心机升9降9，1000-2500rpm，4℃离心3-10min；
6)将预处理后的脐带样本用手术剪剪成小段，再次用生理盐水清洗干净，剥取华通氏胶，用眼科弯剪剪碎呈肉糜状。
所述在使用眼科弯剪处理组织块时宜采用弯剪挑起剪10-40min，剪成0.5-1.2mm3大小的组织碎块为宜。
所述步骤6)中原代培养包括如下步骤：
1)用适量间充质干细胞原代培养液重悬处理好的组织块或细胞后接种至培养皿中，间充质干细胞原代培养液没过细胞或组织块2-5mm；
2)放置37℃，5％co2培养箱中培养，每隔3天观察一次，每隔5-7天根据细胞爬出情况补液或者换液。
所述间充质干细胞原代培养液优先选择添加了干细胞培养因子的无血清培养液，为了进一步防止操作不当引起的细胞污染，间充质干细胞原代培养液中需添加庆大霉素(40ui/ml)。
所述步骤7)中传代培养为待细胞爬出融合度达到25-40％后进行传代，包括如下步骤：
1)去除培养液，加入适量生理盐水清洗1-3次，彻底去除残留的组织块；
2)加入1-5ml干细胞温和酶干细胞温和酶或胰酶室温消化1-5min后，加入5倍体积生理盐水终止消化；
3)收集细胞悬液1200-1700rpm离心3-15min弃上清液，所得细胞沉淀记为p0代细胞；
4)将p0代细胞接种至含20-25ml无血清完全培养基的150mm培养皿中，放入co2浓度5％，温度37℃培养箱中培养中继续培养；
5)待细胞增殖融合度达到85-95％后，按照上述处理步骤进行消化收集得到p1代细胞，即为种子细胞。
所述为了进一步防止操作不当引起的细胞污染，无血清完全培养基需添加庆大霉素(40ui/ml)。
所述步骤9)中细胞检测，包括如下步骤：
1)在细胞入库前对细胞培养上清进行细菌、内毒素、支原体检测；
2)采用血球计数板对收获的细胞进行计数并利用台盼蓝染色测定细胞活性，同时利用流式细胞仪检测细胞表面标志物；
3)判定是否符合入库标准。
所述步骤8)中细胞冻存，包括如下步骤：
1)将收集的细胞取样计数后，1200-1700rpm离心3-15min，弃上清液；
2)根据细胞数目加入干细胞冻存液重悬细胞，混匀后按每管0.8-1.2×107cells/ml的细胞密度分装至做好标记的2ml冻存管内；
3)将上述2ml冻存管装入程序降温盒后置于-80℃保存，12-24h后，转移至液氮中长期储存，即得到种子细胞库。
所述干细胞冻存液为无血清干细胞冻存液，干细胞冻存液中不含二甲基亚砜，其成分为多种氨基酸、羟乙基淀粉和甘油。
所述步骤10)、步骤11)中建立可供检索的细胞信息档案、编码入库并上传细胞信息档案，包括如下步骤：
1)按照每人一组系统编号；
2)将相关信息包括编码、制备培养、冻存记录和保存位置信息纸质版归档并统一输入计算机记录。
实施例2
一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于由以下步骤组成：产妇筛查、样本采集、样本检测、样本预处理、分离制备、原代培养、传代、冻存、细胞检测、建立可供检索的细胞信息档案、编码入库并上传细胞信息档案，具体包括以下步骤：
1)产妇筛查：首先对产妇及其丈夫的家族病史及旅居史的情况进行调查，符合供者条件后，取5ml产妇外周血及5ml脐血进行病原微生物检测，包括但不限于乙肝、丙肝、梅毒、艾滋等传染病检测；
2)样本采集：将正常足月分娩健康新生儿胎盘、脐带进行无菌采集；其具体步骤为在距脐带两端2-3cm处结扎，剪下结扎好的脐带置于装有50ml储存液的采集瓶中；将去掉脐带后的胎盘置于装有400-600ml储存液的采集盒中；将采集瓶及/或采集盒置于4℃条件保存，12小时内运送至公司登记相关信息；
3)样本检测：样本接收人员收到样本后检查样本有无异常，将样本交于微生物实验室进行传染病、无菌检测，样本无异常情况下交接给实验室制备人员处理；
4)样本预处理：取出新鲜样本，将样本置于足量生理盐水中洗净残血，用足量75％医用酒精消毒浸泡，再用足量生理盐水漂洗2-3次；取最后一次漂洗液交于微生物实验室进行无菌检测，样本无异常情况下由实验室制备人员继续处理；
5)细胞分离制备：将预处理后的新鲜胎盘胎儿面(光滑面)朝上，以脐带根部为中心划十字切口轻轻剥离羊膜，将剥离得到的羊膜用生理盐水清洗干净，沥干水分，用眼科弯剪剪碎呈肉糜状转移至50ml离心管内，加入含有10倍体积的0.1％的i型胶原酶消化60min后加入5倍体积的生理盐水终止消化，吹打混匀，离心洗涤(离心机升9降9，2100rpm，4℃离心5min)，用生理盐水离心洗涤两次(离心机升9降9，2100rpm，4℃离心5min)；剥离羊膜后，小心分离绒毛膜，将剥离的绒毛膜再次用生理盐水清洗干净，沥干水分，用眼科弯剪剪碎呈肉糜状转移至50ml离心管内，加入含有5倍体积的0.25％的i型胶原酶消化30min后加入10倍体积的生理盐水终止消化，吹打混匀，按照1：1的比例缓慢加入到分装好的淋巴细胞分离液中，离心机升1降1，2000rpm，4℃离心20分钟，取中间白膜层及以上细胞，再用生理盐水离心洗涤两次(离心机升9降9，2000rpm，4℃离心5min)；将预处理后的脐带样本用手术剪剪成小段，再次用生理盐水清洗干净，剥取华通氏胶，用眼科弯剪剪碎呈肉糜状；
6)原代培养：加入3倍体积间充质干细胞原代培养液重悬处理好的组织块或细胞后接种至培养皿中，根据培养液覆盖组织或细胞情况决定是否补充培养液，保证间充质干细胞原代培养液应没过细胞或组织块2mm，摇匀后将培养皿转移至放置37℃，5％co2培养箱中培养，每隔3天观察一次，每隔5-7天根据细胞爬出情况补液或者换液；
7)传代培养：待细胞爬出融合度达到25-40％后进行传代，其步骤为：小心去除培养液，加入适量生理盐水清洗2次，以彻底去除残留的组织块，加入3ml干细胞温和酶消化3min后加入5倍体积生理盐水终止消化；收集细胞悬液1200-rpm离心10min弃上清液，所得细胞沉淀记为p0代细胞；将p0代细胞接种至含20ml无血清完全培养基的150mm培养皿中，放入co2浓度5％，温度37℃培养箱中培养中继续培养，待细胞增殖融合度达到85-95％后按照上述处理步骤进行消化收集得到p1代细胞，即为种子细胞；
8)细胞检测：细胞检测为在细胞入库前对细胞培养上清进行细菌、内毒素、支原体等检测；采用血球计数板对收获的细胞进行计数并利用台盼蓝染色测定细胞活性，同时利用流式细胞仪检测细胞表面标志物。以判定是否符合入库标准；
9)细胞冻存：将收集的细胞取样计数后，1200-1700rpm离心3-15min，弃上清液，根据细胞数目加入干细胞冻存液重悬细胞，混匀后按每管(0.8-1.2)×107cells/ml的细胞密度分装至做好标记的2ml冻存管内，将冻存管装入程序降温盒后置于-80℃保存，12-24h后，转移至液氮中长期储存，即得到种子细胞库；
10)建立可供检索的细胞信息档案、编码入库并上传细胞信息档案为按照每人一组系统编号，并将相关信息包括编码、制备培养冻存记录和保存位置信息纸质版归档并统一输入计算机记录，用于管理和检索。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
1.一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)产妇筛查；
2)样本采集；
3)样本检测；
4)样本预处理；
5)细胞分离制备；
6)原代培养；
7)传代培养；
8)细胞检测；
9)细胞冻存；
10)建立可供检索的细胞信息档案；
11)编码入库并上传细胞信息档案。
2.根据权利要求1所述的一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中产妇筛查为取5ml产妇外周血及5ml脐血进行病原微生物检测。
3.根据权利要求1所述的一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，所述步骤2)中样本采集包括如下步骤：
1)在距脐带两端2-3cm处结扎；
2)剪下结扎好的脐带置于装有30-50ml储存液的采集瓶中；
3)将去掉脐带后的胎盘置于装有400-600ml储存液的采集盒中。
4.根据权利要求1所述的一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中样本预处理包括如下步骤：
1)将样本在生理盐水中洗净残血；
2)用75％医用酒精消毒浸泡；
3)再用生理盐水漂洗2-3次。
5.根据权利要求1所述的一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，所述步骤5)中的细胞分离制备，包括如下步骤：
1)将预处理后的新鲜胎盘胎儿面，光滑面朝上，以脐带根部为中心划十字切口，剥离羊膜；
2)将羊膜用生理盐水清洗干净，沥干水分；
3)用眼科弯剪剪碎呈肉糜状转移至50ml离心管内；加入含有5-20倍体积的0.05％-0.25％的酶消化10-120min后，加入5-10倍体积的生理盐水终止消化，吹打混匀，离心机升9降9，1000-2500rpm，4℃离心3-10min洗涤，去除上清后再用生理盐水离心洗涤两次，离心机升9降9，1000-2500rpm，4℃离心3-10min；
4)剥离羊膜后，分离绒毛膜，将剥离的绒毛膜再次用生理盐水清洗干净，沥干水分；
5)用眼科弯剪剪碎呈肉糜状转移至50ml离心管内；加入含有5-20倍体积的0.05％-0.25％的酶消化10-120min后，加入5-10倍体积的生理盐水终止消化，吹打混匀，按照1：(1-3)的比例加入到分装好的淋巴细胞分离液中，离心机升1降1，1000-2000rpm，4℃离心20分钟，取中间白膜层及以上细胞组织，再用生理盐水离心洗涤两次，离心机升9降9，1000-2500rpm，4℃离心3-10min；
6)将预处理后的脐带样本用手术剪剪成小段，再次用生理盐水清洗干净，剥取华通氏胶，用眼科弯剪剪碎呈肉糜状。
6.根据权利要求1所述的一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，所述步骤6)中原代培养包括如下步骤：
1)用间充质干细胞原代培养液重悬处理好的组织块或细胞后接种至培养皿中，间充质干细胞原代培养液没过细胞或组织块2-5mm；
2)放置37℃，5％co2培养箱中培养，每隔3天观察一次，每隔5-7天根据细胞爬出情况补液或者换液。
7.根据权利要求1所述的一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，所述步骤7)中传代培养，包括如下步骤：
1)去除培养液，加入适量生理盐水清洗1-3次，彻底去除残留的组织块；
2)加入1-5ml干细胞温和酶干细胞温和酶或胰酶室温消化1-5min后，加入5倍体积生理盐水终止消化；
3)收集细胞悬液1200-1700rpm离心3-15min弃上清液，所得细胞沉淀记为p0代细胞；
4)将p0代细胞接种至含20-25ml无血清完全培养基的150mm培养皿中，放入co2浓度5％，温度37℃培养箱中培养中继续培养；
5)待细胞增殖融合度达到85-95％后，按照上述处理步骤进行消化收集得到p1代细胞，即为种子细胞。
8.根据权利要求1所述的一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，所述步骤8)中细胞检测，包括如下步骤：
1)在细胞入库前对细胞培养上清进行细菌、内毒素、支原体检测；
2)采用血球计数板对收获的细胞进行计数并利用台盼蓝染色测定细胞活性，同时利用流式细胞仪检测细胞表面标志物；
3)判定是否符合入库标准。
9.根据权利要求1所述的一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，所述步骤9)中细胞冻存，包括如下步骤：
1)将收集的细胞取样计数后，1200-1700rpm离心3-15min，弃上清液；
2)根据细胞数目加入干细胞冻存液重悬细胞，混匀后按每管0.8-1.2×107cells/ml的细胞密度分装至做好标记的2ml冻存管内；
3)将上述2ml冻存管装入程序降温盒后置于-80℃保存，12-24h后，转移至液氮中长期储存，即得到种子细胞库。
10.根据权利要求1所述的一种围产期间充质干细胞种子库的构建方法，其特征在于，所述步骤10)、步骤11)中建立可供检索的细胞信息档案、编码入库并上传细胞信息档案，包括如下步骤：
1)按照每人一组系统编号；
2)将相关信息包括编码、制备培养冻存记录和保存位置信息纸质版归档并统一输入计算机记录。
技术总结