本发明属于干细胞领域，涉及干细胞诱导分化，具体一种小分子活性肽在诱导huc-mscs分化方面的应用。
背景技术：
：间充质干细胞(mscs)是一类来源于发育早期中胚层、具有多向分化及自我更新潜能的成体干细胞。mscs的来源主要包括骨髓、脂肪、脐带、胎盘、羊膜等。其中，人脐带间充质干细胞(huc-mscs)因取材方便、来源广泛、免疫原性低且不受伦理学争议等众多优势，成为最具潜力的种子细胞。研究显示，huc-mscs具有广阔的临床应用前景，可用于治疗神经系统疾病、肝肾损伤、自身免疫疾病、心脏疾病、骨科疾病、心血管疾病、糖尿病等。诱导huc-mscs向神经元样细胞分化可以用于脊髓损伤等神经损伤相关疾病。技术实现要素：本发明是为了提供一种小分子活性肽在诱导huc-mscs分化方面的应用。技术方案：一种小分子活性肽在体外诱导huc-mscs分化方面的应用，其中：所述小分子活性肽为(d-ala2)-亮氨酸脑啡肽，所述分化指向神经元样细胞分化。一种小分子活性肽在制备体外诱导huc-mscs向神经元样细胞分化的培养基方面方面的应用，所述小分子活性肽为(d-ala2)-亮氨酸脑啡肽。技术效果：本发明发现，小分子活性肽(d-ala2)-亮氨酸脑啡肽具有诱导hucmscs向神经元样细胞分化的活性，且具有浓度效应。因此，(d-ala2)-亮氨酸脑啡肽可以用于制备诱导hucmscs向神经元样细胞分化的培养基。附图说明图1为人脐带间充质干细胞倒置显微镜观察结果；可见细胞呈梭形，呈漩涡状生长，符合人脐带间充质干细胞的生长特点。图2为各组继续培养8d后倒置显微镜下观察结果；可见含有20μm或50μm小分子活性肽的加药诱导组可见明显的神经元样细胞，而正常对照组不明显。图3为westernblot检测结果；与正常对照组相比，含有20μm或50μm小分子活性肽的加药诱导组nse蛋白显著升高，且小分子活性肽的浓度越高nse蛋白含量越高。具体实施方式一、实验材料人脐带间充质干细胞购自上海传秋生物科技有限公司。胎牛血清、dmem/f12(1:1)培养基购自购自美国gibco公司。小分子活性肽为(d-ala2)-亮氨酸脑啡肽，序列为h-tyr-d-ala-gly-phe-leu-oh(cas号：64963-01-5)，购自源叶生物，纯度99％。二、实验方法1、人脐带间充质干细胞的培养、传代、形态观察和表型检测将冻存的人脐带间充质干细胞按常规方法复苏后，用含10％胎牛血清的dmem/f12培养基培养于t25培养瓶中，培养条件为37℃、5％co2、饱和湿度。2～3d换一次液，待细胞长满瓶底面积80％～90％时传代。传代比例为1:5，步骤为：将0.25％胰酶-0.53mmedta消化液与dpbs置于37℃预热，倒掉培养瓶中的培养基，往培养瓶中加入3-5mldpbs，轻晃洗涤后弃去。使用dpbs将胰酶稀释4倍，往瓶中加2ml稀释后的胰酶，置于室温孵育消化，消化好后加入2ml含血清的完全培养基终止消化。用移液枪轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之完全脱落，然后收集细胞悬液并吹打成单个细胞悬液，1200rpm离心5min，弃上清，加入完全培养基重悬细胞，进行传代。取传代后生长状态良好的人脐带间充质干细胞用于后续实验。形态观察：在倒置显微镜下观察人脐带间充质干细胞的形态和生长情况，拍照。表型检测：将人脐带间充质干细胞用0.25％胰酶消化，pbs重悬，制备1×106/ml的细胞悬液。然后取100μl细胞悬液与20μl标记一抗(cd73-pe、cd90-fitc、cd105-apc、cd34-pe、cd45-apc、hla-dr-fitc)4℃避光孵育1h，上流式细胞仪检测细胞表型分子阳性率。2、神经元样细胞分化检测取生长状态良好的hucmscs，用含10％胎牛血清的dmem/f12培养基制成细胞悬液，按每孔2×105个细胞接种于24孔培养板中，37℃、5％co2、饱和湿度培养24h后，加药诱导组更换为含10％胎牛血清和20μm或50μm小分子活性肽的dmem/f12培养基继续培养，正常对照组更换为含10％胎牛血清的dmem/f12培养基继续培养，每2～3d更换一次对应的培养基。继续培养8d后，倒置显微镜下观察细胞形态。收集正常对照组和加药诱导组继续培养10d的细胞，pbs洗涤，裂解液中裂解，使用bca法测量总蛋白。将蛋白样本通过sds-page凝胶电泳分离等量的总蛋白，转移到聚偏二氟乙烯膜上，用含5％脱脂牛奶的封闭溶液封闭，加入抗nse(神经元特异性烯醇化酶)、β-actin一抗，4℃摇床过夜，加入hrp标记的二抗室温孵育1h，化学发光法显色，凝胶成像仪采集图像。3、统计学处理数据采用graphpadprism5.0软件进行统计处理，以x±s表示，两组间比较采用t检验，p＜0.05表示具有显著性差异。三、实验结果1、人脐带间充质干细胞形态观察和表型检测结果倒置显微镜观察结果如图1所示，细胞呈梭形，呈漩涡状生长，符合人脐带间充质干细胞的生长特点。表型检测结果如表1所示，cd34、cd45、hla-dr表达水平很低，cd73、cd90、cd105表达水平很高，符合人脐带间充质干细胞的表型特点。表1细胞表型分子阳性率细胞表型分子阳性率阳性率(％)cd7398.5cd9098.8cd10598.2cd342.73cd451.69hla-dr0.872、神经元样细胞分化检测各组继续培养8d后，倒置显微镜下观察结果如图2所示，含有20μm或50μm小分子活性肽的加药诱导组可见明显的神经元样细胞，说明加药诱导组hucmscs向神经元样细胞分化，且小分子活性肽的浓度越高分化越明显，而正常对照组不明显。westernblot检测结果如图3所示，与正常对照组相比，含有20μm或50μm小分子活性肽的加药诱导组nse蛋白显著升高，且小分子活性肽的浓度越高nse蛋白含量越高。nse为神经元标志蛋白，常作为反应神经元样细胞分化水平的标志。综合细胞形态观察和westernblot检测结果可知，小分子活性肽(d-ala2)-亮氨酸脑啡肽具有诱导hucmscs向神经元样细胞分化的活性，且具有浓度效应。因此，(d-ala2)-亮氨酸脑啡肽可以用于制备诱导hucmscs向神经元样细胞分化的培养基。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种小分子活性肽在体外诱导huc-mscs分化方面的应用，其中：所述小分子活性肽为(d-ala2)-亮氨酸脑啡肽，所述分化指向神经元样细胞分化。
2.一种小分子活性肽在制备体外诱导huc-mscs向神经元样细胞分化的培养基方面方面的应用，所述小分子活性肽为(d-ala2)-亮氨酸脑啡肽。
技术总结本发明公开了一种小分子活性肽在诱导hUC‑MSCs分化方面的应用，所述小分子活性肽为(D‑ALA2)‑亮氨酸脑啡肽，所述分化指向神经元样细胞分化。本发明发现，小分子活性肽(D‑ALA2)‑亮氨酸脑啡肽具有诱导hUCMSCs向神经元样细胞分化的活性，且具有浓度效应。因此，(D‑ALA2)‑亮氨酸脑啡肽可以用于制备诱导hUCMSCs向神经元样细胞分化的培养基。
技术研发人员：张川
受保护的技术使用者：张川
技术研发日：2020.11.30
技术公布日：2021.03.12
