本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法。
背景技术：
目前对于大脑发育和疾病发展的相关研究一般以动物实验为主，但是人类大脑发育结构和功能较其他哺乳动物和脊椎动物而言更复杂，参与的基因组跨度更大，因此通过研究其他动物的脑部发育特征，对人脑疾病的发病机制研究和治疗而言具有比较大的局限性。肿瘤是我国的重大公共卫生问题之一。例如恶性程度最高的脑肿瘤胶质母细胞瘤属whoiv级，占脑部肿瘤发病率50％以上，中位生存期仅15个月。临床上已有的治疗方法，无论是手术，放疗，化疗，还是靶向药物，对该疾病疗效都非常有限。在精准医学的大背景下，肿瘤免疫治疗已取得突破性进展，靶向抗体药和免疫疗法的临床应用，彻底颠覆了恶性肿瘤的治疗理念。恶性肿瘤的精准医学离不开两大关键性技术的突破：一是高通量测序发现肿瘤相关突变，寻找药物靶点；二是临床前实验动物模型。高通量测序已广泛用于精准医学研究，包括筛选有关癌症治疗的药物靶点。胶质母细胞瘤是第一个能够应用精准医学的疾病，也是应用最好的，这得益于胶质瘤里面特殊的明确的基因突变。然而，大规模基因组表达谱分析在靶向治疗疗效预测方面的作用却十分有限，加之缺乏理想的临床前药物研究的实验动物模型，以至于严重阻碍了个性化医疗的发展。
类器官三维结构体外模型，来源于三种细胞类型：体细胞，成体干细胞和多能干细胞。其中，体细胞来源的类器官培养过程中存在较多局限性，因此主要采用两种干细胞作为类器官的来源。相对于传统二维细胞培养方法，类器官模型与人体器官同源，拥有高度相似的组织学特征，能够更好的模拟人体器官的细胞结构和行为，同时长期培养仍然能保持基因表达的稳定性。
类器官在实际使用过程中仍面临诸多挑战，构建类器官模型最主要的困难是确定患者来源肿瘤细胞体外培养所需的营养成分、生长因子和组织培养技术，不同类型的类器官所需条件存在很大的差异。目前，还未有完全的关于获取人体脑部组织，成功诱导多能干细胞在体外形成类器官及扩大培养的方法，脑部类器官的构建帮助我们更好的理解脑部组织器官发育过程，为临床治疗脑部疾病提供一种工具。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法，达到培养脑部类器官快速、简单、方便的目的。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法，所述方法包括如下步骤：
步骤1：获取脑部组织；
步骤2：培养所述脑部组织来获取脑部干细胞，具体的说，所述脑部组织进行拟胚体制备、胚层分化得到所述脑部干细胞；
步骤3：对所述脑部干细胞进行诱导，形成原始上皮组织，所述原始上皮组织为神经上皮组织，将所述神经上皮组织进行培养获取神经上皮细胞；
步骤4：将所述神经上皮细胞转移至基质胶混合并进行培养获取脑部类器官；
步骤5：将所述脑部类器官进行扩大培养；
步骤6：将所述脑部类器官进行冻存建库及复苏。
优选地，所述脑部组织为活跃度较高的脑部肿瘤组织，且在低温条件下进行运输。
优选地，在所述拟胚体制备之前，所述脑部组织中加入细胞消化酶后获取脑部细胞于六孔板内，所述所述拟胚体的制备过程具体包括：
首先，所述六孔板内加入advantagedmemf-12培养基与所述脑部细胞混合，并置于二氧化碳培养箱中培养，培养后去除所述advantagedmemf-12并用缓冲液溶液清洗残留培养基；
其次,在所述六孔板内加入蛋白水解酶并置于所述二氧化碳培养箱中培养，培养后去除所述蛋白水解酶并加入低bfgf-hesc培养基后得到脑部干细胞；
最后，在所述脑部干细胞溶液中加入含rock抑制剂的低bfgf-hesc培养基重新培养，将所述脑部干细胞转移至96孔u形底板并置于所述二氧化碳培养箱中培养。
优选地，所述胚层分化的具体过程包括：
首先,更换所述96孔u形底板中的所述含rock抑制剂的低bfgf-hesc培养基，并用体视显微镜测量所述脑部干细胞直径，
其次，当所述脑部干细胞的直径大于350μm，将所述96孔u形底板中的所述含rock抑制剂的低bfgf-hesc培养基更换为不含rock抑制剂的低bfgf-hesc培养基进行培养所述脑部干细胞，直到所述脑部干细胞的直径大于500μm。
优选地，关于步骤3，获取所述神经上皮细胞具体包括：将直径大于500μm的所述脑部干细胞转移至24孔板内，并添加神经诱导培养基进行培养，之后去除所述神经诱导培养基，提取所述神经上皮细胞。
优选地，关于步骤4，获取所述脑部类器官具体过程包括：
首先，选取封口膜，将所述封口膜剪成正方形，按入形成凹槽，所述正方形封口膜置于培养皿中；
其次，将所述神经上皮细胞与所述基质胶混合后置于所述凹槽内进行包埋，并在所述二氧化碳培养箱中进行培养；
最后，在所述培养皿中加入脑类器官分化培养基，并置于所述二氧化碳培养箱中进行培养。
优选地，关于步骤5，所述脑部类器官扩大培养具体步骤包括：
首先，将所述培养皿中的所述脑部类器官转移至旋转生物反应器中；
其次，在所述旋转生物反应器中加入所述脑类器官分化培养基；
最后，将所述旋转生物反应器安装于所述二氧化碳培养箱中进行培养。
进一步说明，所述旋转生物反应器在安装于所述二氧化碳培养箱之前需使用酒精喷洒擦拭后，且所述旋转生物反应器安装于搅拌板上。
优选地，所述脑部类器官进行冻存具体包括：
首先，收集单个脑部细胞类器官，加入细胞冻存液进行重悬后放入冻存管中；
其次，将所述冻存管安装于所述程序降温盒中，进行冷冻；
最后，将所述冻存管至于液氮中。
优选地，所述脑部类器官复苏具体步骤包括：提取所述液氮中的所述冻存管并置于水浴箱中；收集所述单个脑部细胞类器官，进行包埋，加入脑类器官分化培养基后置于所述二氧化碳培养箱中培养。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
本发明通过手术获取少量肿瘤组织，体外创造适合脑部细胞生长的微环境，诱导定向分化成大脑器官不同类型细胞，该方法培养的大脑类器官可长期培养和扩大培养，可用作恶性肿瘤的临床前模型，实现高通量的药物筛选。
本发明同时培养出的大脑类器官可以冻存和复苏，实现长期保存，可用于建立脑部类器官样本库。
本发明培养方法能够以简单的方案获取所需要的类器官，培养速度快。
附图说明
图1为本发明一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法的细胞类器官培养五天的示意图；
图2为本发明一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法的细胞类器官培养十四天的示意图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。在下面的描述中，提供诸如具体的配置和组件的特征细节仅仅是为了帮助全面理解本发明的实施例。因此，本领域技术人员应该清楚，可以对这里描述的实施例进行各种改变和修改而不脱离本发明的范围和精神。另外，为了清楚和简洁，省略了对已知功能和构造的描述。
应理解，说明书通篇中提到的“一个实施例”或“一实施例”意味着与实施例有关的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施例中。因此，在整个说明书各处出现的“在一个实施例中”或“在一实施例中”未必一定指相同的实施例。此外，这些特定的特征、结构或特性可以任意适合的方式结合在一个或多个实施例中。
在本发明的各种实施例中，应理解，下述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本发明实施例的实施过程构成任何限定。
应理解，本文中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
在本申请所提供的实施例中，应理解，“与a相应的b”表示b与a相关联，根据a可以确定b。但还应理解，根据a确定b并不意味着仅仅根据a确定b，还可以根据a和/或其它信息确定b。
实施例：
本发明所采用的器械：
二氧化碳培养箱，生物安全柜，台式离心机，自动细胞计数仪，旋压生物反应器、体视显微镜。
本发明所采用的试剂：
invitrogeniv：一种细胞消化酶。
advantagedmemf-12：由dmem培养基和f-12培养基按1:1比例混合，包含多种氨基酸、葡萄糖和微量元素。
kosr：一种knockout血清替代物-多物种的培养基。代替血清用于哺乳动物多能干细胞的饲养层依赖性培养。
fbs：一种适用于拟胚体细胞生长的胎牛血清。将1g溶解在10ml无菌水中制备10％(wt/vol)的牛血清白蛋白溶液。
pbs：用于溶解试剂。
glutamax：一种标准细胞培养基。含有l-谷氨酰胺、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺稳定形式的二肽，可有效改善细胞存活率。
mem-neaa(100×)：一种用于维持哺乳动物细胞的dulbecco′s基本必需培养基。包含平衡盐溶液、氨基酸和维生素，使用无菌水稀释1×后使用，可在2-8℃下储存2周。
trypsin-edta(0.25％),phenolred：一种细胞解离剂。
trypsininhibitor：一种胰蛋白酶抑制剂。
bfgf：一种重组蛋白，作为培养基补充剂。将50μgbfgf重组至5ml无菌pbs中，获得10μg/ml溶液。制备25μl的等分试样，可在-20℃下保存6个月。用时取出，避免反复冻融。
rockinhibitor：在2.96ml无菌水中加5mlrock抑制剂，至最终储备浓度为5mm。制成150μl的等分试样，可在-20℃下保存1年。用时取出，避免反复冻融。
dispaseii溶液：一种蛋白水解酶。
重组人胰岛素：细胞培养级别。
2-巯基乙醇：购自r&dsystems公司。
n2添加剂(100×)：一种神经细胞生长培养基补充剂。使用无菌水稀释1×后使用，可在2-8℃下储存2周。
b27添加剂：一种神经细胞生长培养基补充剂。
肝素：一种抗凝血剂，作为培养基补充剂。在无菌pbs中加入肝素至最终储备浓度为1mg/ml，可在2–8℃下储存2年。
penicillin/streptomycin溶液(100×)：一种细胞培养抗生素。使用无菌水稀释1×后使用，可在2-8℃下储存2周，-20℃下保存1年。
matrigel：一种基底膜基质胶。使用前在4℃的冰上解冻过夜，在-20℃下预冷1-ml移液管尖端和10个微离心管10-15分钟。使用冷移液管尖端，在冰上和无菌罩内上下移动基质凝胶，然后将500μl移到每根管上。将等分试样保存在-20℃下长达1年。避免反复冻融。
ccf(recoverytmcellculturefreezingmedium)：一种细胞冻存液。
hesc培养基：含400mldmem-f12、100mlkosr、15mlfbs、5mlglutamax、5mlmem-neaa和3.5μl2-巯基乙醇。可在2-8℃下储存2周。标准hesc或hipsc培养基中bfgf为20ng/ml的最终浓度，低bfgf-hesc培养基中bfgf为4ng/ml的最终浓度，使用前添加。
神经诱导培养基：含5mln2补充剂、5mlglutamax、5mlmem-neaa和50μg肝素。可在2-8℃下储存2周。
大脑类器官分化培养基：含混合125mldmem-f12、125ml神经诱导培养基、1.25mln2添加剂、62.5μl重组人胰岛素、2.5mlglutamax、1.25mlmem-neaa和2.5mlpenicillin/streptomycin溶液。
结合附图1-2，本发明提供一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法，包括以下步骤：步骤1：获取脑部组织；
步骤2：培养所述脑部组织来获取脑部干细胞，具体的说，所述脑部组织进行拟胚体制备、胚层分化得到所述脑部干细胞；
步骤3：对所述脑部干细胞进行诱导，形成原始上皮组织，所述原始上皮组织为神经上皮组织，将所述神经上皮组织进行培养获取神经上皮细胞；
步骤4：将所述神经上皮细胞转移至基质胶混合并进行培养获取脑部类器官；
步骤5：将所述脑部类器官进行扩大培养；
步骤6：将所述脑部类器官进行冻存建库及复苏。
获取脑部组织：
脑部组织应该取生长旺盛、活跃度高的脑部肿瘤组织，直接低温条件下转运至实验环境，以保护细胞的生命力，将脑部组织切碎并加入0.1％(wt/vol)胶原酶iv(invitrogeniv)进行洗酶。
制备拟胚体：
首先，将以被清洗过后的脑部组织中加入advantagedmemf-12培养基并置于温度为37℃、湿度为5％的二氧化碳培养箱中培养5-10min，至细胞呈聚集球状，然后1500pm5min离心后去上清收集脑部细胞于六孔板中的一孔内，在含20ng/ml浓度bfgf的hesc培养基，置于37℃、湿度为5％的二氧化碳培养箱中培养。之后移除hesc培养基并缓慢加入1mlpbs溶液清洗细胞。
其次，完成后取出pbs溶液，向六孔板的每个孔中加入1毫升dispaseii溶液，将六孔板放回37℃、湿度为5％的二氧化碳培养箱中30min。取出dispaseii溶液，加入1ml低bfgf-hesc培养基。大力敲击六孔板，使多能干细胞与mefs及其他细胞散开，其中多能干细胞为脑部干细胞，使用1ml移液枪将多能干细胞团转移到15ml锥形管中，这个过程注意不要破坏细胞，放置1min，使细胞沉降到试管底部。移去含有单个细胞和mefs的上清液，再加入1ml低bfgf-hesc培养基，放置1min沉降细胞后，去除上清液。
再次，加入1mltrypsin-edta溶液培养细胞，并在37℃、湿度为5％的二氧化碳培养箱内孵育2min，再加入1mlrockinhibitor混匀，并使用1ml移液管尖端研磨混合物，直到溶液与细胞呈均匀混合状。取2份5μl细胞溶液加入8ml低bfgf-hesc培养基，室温下以1500pm离心5min，同时加入等量台盼蓝标记死细胞。自动细胞计数仪计数细胞，取平均值，设计此过程，运用细胞计数仪计数细胞，是用来测量细胞是否存活，存活数量，以保证后续步骤的进行。
最后，在1ml低bfgf-hesc培养基中加入最终浓度50μm的rock抑制剂重新培养细胞。上下吸管确保单细胞悬浮。再加入适当体积的含rock抑制剂的低bfgf-hesc培养基，按9000个活细胞/孔的量加培养基至培养皿，放在低附着96孔u形底板的各个孔中，并将其放回37℃、湿度为5％的二氧化碳培养箱中。
进一步说明，培养拟胚体时，细胞形态呈边界清晰，质地均匀，光学透明状，为脑部干细胞最佳形态。
胚层分化：
首先，每隔一天取出96孔u形底板，轻轻去除含rock抑制剂的低bfgf-hesc培养基，并加入150μl新的含rock抑制剂的低bfgf-hesc培养基，此过程持续5-6天，培养至脑部干细胞的直径大于350μm。
其次，当脑部干细胞的直径大于350μm时，培养基改用去rock抑制剂和bfgf溶液的hesc培养基继续培养至细胞直径>500μm，该过程持续4-6天。
进一步说明，采用体视显微镜测量脑部干细胞的直径。
获取神经上皮细胞：
当脑部干细胞的直径培养至500-600μm后，使用无菌剪刀剪去200μl移液管尖端，将细胞吸取转移至含500ml神经诱导培养基的24孔板内继续培养。48h后取出细胞培养板，神经诱导培养基后，再加入500ml新鲜神经诱导培养基，继续培养48h后1500pm5min离心，去培养液上清收集神经上皮细胞。
进一步说明，无菌剪刀切割移液管尖端，使开口足够大，防止吸取细胞时对细胞产生损伤。
脑部类器官的培养：
在培养脑部类器官之前，需要提前将基质胶置于冰上解冻1h，使用无菌剪刀将parafilm封口膜剪成小块正方形，按入形成凹陷的窝状，制作成4×4的网格置于60mm培养皿中，
进一步说明，保持parafilm封口膜开封后始终处于无菌环境，必要时可喷洒70％乙醇灭菌，防止污染细胞。
脑部干细胞与基质胶混合培养的过程为，剪去200μl移液管尖端，将细胞与基质胶(matrigel)按1:6的比例混匀后，每孔30μl种在窝状内包埋。在37℃、湿度为5％的二氧化碳培养箱内放置30-60min，使细胞固化。
进一步说明，脑部干细胞与基质胶混匀时速度要快，动作轻柔，防止基质胶凝固或产生气泡，影响细胞转移。
最后，培养皿中加入5ml不含维生素a的脑类器官分化培养基，使用无菌镊子将细胞与基质胶混合物从parafilm封口膜上剥离，然后将培养皿置于37℃、湿度为5％的二氧化碳培养箱中培养。每隔24h后吸取旧培养基，更换新的5ml不含维生素a的脑类器官分化培养基，静置培养4-5天。
类器官扩大培养：
剪去1ml移液管尖端，将60mm培养皿中的脑类器官培养物吸取转移至125ml旋转生物反应器中，加入100ml含维生素a的大脑类器官分化培养基，使用37℃、湿度为5％的二氧化碳培养箱的低速搅拌板进行搅拌。每隔7d更换新的100ml含维生素a的大脑类器官分化培养基。
进一步说明，旋转生物反应器在安装于培养箱之前需使用酒精喷洒擦拭后，以保证无菌环境。
脑部类器官冻存及建库：
吸收脑类器官分化培养基，用accutase/edta溶液混匀冲洗，在1500pm5min离心后去上清收集细胞。加入ccf溶液重悬，混合溶液放入2ml冻存管中，将冻存管放入程序降温盒，-80℃条件保存24h。之后冻存管转移至液氮中长期存储。
脑部类器官复苏：
取出冻存管，置于37℃水浴箱迅速回温。在1500pm5min离心后去上清收集细胞，重新包埋。待细胞层稳定固化后加入不含维生素a的脑类器官分化培养基，在37℃、湿度为5％的二氧化碳培养箱中重新培养。
最后应该说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前叙述实施对本发明进行了详细的说明，本领域的技术人员应当理解，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行同等替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神与范围。
1.一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
步骤1：获取脑部组织；
步骤2：培养所述脑部组织来获取脑部干细胞，具体的说，所述脑部组织进行拟胚体制备、胚层分化得到所述脑部干细胞；
步骤3：对所述脑部干细胞进行诱导，形成原始上皮组织，所述原始上皮组织为神经上皮组织，将所述神经上皮组织进行培养获取神经上皮细胞；
步骤4：将所述神经上皮细胞转移至基质胶混合并进行培养获取脑部类器官；
步骤5：将所述脑部类器官进行扩大培养；
步骤6：将所述脑部类器官进行冻存建库及复苏。
2.根据权利要求1所述的一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法，其特征在于：所述脑部组织为活跃度较高的脑部肿瘤组织，且在低温条件下进行运输。
3.根据权利要求1所述的一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法，其特征在于：在所述拟胚体制备之前，所述脑部组织中加入细胞消化酶后获取脑部细胞于六孔板内，所述所述拟胚体的制备过程具体包括：
首先，所述六孔板内加入advantagedmemf-12培养基与所述脑部细胞混合，并置于二氧化碳培养箱中培养，培养后去除所述advantagedmemf-12并用缓冲液溶液清洗残留培养基；
其次,在所述六孔板内加入蛋白水解酶并置于所述二氧化碳培养箱中培养，培养后去除所述蛋白水解酶并加入低bfgf-hesc培养基后得到脑部干细胞；
最后，在所述脑部干细胞溶液中加入含rock抑制剂的低bfgf-hesc培养基重新培养，将所述脑部干细胞转移至96孔u形底板并置于所述二氧化碳培养箱中培养。
4.根据权利要求1所述的一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法，其特征在于：所述胚层分化的具体过程包括：
首先,更换所述96孔u形底板中的所述含rock抑制剂的低bfgf-hesc培养基，并用体视显微镜测量所述脑部干细胞直径，
其次，当所述脑部干细胞的直径大于350μm，将所述96孔u形底板中的所述含rock抑制剂的低bfgf-hesc培养基更换为不含rock抑制剂的低bfgf-hesc培养基进行培养所述脑部干细胞，直到所述脑部干细胞的直径大于500μm。
5.根据权利要求1所述的一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法，其特征在于：关于步骤3，获取所述神经上皮细胞具体包括：将直径大于500μm的所述脑部干细胞转移至24孔板内，并添加神经诱导培养基进行培养，之后去除所述神经诱导培养基，提取所述神经上皮细胞。
6.根据权利要求1所述的一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法，其特征在于：关于步骤4，获取所述脑部类器官具体过程包括：
首先，选取封口膜，将所述封口膜剪成正方形，按入形成凹槽，所述正方形封口膜置于培养皿中；
其次，将所述神经上皮细胞与所述基质胶混合后置于所述凹槽内进行包埋，并在所述二氧化碳培养箱中进行培养；
最后，在所述培养皿中加入脑类器官分化培养基，并置于所述二氧化碳培养箱中进行培养。
7.根据权利要求1所述的一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法，其特征在于：关于步骤5，所述脑部类器官扩大培养具体步骤包括：
首先，将所述培养皿中的所述脑部类器官转移至旋转生物反应器中；
其次，在所述旋转生物反应器中加入所述脑类器官分化培养基；
最后，将所述旋转生物反应器安装于所述二氧化碳培养箱中进行培养。
8.根据权利要求7所述的一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法，其特征在于：所述旋转生物反应器在安装于所述二氧化碳培养箱之前需使用酒精喷洒擦拭后，且所述旋转生物反应器安装于搅拌板上。
9.根据权利要求1所述的一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法，其特征在于：所述脑部类器官进行冻存具体包括：
首先，收集单个脑部细胞类器官，加入细胞冻存液进行重悬后放入冻存管中；
其次，将所述冻存管安装于所述程序降温盒中，进行冷冻；
最后，将所述冻存管至于液氮中。
10.根据权利要求1所述的一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法，其特征在于：所述脑部类器官复苏具体步骤包括：提取所述液氮中的所述冻存管并置于水浴箱中；收集所述单个脑部细胞类器官，进行包埋，加入脑类器官分化培养基后置于所述二氧化碳培养箱中培养。
技术总结