本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种稳定高效的pdx肿瘤模型建模方法。
背景技术：
为了满足对改进的肿瘤模型需求，目前已经从使用癌细胞系转向患者来源异种移植体(patient-derivedxenograft,pdx)体内动物模型。pdx模型是强大的临床前肿瘤模型，可保留患者肿瘤的组织病理学、基因组和转录组学以及肿瘤异质性和药物反应等特征。通过将癌症患者的肿瘤样品直接移植到免疫受损的小鼠中来产生源自患者的异种移植物。pdx模型已被广泛应用于多种癌症类型，如肝癌、乳腺癌、肺癌和结肠癌。此外，pdx模型对药物治疗的反应与临床结果显著相关，这使得建立个性化异种移植模型成为可能，有助于做出治疗决策并指导癌症治疗。因此，pdx模型被认为是癌症研究中转化药物开发的最佳临床前模型。第一个肝癌pdx模型于1996年报道，但由于植入率非常低，该领域进展缓慢。在过去的五年中，通过改进的实验方法将植入率提高到接近40％，并且已经产生了许多肝癌pdx模型。尽管pdx模型在肝癌治疗中取得了有用的成果，但仍存在一些问题，例如59％的患者植入失败。
因此，有必要进一步的去优化肝癌pdx动物模型的建立方法，从而有效提高移植的成功率以及缩短建模周期。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种稳定高效的pdx肿瘤模型建模方法，以提高现有pdx肿瘤模型建模方法的成功率。
为了达到上述目的，本发明提供了一种稳定高效的pdx肿瘤模型建模方法，其特征在于，包含：制备平衡盐溶液，以及收集肿瘤组织，收集到的肿瘤组织保存于所述的平衡盐溶液中；所述的平衡盐溶液包含：hbss、体积分数占10％的dmem/f12、以及质量分数均为1％的青霉素和链霉素；所述的hbss的成分及终浓度为：nacl、140mm；kcl、5mm；cacl2、1mm；mgso4·7h2o、0.4mm；mgcl2·6h2o、0.5mm；na2hpo4、0.3mm；kh2po4、0.3mm；葡萄糖及nahco3均4mm；10％胎牛血清。
优选地，收集到的肿瘤组织立刻处理，或添加冻存保护剂后放置在-70℃冰箱保存，供以后pdx模型建立。
优选地，采用组织植入法进行建模，所述的组织植入法包含以下步骤：将收集到的肿瘤组织在所述的平衡盐溶液中切成3*3mm小块，然后植入小鼠体内。
优选地，通过套管针将肿瘤小块植入到小鼠的中背颈区域，然后皮下滑动套管针，直到所述套管针到达侧腹区域，以扩大穿刺口并尽可能多的植入肿瘤小块，然后荷包缝合或“8”字缝合穿刺点防止肿瘤脱出。
优选地，采用细胞植入法进行建模，所述的细胞植入法包含以下步骤：
s1，样本处理，具体包含：将肿瘤组织消化处理并用筛网过滤后，与氯化铵在37℃下孵育30分钟以裂解红细胞，然后离心收集肿瘤细胞，并用培养基冲洗肿瘤细胞；
s2，肿瘤细胞的体外培养及成瘤，具体包含：将肿瘤细胞在含有10％胎牛血清的dmem/f12培养基中培养24小时；培养获得的肿瘤细胞注射入小鼠体内，以形成f0代肿瘤。
优选地，步骤s1中，肿瘤组织消化处理的方法包含：
(1)将肿瘤组织剪碎成小块，放入装有胎牛血清的离心管中，所述的离心管置于冰上；
(2)用冷的hbss冲洗剪碎后的肿瘤组织，并在含有1％青霉素和1％链霉素的dmem/f12培养基中于37℃孵育30分钟；
(3)将肿瘤组织切成小片，并用胶原酶消化处理。
优选地，所述的胶原酶的浓度为0.02mg/ml，消化时间为15分钟。
优选地，步骤s2中，肿瘤细胞的注射点荷包缝合或“8”字缝合。
优选地，所述的f0代肿瘤用于直接移植到小鼠体内或分离培养出肿瘤细胞后注射入小鼠体内，以形成下一代肿瘤。
优选地，所述的肿瘤为肝癌肿瘤。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：
(1)本发明的pdx肿瘤模型建模方法成功率高。
(2)本发明的平衡盐溶液包含有dmem/f12和hbss，营养成分高，有利于肿瘤样本的前期保存，并且样本可放置于-70℃冰箱保存供以后pdx模型建立。
(3)100μm和40μm滤网多次过滤，细胞组织纯度提高，更有利于细胞种植，肿瘤生长。
(4)皮下予以”8”字缝合，可以防止异种排斥肿瘤组织脱出，且可以最大化的种植肿瘤组织于免疫缺陷小鼠皮下，保证100％肿瘤组织于小鼠皮下。
附图说明
图1为实施例1建立的肝癌pdx模型。
图2为对比例1建立的肝癌pdx模型。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
一、组织植入法
实施例1
利用新鲜组织建立肝癌pdx模型。
1.接收并准备患者肿瘤样本(～2x2cm2)
1.1制备含有1％青霉素和1％链霉素的平衡盐溶液(dmem/f12；hbss：nacl，140mm；kcl，5mmcacl2,1mm；mgso4·7h2o，0.4mm；mgcl2·6h2o，0.5mm；na2hpo4,0.3mm；kh2po4,0.3mm；葡萄糖，nahco3,4mm；10％胎牛血清)，并将制备的溶液(20-25ml)加入无菌收集管中用于收集肿瘤标本；收集标本并立刻使用。
1.2从含有dmem/f12溶液的无菌管中取出肿瘤样品。注：外科医生将肝癌肿瘤组织切除并由病理学家收集。将组织收集到含有dmem/f12培养基的无菌收集管中。
1.3将肿瘤样品带到实验室中，将肿瘤组织在平衡盐溶液中切成3*3mm小块；将肿瘤植入到小鼠中背颈区域，然后皮下滑动套管针，直到用高压灭菌的12g套管针到达侧腹区域，扩大穿刺口并尽可能多的植入肿瘤小块，并荷包缝合或“8”字缝合穿刺点防止肿瘤脱出。
如图1所示，为实施例1建立的肝癌pdx模型的结果图。由图1可知，pdx模型建模成功并且肿瘤大。
实施例2
利用-70℃冰冻组织建立肝癌pdx模型。
实施例2和实施例1不同之处在于，步骤1.1中，肿瘤标本放置-70℃冰箱保存3个月后建立pdx模型。
对比例1
对比例1和实施例1不同之处在于：
步骤1.1中的含有1％青霉素和1％链霉素的平衡盐溶液替换为1640培养基或生理盐水。
如图2所示，为对比例1建立的肝癌pdx模型的结果图。由图2可知，获得的肿瘤较小。
对比例2
对比例2采用对比例1的方法，但是肿瘤标本放置-70℃冰箱保存后建立pdx模型。
结果：
(1)利用新鲜组织建立肝癌pdx模型：
表1
(2)利用-70℃冰冻组织建立肝癌pdx模型：
表2
由表1和表2可知，对比例成瘤成功率低且肿瘤小；实施例成瘤成功率高且肿瘤大。
另外根据实施例2和对比例2可知，本发明提供的平衡盐溶液在细胞微环境的保护、低温的长期保存等方面优于常规的保存液，既往传统方法不能达到组织的长期低温保存及利用。
二、细胞植入法
实施例3
利用新鲜组织建立肝癌pdx模型。
1.接收并准备患者肿瘤样本(～2x2cm2)
1.1制备含有1％青霉素和1％链霉素的平衡盐溶液(dmem/f12；hbss：nacl，140mm；kcl，5mmcacl2,1mm；mgso4·7h2o，0.4mm；mgcl2·6h2o，0.5mm；na2hpo4,0.3mm；kh2po4,0.3mm；葡萄糖，nahco3,4mm；10％胎牛血清)，并将制备的溶液(20-25ml)加入无菌收集管中用于收集肿瘤标本；收集标本并立刻使用。
1.2从含有dmem/f12溶液的无菌管中取出肿瘤样品。注：外科医生将肝癌肿瘤组织切除并由病理学家收集。将组织收集到含有dmem/f12培养基的无菌收集管中。
1.3将肿瘤样品带到实验室中，以植入裸鼠体内。
2.组织样本处理
2.1在无菌通风橱中，将收集管中的肿瘤样品放入无菌塑料培养皿(直径100mm×深度13mm)中，用冷的hbss溶液冲洗肿瘤组织2次。
2.2使用高压灭菌的小剪刀和镊子将肿瘤组织切成1×1毫米的小块，放入装有300μl胎牛血清的高压灭菌的1.5毫升离心管中。将离心管置于冰上。
2.3从肿瘤组织制备肿瘤细胞，用冰冷的0.5mlhbss冲洗收集的肿瘤样品2次，并在含有1％青霉素和1％链霉素的dmem/f12培养基中于37℃孵育30分钟。
2.4使用高压灭菌的小剪刀和镊子将肿瘤组织切成1x1毫米的片。用0.02mg/ml胶原酶iv在37℃消化肿瘤组织15分钟。
2.5通过100μm和40μm筛网过滤组织(100μm和40μm滤网多次过滤，细胞组织纯度提高，更有利于细胞种植，肿瘤生长)。通过与氯化铵在37℃下孵育30分钟来裂解红细胞。通过以1000rpm离心10分钟收集肿瘤细胞，并用dmem/f12或者1640培养基冲洗肿瘤细胞。
2.6将分离的细胞(1×106)在含有10％胎牛血清的10mldmem/f12培养基中培养24小时。注意：使用这些肿瘤细胞皮下注射到scid或nod/scid小鼠中。注射点荷包缝合或8字缝合。
3.植入患者来源的肿瘤异种移植体
3.1对于每个单独的患者衍生的肿瘤组织或细胞，使用8只6-8周龄的雄性scid或nod/scid小鼠。注射原始人类肿瘤的小鼠被指定为f0代，然后下一代通过上一代注射肿瘤产生，并命名为f1，f2，f3等。
3.2加载一块肿瘤或将培养基中的细胞加载到高压灭菌的12g套管针中，并确保将肿瘤完全推入套管针中。
3.3在无菌通风橱中，将8只小鼠放入麻醉箱中，该麻醉箱与异氟烷麻醉机(2％-3％异氟醚和3％-4％氧气用于维持麻醉)连接。
3.4观察小鼠的疼痛反射，确保鼠标完全麻醉。将麻醉的小鼠放在清洁的区域上，将肿瘤或细胞注射到中背颈区域，然后皮下滑动套管针，直到用高压灭菌的12g套管针到达侧腹区域，并荷包及“8”字缝合穿刺点，防止肿瘤脱出。皮下予以”8”缝合，防止异种排斥肿瘤组织脱出，且可以最大化的种植肿瘤组织于免疫缺陷小鼠皮下，可以保证100％肿瘤组织于小鼠皮下。
3.5在小鼠完全清醒之前，皮下注射丁丙诺啡(0.1mg/kg)。接下来，将每只小鼠单独放入笼中并监视，直到小鼠清醒并移动。
3.6每周监测小鼠的生长和健康状况。跟踪肿瘤大小(使用卡尺测量肿瘤的大小，根据公式计算肿瘤体积：宽度x宽度x长度/2)，肿瘤注射数据和小鼠健康状况。
3.7当肿瘤大约500mm3时，用异氟醚(2％-3％)麻醉小鼠(10-12只小鼠)，然后颈椎脱臼。
3.8使用上述程序(步骤2.1至3.5)收集10-12个肿瘤，以便进入下一代并收集剩余的肿瘤供将来使用。
3.9保留剩余的小鼠(8-10只小鼠)直至新一代肿瘤生长约500mm3的小鼠。
4.确定pdx肿瘤保留了其对应的临床肿瘤组织病理学特性，未分化成其它肿瘤。
4.1用过量戊巴比妥钠(50mg/kg)杀死小鼠，用高压灭菌的小剪刀和镊子做一个小切口(1-2厘米长)，轻轻地从脂肪垫上完全去除pdx肿瘤。
4.2使用收集的肿瘤组织进行蛋白质印迹检测cdk1，pdk1和β-catenin蛋白，并使用免疫组织化学进行生物标记物分析(hep-par1，ck7，ck20和cea)，确定未分化成其它肿瘤。
实施例4
利用-70℃冰冻组织建立肝癌pdx模型。
实施例4和实施例3不同之处在于，步骤1.1中，肿瘤标本放置-70℃冰箱保存3个月后建立pdx模型。
对比例3
对比例3和实施例3不同之处在于：
(1)步骤1.1中的含有1％青霉素和1％链霉素的平衡盐溶液替换为1640培养基或生理盐水。
(2)步骤2.5中，仅用100μm或40μm筛网过滤组织一次；未采用氯化铵裂解红细胞。
(3)步骤3.4中，传统组注射器注射肿瘤组织到皮下，未予以缝合。
对比例4
对比例4采用对比例3的方法，但是肿瘤标本放置-70℃冰箱保存后建立pdx模型。
结果表明，与对比例3相比，实施例3和实施例4的构建的多个pdx肿瘤模型均获得成功，且肿瘤较大。而对比例4的pdx肿瘤模型未能构建成功。
综上所述，本发明的pdx肿瘤模型建模方法稳定高效，成功率高。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
1.一种稳定高效的pdx肿瘤模型建模方法，其特征在于，包含：制备平衡盐溶液，以及收集肿瘤组织，收集到的肿瘤组织保存于所述的平衡盐溶液中；所述的平衡盐溶液包含：hbss、体积分数占10％的dmem/f12、以及质量分数均为1％的青霉素和链霉素；所述的hbss的成分及终浓度为：nacl、140mm；kcl、5mm；cacl2、1mm；mgso4·7h2o、0.4mm；
mgcl2·6h2o、0.5mm；na2hpo4、0.3mm；kh2po4、0.3mm；葡萄糖及nahco3均4mm；10％胎牛血清。
2.根据权利要求1所述的稳定高效的pdx肿瘤模型建模方法，其特征在于，收集到的肿瘤组织立刻处理，或添加冻存保护剂后放置在-70℃冰箱保存，供以后pdx模型建立。
3.根据权利要求1所述的稳定高效的pdx肿瘤模型建模方法，其特征在于，采用组织植入法进行建模，所述的组织植入法包含以下步骤：
将收集到的肿瘤组织在所述的平衡盐溶液中切成3*3mm小块，然后植入小鼠体内。
4.根据权利要求3所述的稳定高效的pdx肿瘤模型建模方法，其特征在于，通过套管针将肿瘤小块植入到小鼠的中背颈区域，然后皮下滑动套管针，直到所述套管针到达侧腹区域，以扩大穿刺口并尽可能多的植入肿瘤小块，然后荷包缝合或“8”字缝合穿刺点防止肿瘤脱出。
5.根据权利要求1所述的稳定高效的pdx肿瘤模型建模方法，其特征在于，采用细胞植入法进行建模，所述的细胞植入法包含以下步骤：
s1，样本处理，具体包含：将肿瘤组织消化处理并用筛网过滤后，与氯化铵在37℃下孵育30分钟以裂解红细胞，然后离心收集肿瘤细胞，并用培养基冲洗肿瘤细胞；
s2，肿瘤细胞的体外培养及成瘤，具体包含：将肿瘤细胞在含有10％胎牛血清的dmem/f12培养基中培养24小时；培养获得的肿瘤细胞注射入小鼠体内，以形成f0代肿瘤。
6.根据权利要求5所述的稳定高效的pdx肿瘤模型建模方法，其特征在于，步骤s1中，肿瘤组织消化处理的方法包含：
(1)将肿瘤组织剪碎成小块，放入装有胎牛血清的离心管中，所述的离心管置于冰上；
(2)用冷的hbss冲洗剪碎后的肿瘤组织，并在含有1％青霉素和1％链霉素的dmem/f12培养基中于37℃孵育30分钟；
(3)将肿瘤组织切成小片，并用胶原酶消化处理。
7.根据权利要求6所述的稳定高效的pdx肿瘤模型建模方法，其特征在于，所述的胶原酶的浓度为0.02mg/ml，消化时间为15分钟。
8.根据权利要求1所述的稳定高效的pdx肿瘤模型建模方法，其特征在于，步骤s2中，肿瘤细胞的注射点荷包缝合或“8”字缝合。
9.根据权利要求1所述的稳定高效的pdx肿瘤模型建模方法，其特征在于，所述的f0代肿瘤用于直接移植到小鼠体内或分离培养出肿瘤细胞后注射入小鼠体内，以形成下一代肿瘤。
10.根据权利要求1所述的稳定高效的pdx肿瘤模型建模方法，其特征在于，所述的肿瘤为肝癌肿瘤。
技术总结