本发明属于水产养殖海水鱼类繁育技术领域；尤其涉及一种营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法。
背景技术：
许氏平鲉(sebastesschlegelii)，又称黑鮶，属鲉形目-鲉科-平鲉属，主要分布于我国黄、渤海及东海海区，也常见于朝鲜半岛、日本及鄂霍次克海等，是近海冷温性底层岩礁性鱼类。其较强抗病性、粗广食性和自然越冬等养殖特性，柔嫩鲜美、营养丰富等营养价值，两大优势促使其成为我国北方沿海新兴的重要网箱养殖对象。许氏平鲉为营体内受精、体内胚胎发育的卵胎生繁殖习性，且雌、雄性腺发育性成熟不同步，每年11月左右雄性精巢达到性成熟后与雌鱼交尾，此时雌性卵巢并未性成熟，精子储存在雌鱼体内经过冬季低温期并伴随雌鱼卵巢发育性成熟后，于翌年春季4月份左右受精，再经1个月左右的胚胎体内发育后产出仔鱼。
许氏平鲉其性腺发育性成熟不同步、特殊的交配、精子储存方式、受精方式、体内发育异于卵生鱼类，不能同时获得性成熟的精子和卵子并通过体外受精的方式完成人工授精方式。严重阻碍了全人工繁育的发展。目前，许氏平鲉人工繁育方式主要存在两种，一是在繁殖季节采捕海区野生或网箱养殖怀仔亲鱼进行室内人工育苗，存在怀仔亲鱼来源不稳定、运输难度大、应激大易流产、仔鱼产出死亡率高等问题；还存在破坏野生自然资源和生物多样性等弊端。二是采用亲鱼室内交配繁殖的方式，如果交配环境控制不当的话，存在交配率低和受精产仔率低等问题。目前国内外仍未有一套有效的许氏平鲉人工授精的方法，无法实现人工培育苗种的定量规模化生产，使其人工育种、人工繁殖。苗种培育和网箱养殖业带来困难。因此该方法通过建立了体内受精许氏平鲉的人工授精方法，为下一步的人工繁育、选育和养殖提供了新方法，也为其他卵胎生海水鱼类的人工繁殖提供参考。解决海区温度等条件变化而导致的自然交配率、受精率低或工厂化交配率、产仔率的问题。
技术实现要素：
本发明的目的是提供提供一种营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法，交配季节能获取雄鱼精子即可完成雌性亲鱼的授精，操作简单、快速，模拟并替代了自然交配的过程，显著提高了雌性亲鱼受精产仔率。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法，所述方法包括如下步骤：
步骤1，精子稀释液的制备及精子活力的测定；
步骤2，雌性亲鱼人工授精；
步骤3，授精后养殖环境调控；
步骤4，春季授精成功率的统计。
优选地，步骤1中，所述许氏平鲉精子稀释液的制备及精子活力的测定具体为：
解剖雄性亲鱼获得精巢，称重放入培养皿中，将精巢重量：稀释剂按体积1:1-1:1.5加入稀释剂；用剪刀剪碎精巢或置于容器内将精巢研破，用滤网过滤组织碎片2次，吸取精子稀释液放入离心管中待用；
取精子稀释液在光学显微镜下观察精子活力，活力为95%以上的精子稀释液用于人工授精材料，待用。
优选地，步骤2中，所述雌性亲鱼人工授精具体为：用浓度为120-150mg/l的活鱼麻醉剂ms-222（生产厂家：美国sigmaaldrich公司）麻醉雌性亲鱼，置于操作台上，一人用湿毛巾覆盖鱼体头部并稍用力固定，将雌鱼腹部朝上，使鱼体垂直于操作台，另一人用实验用微量进样器(刻度为1000μl)吸取100-150μl的精子稀释液，缓慢插入到雌鱼生殖孔中，快速注射到鱼体内部，将亲鱼放入实验池继续培育。
优选地，步骤3中，所述授精后养殖环境调控具体为：水温控制在9℃以上，避免大幅波动，流水充氧培育；产仔前一个月开启夜间光照培育和营养强化，产仔前一周停食；除投喂和清除粪便残饵等必要养殖工作，减少光照和人为车间活动，为其营造一个安静的环境。
优选地，步骤4中，所述授精成功率的统计具体为：为不伤害雌亲鱼本身，根据春季雌性亲鱼是否产仔情况衡量雌性亲鱼授精成功率，亲鱼于翌年4-5月陆续产仔，记录可产仔的雌性亲鱼尾数，计算授精成功率。
优选地，所述雄性亲鱼为3龄以上工厂化驯养性成熟的雄性亲鱼，精巢于每年11月成熟。
优选地，所述稀释剂为雄性亲鱼尿液，其获取方式为解剖雄性亲鱼时，用2ml注射器针头插入膀胱中吸取尿液，并储存在离心管中备用。
优选地，所述许氏平鲉雌性亲鱼为4龄以上性成熟的雌性。
优选地，所述精子稀释液的吸取过程应避免产生气泡，注射完后紧接着手指按住生殖孔3-5s，防止精液流出。
优选地，所述授精成功率的计算公式为可产仔的雌性亲鱼尾数∕人工授精雌鱼尾数×100%。
本发明具有以下优点：
（1）本发明涉及的营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法；建立了重要卵胎生经济鱼类许氏平鲉的人工授精方法，替代了直接收集野生或网箱养殖的怀仔亲鱼进行室内人工繁育，克服了怀仔亲鱼来源不稳定、运输难度大、成本的增加、运输应激易亲鱼流产和死亡、仔鱼成活率低、畸形率到等问题；采用本发明方法获得的受精率高和产仔率高的雌性亲鱼，打通了许氏平鲉全人工本发明的意义在于许氏平鲉雌雄亲鱼交配季节能获取少量精子即可快速完成雌性亲鱼的授精过程，使雌性授精成功率在91%以上。解决了室内人工培育亲鱼因条件控制不当易造成自然交尾过程中交配率低的问题，本发明方法彻底解决采用野生或网箱怀仔亲鱼进行繁育的弊端，可使实现许氏平鲉全人工繁殖和苗种批量生产，也为许氏平鲉选育、养殖及增殖放流提供技术支撑。
繁育整个链条，填补了该领域的空白，为规模化繁育苗种和养殖提供技术条件。
（2）本发明涉及的营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法；通过建立许氏平鲉的人工授精方法，使性成熟雌性亲鱼授精成功率在91%以上；在生产实践切实可行，操作简单、易行，仅仅通过几尾性成熟的雄鱼即可完成甚至上百尾甚至更多雌性亲鱼的受精工作，成本低，效率高。
（3）本发明涉及的营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法与室内自然交配方法相比，避免了人工控制水温、光照、水流及声音等养殖条件在交配期的干扰，大大提高了授精成功率，进而提高及受精率，保证翌年苗种繁育顺利进行。
（4）本发明涉及的营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法，由于许氏平鲉自由交配中存在“一雄多雌和一雄多雌”现象，因此在构建选育家系时存在家系识别的麻烦，本发明为许氏平鲉家系构建、新品系和品种的选育提供了便利。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，以下的实施实例只是对本发明的进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。
实施例1
本实施例涉及一种营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法，具体步骤如下：
步骤1，许氏平鲉雄性亲鱼精子稀释液的获取：
2017年11月8-10日，在烟台泰华海洋科技有限公司，挑选4尾3龄以上的工厂化养殖的性成熟的许氏平鲉雄性亲鱼，解剖雄鱼，用2ml注射器针头插入膀胱中吸取尿液，并储存在离心管中作为精子稀释剂备用；获取精巢，称其重量放入培养皿中，然后按照精巢重量：稀释剂体积1:1~1:1.5比例快速加入稀释剂，用剪刀剪碎精巢或置于容器内将精巢研破，用300目滤网（筛绢网）来过滤过滤去除组织碎片，过滤2次，然后吸取放入离心管中待用。具体操作：每完成1尾雄鱼解剖后的整个人工授精流程，再继续下一尾雄鱼。
步骤2，精子的活力检测：
取精子稀释液立即在光学显微镜下观察精子活力，将精子活力达95%以上的精液用于人工授精材料，4尾雄鱼的精子活力均达到95%以上。
步骤3，雌性亲鱼选取和人工授精：
选取74尾4龄以上性成熟雌性亲鱼作为实验材料，使用浓度为120-150mg/l的活鱼专用麻醉剂ms-222对其麻醉，将麻醉后雌鱼放在操作台上，两人合作进行人工授精操作，一人用湿毛巾覆盖头部并稍用力固定，然后将雌鱼腹部朝上，鱼体垂直于操作台，另一人用实验用的微量进样器(刻度为1000μl)，吸取100-150μl的精子稀释液，吸取和注射过程中应避免产生气泡，缓慢插入到雌鱼肛门孔后方的生殖孔中，注射完后紧接着手指按住生殖孔3-5s，防止精液流出。完成后放入养殖池继续培育；
步骤4，授精后养殖环境条件的控制：
授精后的雌性亲鱼冬季水温控制在9℃以上，3-4月份水温逐步提高到14℃，避免培育温度大幅波动，盐度28-32，ph7.8-8.2，溶解氧≥5mg/l，流水充氧培育等；产仔前一个月通过投喂小黄花鱼、虾虎鱼、虾类、乌贼、沙蚕、蛤肉、扇贝裙边等进行营养强化，添加维生素等拌料投喂，并开启夜间光照培育；产仔前一周停食；除投喂和清除粪便残饵等必要养殖工作，减少光照和人为车间活动，为其营造一个安静的环境；
步骤5，统计春季雌性亲鱼授精成功率：
2018年的4月20日，雌性亲鱼陆续开始产仔，74尾雌性亲鱼共有68尾能够产仔，授精成功率为91.9%（授精成功率=可产仔的雌性亲鱼尾数∕人工授精雌鱼尾数×100%=68/74×100%=91.9%），每尾雌鱼产仔数量大体范围在10.2×104～25.5×104尾。
实施例2
本实施例涉及一种营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法，
本实施例除了亲鱼批次不同，其他人工授精的方法与实施例1基本相同。
2018年11月15-20日，进行了以上许氏平鲉的人工授精试验，选取解剖性成熟雄鱼12尾，人工授精雌性亲鱼120尾。
2019年4月25日，开始雌性亲鱼陆续产仔，能产仔的雌性亲鱼为112尾，授精成功率为93.3%（授精成功率=可产仔的雌性亲鱼尾数∕人工授精雌鱼尾数×100%=112/120×100%=93.3%），每尾雌鱼产仔数量范围在7.2×104～28.3×104尾。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
（1）本发明涉及的营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法；建立了重要卵胎生经济鱼类许氏平鲉的人工授精方法，替代了直接收集野生或网箱养殖的怀仔亲鱼进行室内人工繁育，克服了怀仔亲鱼来源不稳定、运输难度大、成本的增加、运输应激易亲鱼流产和死亡、仔鱼成活率低、畸形率到等问题；采用本发明方法获得的受精率高和产仔率高的雌性亲鱼，打通了许氏平鲉全人工繁育整个链条，填补了该领域的空白，为规模化繁育苗种和养殖提供技术条件。
（2）本发明涉及的营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法；通过建立许氏平鲉的人工授精方法，使性成熟雌性亲鱼授精成功率在91%以上；在生产实践切实可行，操作简单、易行，仅仅通过几尾性成熟的雄鱼即可完成甚至上百尾甚至更多雌性亲鱼的受精工作，成本低，效率高。
（3）本发明涉及的营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法与室内自然交配方法相比，避免了人工控制水温、光照、水流及声音等养殖条件在交配期的干扰，大大提高了授精成功率，进而提高受精率，保证翌年苗种繁育顺利进行。
（4）本发明涉及的营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法，由于许氏平鲉自由交配中存在“一雄多雌和一雄多雌”现象，因此在构建选育家系时存在家系识别的麻烦，本发明为许氏平鲉家系构建、新品系和品种的选育提供了便利。
本发明的意义在于许氏平鲉雌雄亲鱼交配季节能获取少量精子即可快速完成雌性亲鱼的授精过程，解决了室内人工培育亲鱼自然交尾过程中交配率低的问题，使雌性亲鱼授精成功率在91%以上。本发明方法彻底解决采用野生或网箱怀仔亲鱼进行繁育的弊端，可使实现许氏平鲉全人工繁殖和苗种批量生产，也为许氏平鲉选育、养殖及增殖放流提供技术支撑。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。
1.一种营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1，精子稀释液的制备及精子活力的测定；
步骤2，雌性亲鱼人工授精；
步骤3，授精后养殖环境调控；
步骤4，春季授精成功率的统计。
2.如权利要求1所述的营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法，其特征在于，步骤1中，所述精子稀释液的制备及精子活力的测定具体为：
解剖雄性亲鱼获得精巢，称重放入培养皿中，将精巢重量：稀释剂按体积1:1-1:1.5加入稀释剂；用剪刀剪碎精巢或置于容器内将精巢研破，用滤网过滤组织碎片2次，吸取精子稀释液放入离心管中待用；
取精子稀释液在光学显微镜下观察精子活力，活力为95%以上的精子稀释液用于人工授精材料，待用。
3.如权利要求1所述的营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法，其特征在于，步骤2中，所述雌性亲鱼人工授精具体为：用浓度为120-150mg/l的活鱼麻醉剂ms-222麻醉雌性亲鱼，置于操作台上，一人用湿毛巾覆盖鱼体头部并稍用力固定，将雌鱼腹部朝上，使鱼体垂直于操作台，另一人用实验用微量进样器吸取100-150μl的精子稀释液，缓慢插入到雌鱼生殖孔中，快速注射到鱼体内部，将亲鱼放入实验池继续培育。
4.如权利要求1所述的营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法，其特征在于，步骤3中，所述授精后养殖环境调控具体为：水温控制在9℃以上，产仔前一个月开启夜间光照培育和营养强化，产仔前一周停食。
5.如权利要求1所述的营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法，其特征在于，步骤4中，所述受精产仔率的统计具体为：根据亲鱼是否产仔情况衡量雌性亲鱼授精成功率，亲鱼于翌年4-5月陆续产仔，记录可产仔的雌性亲鱼尾数，计算授精成功率。
6.如权利要求1所述的营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法，其特征在于，所述雄性亲鱼为3龄以上工厂化驯养的性成熟雄性亲鱼，精巢于每年11月成熟。
7.如权利要求2所述的营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法，其特征在于，所述稀释剂为雄性亲鱼尿液，其获取方式为解剖雄性亲鱼时，用2ml注射器针头插入膀胱中吸取尿液，并储存在离心管中备用。
8.如权利要求6所述的营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法，其特征在于，所述许氏平鲉雌性亲鱼为4龄以上性成熟的雌性。
9.如权利要求2所述的营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法，其特征在于，所述精子稀释液的吸取过程应避免产生气泡，注射完后紧接着手指按住生殖孔3-5s，防止精液流出。
10.如权利要求1所述的营体内受精鱼类许氏平鲉的人工授精方法，其特征在于，所述授精成功率的计算公式为可产仔的雌性亲鱼尾数∕人工授精雌鱼尾数×100%。
技术总结