本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养基及培养方法。
背景技术：
：干细胞是一类原始且未特化的多潜能细胞，具有自我复制的能力。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。脂肪间充质干细胞是干细胞中的一种重要类型，脂肪间充质干细胞通过分泌各种细胞因子对周围临近细胞产生作用，从而产生功效。脂肪间充质干细胞可分泌多种细胞因子，如成纤维细胞生长因子（fgf）、表皮生长因子（egf）、转化生长因子β1（tgf-β1）、血小板衍生生长因子（pdgf）和血管内皮生长因子（vegf）等。通过培养人脂肪来源的间充质干细胞，收集、提取及浓缩其分泌的生物活性因子，制成人脂肪间充质干细胞提取物产品，主要应用于促进伤口愈合及疤痕修复功能的药物中，普通方法培养干细胞分泌细胞因子的效率较低，最终得到的细胞因子产品中细胞因子的浓度也低，不能很好的发挥作用，影响产品的应用。还有一些脂肪干细胞因子产品是通过直接裂解干细胞获得，蛋白成分复杂，虽然浓度高，但无效蛋白多，对人体也是代谢压力。因此，要保证临床应用的安全性，并且提高产品中细胞因子的含量，需要改进现有针对脂肪间充质干细胞进行细胞因子诱导培养的培养基及培养过程，有助于开发适合临床应用及规模性产业化生产的脂肪间充质干细胞复合因子产品。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养基，无需低氧环境的刺激，有效促进脂肪间充质干细胞分泌细胞因子，提高细胞分泌物中细胞因子的含量。本发明的目的之二在于提供一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养方法。本发明的目的之一采用如下技术方案实现：一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养基，包括基础培养基，添加在基础培养基中的玉米素、转铁蛋白、咖啡因、海藻酸钠。进一步地，以培养基终浓度计，各组分的用量为：玉米素18.4-24.7mg/ml、转铁蛋白9.5-13.0mg/ml、咖啡因40.5-47.2μg/ml、海藻酸钠50.0-54.5μg/ml。进一步地，以培养基终浓度计，各组分的用量为：玉米素22.5mg/ml、转铁蛋白11.8mg/ml、咖啡因44.5μg/ml、海藻酸钠52.7μg/ml。进一步地，所述基础培养基为dmem/f12培养基。进一步地，所述基础培养基中dmem和f12的体积比为1:1。本发明的目的之二采用如下技术方案实现：一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养方法，包括以下步骤：取传代培养的脂肪间充质干细胞接种于上述的培养基中进行诱导培养。进一步地，所述诱导培养基中脂肪间充质干细胞的接种密度为1-2×105个/ml。进一步地，诱导培养过程在37℃，5%co2的条件下进行。进一步地，所述脂肪间充质干细胞为传代培养至p3-p5代的细胞。相比现有技术，本发明的有益效果在于：1、本发明提供一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养基，通过在基础培养基中添加玉米素、转铁蛋白、咖啡因、海藻酸钠，各组分协同作用，在脂肪间充质干细胞的诱导培养过程中能有效促进细胞因子的分泌，提高分离得到的分泌物中细胞因子的含量，进而提高脂肪间充质干细胞因子产品中有效成分的含量。采用本发明的诱导培养基，在诱导过程中，无需低氧环境刺激，操作简便，为脂肪间充质干细胞因子产品在创伤修复等领域的应用提供保障。2、本发明还提供了一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养方法，采用本发明的诱导培养基，以传代培养的脂肪间充质干细胞为诱导对象，整个过程易于操作，节约成本，便于商业化的生产各种细胞因子产品。具体实施方式下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。本发明实施例1至3中所用的传代培养的脐带间充质干细胞通过以下方法制备得到：（1）取健康捐赠者的脂肪组织，向收集的脂肪组织中加入生理盐水，清洗脂肪组织，静置分层后，吸出下层液体，重复此过程，清洗三次；（2）将脂肪组织剪成约1-2mm3大小的碎块，均匀铺在100mm2培养皿底部，每个培养皿中加入8ml无血清的lonza脂肪培养基，在37℃，5%co2培养箱中培养，培养过程中，每3天更换一次培养基；（3）用倒置显微镜观察细胞生长情况，当观察到细胞汇合度达到60%时，吸出上清液和脂肪组织，加入0.25%胰酶消化；（4）向消化后的细胞中加入4ml培养基，转移至离心管中进行离心，弃上清后加入8ml培养基进行重悬，作为p0代细胞进行传代培养，传代培养的细胞浓度为2×104个/ml，比例为1:4。实施例1一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养基，由基础培养基dmem/f12（dmem和f12的体积比为1:1），添加在基础培养基中的玉米素、转铁蛋白、咖啡因、海藻酸钠组成，以培养基终浓度计，各组分的用量为：玉米素22.5mg/ml、转铁蛋白11.8mg/ml、咖啡因44.5μg/ml、海藻酸钠52.7μg/ml。一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养方法，包括以下步骤：取传代培养至p3代的脂肪间充质干细胞培养至细胞生长密度40%后弃去原培养基，用pbs清洗后，将细胞接种于t75培养瓶中的上述诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养基中，细胞的接种密度为1.5×105个/ml，在37℃，5%co2的培养箱中进行诱导培养，连续培养3天。实施例2一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养基，由基础培养基dmem/f12（dmem和f12的体积比为1:1），添加在基础培养基中的玉米素、转铁蛋白、咖啡因、海藻酸钠组成，以培养基终浓度计，各组分的用量为：玉米素18.4mg/ml、转铁蛋白9.5mg/ml、咖啡因40.5μg/ml、海藻酸钠50.0μg/ml。一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养方法，包括以下步骤：取传代培养至p4代的脂肪间充质干细胞培养至细胞生长密度45%后弃去原培养基，用pbs清洗后，将细胞接种于t75培养瓶中的上述诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养基中，细胞的接种密度为1×105个/ml，在37℃，5%co2的培养箱中进行诱导培养，连续培养2天。实施例3一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养基，由基础培养基dmem/f12（dmem和f12的体积比为1:1），添加在基础培养基中的玉米素、转铁蛋白、咖啡因、海藻酸钠组成，以培养基终浓度计，各组分的用量为：玉米素24.7mg/ml、转铁蛋白13.0mg/ml、咖啡因47.2μg/ml、海藻酸钠54.5μg/ml。一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养方法，包括以下步骤：取传代培养至p5代的脂肪间充质干细胞培养至细胞生长密度50%后弃去原培养基，用pbs清洗后，将细胞接种于t75培养瓶中的上述诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养基中，细胞的接种密度为2×105个/ml，在37℃，5%co2的培养箱中进行诱导培养，培养3天。对比例1对比例1提供一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养基，和实施例1的区别为：省去玉米素，其余均和实施例1相同。对比例2对比例2提供一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养基，和实施例1的区别为：省去转铁蛋白，其余均和实施例1相同。对比例3对比例3提供一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养基，和实施例1的区别为：省去咖啡因，其余均和实施例1相同。对比例4对比例4提供一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养基，和实施例1的区别为：省去海藻酸钠，其余均和实施例1相同。对比例5对比例5提供一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养基，和实施例1的区别为：省去玉米素、转铁蛋白、咖啡因、海藻酸钠，其余均和实施例1相同。取实施例1至3，对比例1至5细胞诱导培养后的上清液，1000rpm离心5min，离心后收集上清液，然后通过30kd的超滤膜进行透析，取透析液再通过90d的超滤膜，收集截留液，将截留液经0.22μm滤膜过滤除菌后冻干，即得脂肪间充质干细胞因子产品。用elisa试剂盒对脂肪间充质干细胞因子产品中的成纤维细胞生长因子（fgf）、表皮生长因子（egf）、转化生长因子β1（tgf-β1）、血小板衍生生长因子（pdgf）和血管内皮生长因子（vegf）进行检测，结果如表1所示。表1样品fgf（ng/ml）egf（ng/ml）tgf-β1（ng/ml）pdgf（ng/ml）vegf（ng/ml）实施例1172.2567.3245.2551.4981.79实施例2165.7463.1940.9445.2677.32实施例3169.1765.6443.8648.5479.09对比例172.3435.4623.1628.4957.96对比例285.7940.7530.0533.7261.57对比例381.1838.1227.6730.0460.01对比例497.8745.7433.1738.1965.35对比例552.1719.2112.8420.3135.42由表1可以看出，在对各组得到的主要细胞因子进行检测后，和对比例1至5相比，实施例1至3中最终得到的各种脂肪间充质干细胞因子的含量较高。对比例1至5中分别省去了玉米素、转铁蛋白、咖啡因、海藻酸钠中的一种或多种，制备的诱导培养基在用于脂肪间充质干细胞的诱导培养后，细胞因子的含量均有不同程度的降低，说明本发明通过在基础培养基中添加玉米素、转铁蛋白、咖啡因、海藻酸钠各组分协同作用，有助于促进脂肪间充质干细胞分泌细胞因子，无需经过低氧刺激即能提高最终得到的脂肪间充质干细胞因子产品中各细胞因子的含量，为脂肪间充质干细胞因子产品在创伤修复等领域的应用提供保障。上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养基，其特征在于，包括基础培养基，添加在基础培养基中的玉米素、转铁蛋白、咖啡因、海藻酸钠。
2.根据权利要求1所述一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养基，其特征在于，以培养基终浓度计，各组分的用量为：玉米素18.4-24.7mg/ml、转铁蛋白9.5-13.0mg/ml、咖啡因40.5-47.2μg/ml、海藻酸钠50.0-54.5μg/ml。
3.根据权利要求1所述一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养基，其特征在于，以培养基终浓度计，各组分的用量为：玉米素22.5mg/ml、转铁蛋白11.8mg/ml、咖啡因44.5μg/ml、海藻酸钠52.7μg/ml。
4.根据权利要求1所述一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养基，其特征在于，所述基础培养基为dmem/f12培养基。
5.根据权利要求1所述一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养基，其特征在于，所述基础培养基中dmem和f12的体积比为1:1。
6.一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：取传代培养的脂肪间充质干细胞接种于权利要求1至5任一项所述的培养基中进行诱导培养。
7.根据权利要求6所述诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养方法，其特征在于，所述培养基中脂肪间充质干细胞的接种密度为1-2×105个/ml。
8.根据权利要求6所述诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养方法，其特征在于，诱导培养过程在37℃，5%co2的条件下进行。
9.根据权利要求6所述诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养方法，其特征在于，所述脂肪间充质干细胞为传代培养至p3-p5代的细胞。
技术总结本发明公开了一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养基，包括基础培养基，添加在基础培养基中的玉米素、转铁蛋白、咖啡因、海藻酸钠。上述各组分协同作用，在脂肪间充质干细胞的诱导培养过程中能有效促进细胞因子的分泌，提高分离得到的分泌物中细胞因子的含量，进而提高脂肪间充质干细胞因子产品中有效成分的含量。本发明的诱导培养基在诱导过程中，无需低氧环境刺激，操作简便，为脂肪间充质干细胞因子产品在创伤修复等领域的应用提供保障。本发明还提供了一种诱导脂肪间充质干细胞因子分泌的培养方法，采用本发明的诱导培养基，以传代培养的脂肪间充质干细胞为诱导对象，整个过程易于操作，节约成本，便于商业化的生产各种细胞因子产品。
技术研发人员：石小莉;李坤彬
受保护的技术使用者：郑州佐爵生物科技有限公司
技术研发日：2020.12.16
技术公布日：2021.03.12
