本发明属于骨髓采集与细胞分离技术领域，具体涉及一种骨髓采集与有核细胞分离的技术。
背景技术：
骨髓中的细胞成分包括造血干细胞，内皮始祖细胞，间充质干细胞等幼稚细胞。造血干细胞是生成各种血细胞的原始细胞，又称多能干细胞。造血干细胞在一定的微环境和某些因素的调节下，增殖分化为各类血细胞的祖细胞，称造血祖细胞，它也是一种相当原始的具有增殖能力的细胞，在骨髓中已失去多向分化能力，只能向一个或几个血细胞系定向增殖分化，故也称定向干细胞。造血干细胞不断分化、发育、成熟后形成具有特定形态，表达特异表面标志物的不同种类，不同功能的血细胞。在血细胞成熟后，会从骨髓中释放，循环到外周血中，发挥其特有的生物学功能，如：红细胞主要负责运输氧气，血小板主要负责凝血，粒细胞和淋巴细胞负责免疫等。血细胞发生是造血干细胞经增殖、分化直至成为各种成熟血细胞的过程。成熟的血细胞包含：红细胞、巨核细胞、巨噬细胞、血小板、粒细胞、t细胞、b细胞和nk细胞等。
有研究用乙肝病毒感染免疫缺陷鼠，做成免疫缺陷鼠肝硬化模型。然后采集人的骨髓干细胞，经免疫缺陷鼠肝硬化模型脾脏穿刺，输注人的骨髓干细胞。人骨髓干细胞经肝硬化模型鼠脾静脉到门静脉进入肝脏，可以改善免疫缺陷鼠肝硬化，说明骨髓干细胞在肝脏微环境中可以转化成肝脏细胞，改善肝脏功能。所以骨髓造血干细胞在骨髓中只能分化成不同的血液细胞，但是移植到不同的器官，在不同的微环境中可以转化成不同的细胞，或者分泌某些细胞因子修复损伤的细胞，恢复器官的功能。
采集骨髓干细胞常用的方法是应用细胞刺激因子等药物，动员骨髓中的干细胞进入外周血液中，然后从外周血液中采集干细胞。这种方法需要每天注射细胞刺激因子5天左右，然后通过专用设备连续分离周围血液中的干细胞，一般至少2小时，而且从外周血液中分离出来的主要是造血干细胞。骨髓中有更原始的干细胞。如果做骨穿采集骨髓，就可以分离出比从外周血中更原始的干细胞。
骨髓中有多种造血干细胞，成熟的白细胞，红细胞，血小板，血浆，脂肪细胞等等多种成分。用骨髓干细胞治疗多种疾病，主要是骨髓中有向多种细胞分化潜能的干细胞发挥作用。例如成熟的红细胞就没有修复损伤细胞的作用，如果把包括骨髓干细胞和大量成熟红细胞的骨髓注射到膝关节腔，没有修复作用的红细胞可能引起膝关节肿胀以及炎症反应。所以做骨髓干细胞移植治疗多种器官疾病，需要把干细胞分离出来，将干细胞移植到靶器官发挥作用。目前用于分离骨髓干细胞的方法是在骨髓中加入淋巴细胞分离液，用离心机做密度梯度离心，因为成熟红细胞与干细胞比重不一样，淋巴细胞分离液的比重介于成熟红细胞和干细胞的比重之间，经过离心机的离心之后，可以把干细胞和成熟红细胞分开。
干细胞都是有核细胞，一般越是原始的细胞，细胞核与细胞浆的比值越大。成熟红细胞和血小板没有细胞核，骨髓中还有少量脂肪细胞或者脂肪滴，脂肪最轻，离心以后骨髓分层，脂肪滴在离心管的最上方，然后是骨髓血浆。成熟红细胞比重最高，沉积在离心管的最底层。淋巴细胞分离液和有核细胞在红细胞与骨髓血浆之间的分层。
由于淋巴细胞分离液对修复细胞损伤没有任何作用，还有些副作用。所以需要先将淋巴细胞分离液与有核细胞一起分离出来，然后再做离心把淋巴细胞分离液去除。最后得到纯度比较高的有核细胞。但缺点是骨髓血浆和红细胞不能用了，因为淋巴细胞分离液可能对人体有一些副作用，分离出有核细胞以后其它骨髓成分就需要丢弃，包括骨髓血浆和红细胞。
综上所述，为了解决上述的问题，为此我们提出一种骨髓采集与有核细胞分离的技术。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种骨髓采集与有核细胞分离的技术，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种骨髓采集与有核细胞分离的技术，包括以下步骤：
s1.取20毫升注射器，抽取20毫升生理盐水，然后加入2400单位的肝素，得肝素生理盐水；
s2.对髂前上脊局部进行麻醉，采用多孔骨髓采集装置，开始对骨髓采集；
s3.从髂前上脊一个穿刺点采集骨髓100毫升，并采集至s1中的注射器内，得加有抗凝生理盐水的骨髓；
s4.将s3中得到的加有抗凝生理盐水的骨髓分装到离心管中，上离心机做密度梯度离心，对骨髓进行分层，分出最上层的为脂肪层，然后是血浆层，再次是白膜层，最下层是红细胞；
s5.在s4处理后，将离心管最上层的脂肪滴吸走丢弃；
s6.把骨髓血浆层吸出放入另一组试管内；
s7.把白膜层吸出放置另外的无菌试管中；
s8.把骨髓血浆和骨髓红细胞混合注入空白输血袋中；
s9.将白膜层用流式细胞仪检测或者用5分类血细胞检测仪检测粒细胞数量，单核细胞百分比；
s10.根据临床需要，将骨髓白膜层的有核细胞移植到有细胞损伤的器官。
优选的，所述s1中取20毫升注射器，在20毫升注射器中预充生理盐水2毫升。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明通过采用多孔骨髓采集装置，在局部麻醉的情况下采集骨髓，而且在采集的同样体积的骨髓的情况下，因为采集骨髓时增大了骨穿针孔与骨小梁的暴露面积，使骨小梁血窦中更多的干细胞被负压吸入注射器中，所以比常规的骨穿针采集的干细胞明显增多，同时这种方法采集的骨髓含有比从外周血液中采集的骨髓干细胞更原始，有更好的转化成其它种类细胞的能力。
(2)本发明通过在注射器中加入生理盐水和肝素，获得抗凝生理盐水，从而在骨髓采集时具有良好的防止骨髓凝血的作用。
(3)本发明中得到的白膜层的细胞能够用于不同器官损伤的治疗，同时能够把骨髓血浆和骨髓红细胞经外周静脉回输给患者，这样采集的骨髓几乎都能回到患者体内，另外分离出的骨髓有核细胞你能够用于不同器官的细胞移植治疗不同的疾病。
附图说明
图1为本发明的流程框图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种骨髓采集与有核细胞分离的技术，包括以下步骤：
s1.取20毫升注射器，抽取20毫升生理盐水，然后加入2400单位的肝素，得肝素生理盐水；
s2.对髂前上脊局部进行麻醉，采用多孔骨髓采集装置，开始对骨髓采集；
s3.从髂前上脊一个穿刺点采集骨髓100毫升，并采集至s1中的注射器内，得加有抗凝生理盐水的骨髓；
s4.将s3中得到的加有抗凝生理盐水的骨髓分装到离心管中，上离心机做密度梯度离心，对骨髓进行分层，分出最上层的为脂肪层，然后是血浆层，再次是白膜层，最下层是红细胞；
s5.在s4处理后，将离心管最上层的脂肪滴吸走丢弃；
s6.把骨髓血浆层吸出放入另一组试管内；
s7.把白膜层吸出放置另外的无菌试管中；
s8.把骨髓血浆和骨髓红细胞混合注入空白输血袋中；
s9.将白膜层用流式细胞仪检测或者用5分类血细胞检测仪检测粒细胞数量，单核细胞百分比；
s10.根据临床需要，将骨髓白膜层的有核细胞移植到有细胞损伤的器官。
本实施例中，优选的，所述s1中取20毫升注射器，在20毫升注射器中预充生理盐水2毫升。
实施例2
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种骨髓采集与有核细胞分离的技术，包括以下步骤：
s1.取20毫升注射器，抽取20毫升生理盐水，然后加入2400单位的肝素，得肝素生理盐水；
s2.对髂前上脊局部进行麻醉，采用多孔骨髓采集装置，开始对骨髓采集；
s3.从髂前上脊一个穿刺点采集骨髓100毫升，并采集至s1中的注射器内，得加有抗凝生理盐水的骨髓；
s4.将s3中得到的加有抗凝生理盐水的骨髓分装到离心管中，上离心机做密度梯度离心，对骨髓进行分层，分出最上层的为脂肪层，然后是血浆层，再次是白膜层，最下层是红细胞；
s5.在s4处理后，将离心管最上层的脂肪滴吸走丢弃；
s6.把骨髓血浆层吸出放入另一组试管内；
s7.把白膜层吸出放置另外的无菌试管中；
s8.把骨髓血浆和骨髓红细胞混合注入空白输血袋中；
s9.将白膜层用流式细胞仪检测或者用5分类血细胞检测仪检测粒细胞数量，单核细胞百分比；
s10.根据临床需要，将骨髓白膜层的有核细胞移植到有细胞损伤的器官。
本发明的工作原理及优点：
(1)本发明通过采用多孔骨髓采集装置，在局部麻醉的情况下采集骨髓，而且在采集的同样体积的骨髓的情况下，因为采集骨髓时增大了骨穿针孔与骨小梁的暴露面积，使骨小梁血窦中更多的干细胞被负压吸入注射器中，所以比常规的骨穿针采集的干细胞明显增多，同时这种方法采集的骨髓含有比从外周血液中采集的骨髓干细胞更原始，有更好的转化成其它种类细胞的能力。
(2)本发明通过在注射器中加入生理盐水和肝素，获得抗凝生理盐水，从而在骨髓采集时具有良好的防止骨髓凝血的作用。
(3)本发明中得到的白膜层的细胞能够用于不同器官损伤的治疗，同时能够把骨髓血浆和骨髓红细胞经外周静脉回输给患者，这样采集的骨髓几乎都能回到患者体内，另外分离出的骨髓有核细胞你能够用于不同器官的细胞移植治疗不同的疾病。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
1.一种骨髓采集与有核细胞分离的技术，其特征在于：包括以下步骤：
s1.取20毫升注射器，抽取20毫升生理盐水，然后加入2400单位的肝素，得肝素生理盐水；
s2.对髂前上脊局部进行麻醉，采用多孔骨髓采集装置，开始对骨髓采集；
s3.从髂前上脊一个穿刺点采集骨髓100毫升，并采集至s1中的注射器内，得加有抗凝生理盐水的骨髓；
s4.将s3中得到的加有抗凝生理盐水的骨髓分装到离心管中，上离心机做密度梯度离心，对骨髓进行分层，分出最上层的为脂肪层，然后是血浆层，再次是白膜层，最下层是红细胞；
s5.在s4处理后，将离心管最上层的脂肪滴吸走丢弃；
s6.把骨髓血浆层吸出放入另一组试管内；
s7.把白膜层吸出放置另外的无菌试管中；
s8.把骨髓血浆和骨髓红细胞混合注入空白输血袋中；
s9.将白膜层用流式细胞仪检测或者用5分类血细胞检测仪检测粒细胞数量，单核细胞百分比；
s10.根据临床需要，将骨髓白膜层的有核细胞移植到有细胞损伤的器官。
2.根据权利要求1所述的一种骨髓采集与有核细胞分离的技术，其特征在于：所述s1中取20毫升注射器，在20毫升注射器中预充生理盐水2毫升。
技术总结