本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种淋巴细胞分离液及其制备方法。
背景技术：
细胞分离介质是与细胞接触时间最久的物质。在标准分离过程中，细胞必须与分离液最少接触15分钟以上，以达到分离效果。在此过程中，分离液中的各成分可能会通过被动扩散、待分离细胞的主动运输、胞吞/胞饮作用、表面黏附等途径，附着在细胞表面或在其内部蓄积，很难通过常规洗涤从分离得到的目标细胞中完全去除，因此，对细胞分离介质有更高的安全性要求。
目前市面上的存在很多淋巴细胞分离液产品，但其适用的范围各不相同。用于涂片或诊断的分离液，并不需要进行后继的培养工作；若要将分离出来的淋巴细胞进行药物试验，那么需要进行体外培养；如果分离的淋巴干细胞培养后再应用于回输人体的后继治疗，那么对其安全性要求更高。目前商品化的淋巴细胞分离液其主要成分包括：葡聚糖(dextran)、羟乙基淀粉、泛影酸钠。这些成分具有一定毒性。常用的ficoll分离液根据化学安全说明书数据显示，慢毒试验中，表现出一定毒性，包括恶心、呕吐、昏迷等。此外，在向保存液中加入ficoll分离液后，在保存液与样本密度分离液分层处的未被保存液完全裂解的红细胞会与聚蔗糖接触而凝集成串钱状而沉积于管底与下沉的淋巴细胞混合，影响后续对细胞的培养。羟乙基淀粉为一种复方制剂，长期大剂量使用，患者出现皮肤瘙痒，肝脏疾病和凝血功能紊乱患者应慎重使用。
内毒素也是衡量细胞分离液的一个重要指标，内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖；只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来。内毒素并非蛋白质，因此非常耐热，不易去除。脂多糖对宿主是有毒性的，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等症状，故对培养细胞/反输人体的细胞中应用的分离液的内毒素有相当严格的要求。
因此，寻求一种安全性高的淋巴细胞分离液成为本领域技术人员亟待解决的问题。
技术实现要素：
本项发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种样本密度分离液，使用本发明的分离液加入到细胞保存液后，能使分离出来的细胞安全、更具有活性。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案实现：
一种淋巴细胞分离液，包括以下组分：甘油、乙醇、氯化钠、茶皂素和水。本发明的淋巴细胞分离液低毒性，未曾使用具有一定毒性的葡聚糖(dextran)、羟乙基淀粉，而是采用了无毒的甘油、乙醇、氯化钠、茶皂素作为其原料。
本发明之所以选择甘油，是因为其对细胞的无毒性，及其在样本密度分离液混合体系中可使细胞冰点降低，维持细胞的正常形态，减少细胞死亡；通过将甘油溶解在乙醇水溶液后做为分离细胞的介质，可在保证样本密度分离液有较好密度梯度的同时减轻样品密度分离液的粘度，能有效加快细胞的下沉速度，从而在更短时间内收集到等量的细胞；同时混合体系中的甘油不会使红细胞发生聚集沉淀，能有效去除杂质，特别是红细胞的干扰。
本发明之所以选择茶皂素，是因为茶皂素可确保即使有红细胞下降到了样品密度分离液中也会与其发生溶血反应而使细胞破碎，红细胞破碎成细胞碎片后无法继续下降。茶皂素的加入确保最终自然下沉到试管底部的细胞不含红细胞
本发明之所以选择乙醇，是因为乙醇提高了分离液中细胞的通透性，再结合混合体系中用于调节渗透压的氯化钠溶液可加快分离液中细胞失水速度，从而增大诊断学意义细胞的有效密度，使其在样本密度分离液中快速自然下降至试管底部。
作为本发明的优选实施方式，所述淋巴细胞分离液包括以下质量百分比的组分：甘油5～15％、乙醇1～10％、氯化钠1～5％、茶皂素0.1～0.5％，去离子水余量，总量为100％。本发明中使用质量百分比为1～5％的氯化钠能使分离液具有较高的渗透压，可使样品中细胞失水而缩小；质量百分比为1～10％的乙醇溶液中乙醇可提高细胞膜的通透性，故可增快细胞失水的速度，从而增大样本密度分离液中细胞的有效密度，确保在较短的制片时间内就能增大细胞的有效密度，加快细胞的自然下沉；质量百分比为0.1～0.5％的茶皂素能对人的红细胞有破坏作用，使红细胞产生溶血现象，但又不会破坏其它有核细胞，即使有红细胞下降至样品密度分离液中，也会因为茶皂素的存在而发生溶血反应，变成细胞碎片从而密度减轻不会下降至试管底部与有诊断意义的细胞混合；质量百分比为5～15％的甘油可使得整个混合体系处于最佳的密度梯度，从而保证诊断病理学细胞能沉入到试管底部。
作为本发明的优选实施方式，所述淋巴细胞分离液包括以下质量百分比的组分：甘油6～10％、乙醇2～5％、氯化钠3～5％、茶皂素0.16～0.3％，余量为去离子水，总量为100％。
作为本发明的优选实施方式，所述淋巴细胞分离液包括以下质量百分比的组分：甘油8.3％、乙醇3％、氯化钠4.5％、茶皂素0.16％，余量为去离子水，总量为100％。
本发明还提供了一种淋巴分离液的制备方法，包括以下步骤：
s1将配方量的乙醇、氯化钠、茶皂素和双蒸水混合，搅拌溶解，得到澄清溶液；
s2在18℃-22℃下，将甘油加至所述步骤s1生物澄清溶液中，搅拌均匀，即得本发明所述的淋巴分离液。
作为本发明的优选实施方式，所述乙醇的质量百分比为1～10％，氯化钠的质量百分比为1～5％，茶皂素的质量百分比为0.1～0.5％，甘油的质量百分比为5～15％。
作为本发明的优选实施方式，所述乙醇的质量百分比为2～5％，氯化钠的质量百分比为3～5％，茶皂素的质量百分比为0.16～0.3％，甘油的质量百分比为6～10％。
作为本发明的优选实施方式，所述乙醇的质量百分比为3％，氯化钠的质量百分比为4.5％，茶皂素的质量百分比为0.16％，甘油的质量百分比为8.3％。
本发明的有益效果为：本发明结合了氯化钠、乙醇、茶皂素和甘油对细胞的作用，选用了适当的质量浓度，使得本发明的分离液能高效的分离淋巴细胞，获得高质量的淋巴细胞。
附图说明
图1为淋巴细胞分离液产品分离临床人骨髓淋巴干细胞的高倍显微镜图。
图2为淋巴细胞分离液产品分离临床人骨髓淋巴干细胞的低倍显微镜图。图为应用本发明分离的骨髓淋巴细胞，培养21d后的低倍光学显微镜图。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案。
实施例1～5与对比例1～4的淋巴分离液的组分如表1所示：
表1：实施例1～5与对比例1～4的淋巴分离液组分
对比例5：focill淋巴细胞分离液
对比例6：percoll淋巴细胞分离液
实施例6
本实施例提供一种淋巴分离液的制备方法，包括以下步骤：
s1将配方量的乙醇、氯化钠、茶皂素和双蒸水混合，搅拌溶解，得到澄清溶液；
s2在18℃-22℃下，将甘油加至所述步骤s1生物澄清溶液中，搅拌均匀，即得本发明所述的淋巴分离液；
s3将上述淋巴分离液经滤芯过滤，灌装，形成成品。
将实施例1～5和对比例1～4的分离液进行效果验证：
1、实施例1～5的淋巴分离液产品性能自测报告，如表2所示：
表2：淋巴分离液产品性能自测报告
2、用实施例1～5与对比例1～4的淋巴分离液分离骨髓淋巴干细胞，具体操作如下：
全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。
前处理：制备骨髓单细胞悬液1ml
(1)取一支离心管，加入与骨髓单细胞悬液等量的分离液
(2)用吸管小心吸取骨髓单细胞悬液加于分离液液面上，600g，离心20-30min。
(3)离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色目的细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。
(4)用吸管小心吸取第二层环状乳白色目的细胞层到另一15ml离心管中，向离心管中加入5ml洗涤液，混匀细胞。
(5)600g，离心10min。
(6)弃上清。
(7)用吸管以5ml洗涤液重悬所得细胞。
(8)600g，离心10min。
(9)(可选)视情况重复7、8、9
(10)弃上清后以0.5ml以dmem细胞培养液重悬细胞，进入后继培养操作。
实施例1～5与对比例1～4的淋巴分离液，分离效果如表3所示：
表3：实施例1～5与对比例1～6的淋巴分离液分离结果
由表3可以看出，由于对比例1～4中均缺少本发明中的其中一种组分，因此对比例获得的淋巴细胞的质量较低，且由于对比例1、3分别不含有甘油或不含氯化钠，无法达到分离淋巴细胞的效果，因此，对比例1、3的结果为零；而本实施例1～5的分离液获得的淋巴细胞质量显著性改善，细胞纯度均达到97％以上，获得了高质量的淋巴细胞。可见本发明的分离液中的组分之间有一定的相互作用，产生了协同增效的效应。同时，与其它类型的淋巴细胞分离液(对比例5、6)相比，本发明的分离液获得的分离的细胞总数较多，且细胞存活率高达99.6％。可见，本发明的淋巴细胞分离能够高效的分离淋巴细胞，使得分离的淋巴细胞存活率可高达99.6％。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
1.一种淋巴细胞分离液，其特征在于，所述分离液包括以下组分：甘油、乙醇、氯化钠、茶皂素和水。
2.如权利要求1所述的淋巴细胞分离液，其特征在于，包括以下质量百分比的组分：甘油5～15％、乙醇1～10％、氯化钠1～5％、茶皂素0.1～0.5％，去离子水余量，总量为100％。
3.如权利要求2所述的淋巴细胞分离液，其特征在于，所述淋巴细胞分离液包括以下质量百分比的组分：甘油6～10％、乙醇2～5％、氯化钠3～5％、茶皂素0.16～0.3％，余量为去离子水，总量为100％。
4.如权利要求3所述的淋巴细胞分离液，其特征在于，所述淋巴细胞分离液包括以下质量百分比的组分：甘油8.3％、乙醇3％、氯化钠4.5％、茶皂素0.16％，余量为去离子水，总量为100％。
5.一种淋巴分离液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1将配方量的乙醇、氯化钠、茶皂素和双蒸水混合，搅拌溶解，得到澄清溶液；
s2在18℃-22℃下，将甘油加至所述步骤s1生物澄清溶液中，搅拌均匀，即得本发明所述的淋巴分离液。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇的质量百分比为1～10％，氯化钠的质量百分比为1～5％，茶皂素的质量百分比为0.1～0.5％，甘油的质量百分比为5～15％。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇的质量百分比为2～5％，氯化钠的质量百分比为3～5％，茶皂素的质量百分比为0.16～0.3％，甘油的质量百分比为6～10％。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇的质量百分比为3％，氯化钠的质量百分比为4.5％，茶皂素的质量百分比为0.16％，甘油的质量百分比为8.3％。
技术总结