本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种基于crisprcas9基因编辑系统的敲除猪mir-155基因的细胞系及构建方法。
背景技术：
crispr/cas系统是由rna介导的对dna修饰的基因编辑工具，该技术可以对基因组特定位点进行缺失、插入、修复等靶向编辑，是目前基因组编辑领域最受欢迎的新技术。crispr/cas系统是人们在古细菌和细菌中发现的一种获得性免疫机制。crispr/cas系统有三种类型：typeⅰ、typeⅱ和typeⅲ，其中仅存在于细菌的typeⅱ系统只需要一个cas9蛋白来切割dna双链，由于其简易性和可操作性，typeⅱ系统已被改造为最成功的人工核酸酶，是最有力的基因编辑工具，成为基因编辑领域最炙手可热的技术。
存在机体组织微环境中的巨噬细胞是重要的免疫细胞，具有吞噬、抗原加工与递呈、免疫调节等生理功能，在机体先天性免疫和获得性免疫中发挥重要作用。猪体受到细菌（猪沙门氏菌、副猪嗜血杆菌）或病毒（猪蓝耳病）感染后，常常首当其冲受到影响的是巨噬细胞，比如肺泡巨噬细胞。大量研究数据表明细菌（比如副猪嗜血杆菌）感染削弱巨噬细胞的免疫力导致猪对细菌易感，病毒（猪蓝耳病）感染抑制巨噬细胞的功能形成严重免疫抑制导致猪体对其它病毒性疾病和细菌性疾病易感性明显增加。
mir-155基因是重要的抗病候选基因。mir-155促进机体免疫细胞分化，调控机体炎症反应和免疫应答，在机体抵抗感染中发挥重要作用。目前尚未有关于猪mir-155基因的敲除载体及猪mir-155基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系（3d4/21细胞系）模型的相关报道。
技术实现要素：
（一）解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于crispr/cas9基因编辑系统特异性靶向敲除猪mir-155基因的细胞系及其构建方法，本发明为进一步对抗病候选基因mir-155的功能研究提供有效的细胞研究模型。
（二）技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
本发明首先提供一种基于crispr/cas9基因编辑系统特异性靶向敲除猪mir-155基因的优选sgrna向导序列，即sgrna39，其核苷酸序列如seqidno:1所示；
本发明还提供了一种基于crispr/cas9基因编辑系统特异性靶向敲除猪mir-155基因的细胞系，所述细胞系为猪肺泡巨噬细胞系。
本发明还提供一种基于crispr/cas9基因编辑系统特异性靶向敲除猪mir-155基因的细胞系的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
（1）设计并合成猪mir-155基因特异性sgrna向导序列，即sgrna39，其序列如seqidno:1所示；
（2）构建mir-155基因敲除载体，pklv2-u6-grna5(ggfp)-pgkbfp2agfp-w-sgrna39；
（3）将步骤（2）中所述的敲除载体与慢病毒包装质粒pspxa2、pmd2.g，然后稳定转染hek293t细胞，得到包装慢病毒，并将其浓缩；
（4）细胞转染，将步骤（3）中经过浓缩的包装敲除载体的慢病毒感染稳定表达cas9蛋白的猪肺泡巨噬细胞，挑取单克隆细胞，扩大培养成细胞系，通过筛选和验证获得猪mir-155基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系。
进一步地，作为基于crispr/cas9基因编辑系统特异性靶向敲除猪mir-155基因的细胞系的构建方法的进一步优化，步骤（2）中所述基因敲除载体的制备方法包括以下步骤：
（1）将sgrna39的5’端添加caccg，形成正链sgrna序列，即sgrna39f，其序列如seqidno:2所示；将sgrna向导序列反向互补，在5’端添加碱基aaac，形成反链sgrna序列，即sgrna39r，其序列如seqidno:3所示；
（2）将sgrna39f和sgrna39r退火形成双链dna；
（3）步骤（2）所得双链dna与线性化pklv2-u6grna5(ggfp)-pgkbfp2agfp-w载体连接获得重组质粒，即为基因敲除载体，pklv2-u6-grna5(ggfp)-pgkbfp2agfp-w-sgrna39。
进一步地，作为基因敲除载体的制备方法的进一步优化，所述基因敲除载体是根据sgrna39和pklv2-u6-grna5(ggfp)-pgkbfp2agfp-w载体设计pcr引物，进行菌液pcr筛选验证所得，所述检测阳性菌液pcr引物序列为addgene网站推荐的pklv2-u6-grna5(ggfp)-pgkbfp2agfp-w载体测序引物u6-seq-f和seqidno:3所示。
进一步地，作为基于crispr/cas9基因编辑系统特异性靶向敲除猪mir-155基因的细胞系的构建方法的进一步优化，步骤（3）和（4）中所述细胞转染采用jetprime转染试剂的转染步骤；步骤（4）中的筛选和验证方法为：根据猪mir-155基因序列，在敲除靶位点附近设计高特异性引物，用于pcr扩增后t7ei酶酶切以及sanger测序，特异性引物序列为seqidno:4和seqidno:5所示；并根据以下实验结果判断基因敲除情况：（1）细胞培养过程中采用荧光倒置显微镜观察绿色荧光表达情况；（2）采用t7ei酶酶切pcr产物，检测是否有小分子片段产生；（3）采用sanger测序方法对单克隆细胞系的pcr产物进行测序，检测是否有碱基缺失或增添；（4）采用实时荧光定量pcr方法检测各个单克隆系中mir-155-5p/3p的mrna水平的表达情况，与对照组相比是否有降低；（5）采用westernblot方法检测mir-155靶基因ship1蛋白表达，检测是否有增加。
本发明提供的基于crispr/cas9基因编辑系统敲除猪mir-155基因的细胞系应用于猪抗病育种。
本发明提供的基于crispr/cas9基因编辑系统敲除猪mir-155基因的细胞系的构建方法也应用于猪抗病育种。
（三）有益效果
本发明提供了一种基于crispr/cas9基因编辑系统敲除猪mir-155基因的细胞系及其构建方法。本发明采用crispr/cas9基因编辑系统敲除猪肺泡巨噬细胞中mir-155基因序列，建立mir-155敲除的3d4/21细胞系，所述细胞系可用于mir-155基因在猪抗病育种中的功能验证，进一步揭示mir-155基因在疾病抗性中的作用机制。本发明的sgrna向导序列的设计起关键作用，sgrna向导序列会影响单克隆筛选的细胞的敲除效率，本发明所设计的sgrna39序列可对靶基因进行高效敲除；本发明解决了rnai技术存在干扰效率低的缺陷，提供了一种简便高效的构建基因敲除细胞系的方法；选用的载体骨架中带有gfp，便于技术实施过程中对细胞的实时监控；sanger测序结果显示，相比于未敲除细胞系，各单克隆细胞系的测序结果均有缺失或插入，可造成mir-155基因功能缺失，本发明所提供的细胞系是研究mir-155基因功能的理想细胞模型。
附图说明
图1为构建靶向ssc-mir-155的pklv2-u6-grna5(ggfp)-pgkbfp2agfp-w-sgrna39载体示意图；
图2菌液pcr电泳结果图；
图3慢病毒感染3d4-cas9细胞图，其中左图为明场（10×），右图为荧光（10×）；
图4t7ei酶切筛选猪mir-155基因敲除细胞dnapcr产物琼脂糖凝胶电泳检测图；
图5猪mir-155基因敲除细胞dna序列与猪mir-155基因未敲除细胞dna序列对比分析结果；
图6实时荧光定量pcr检测不同单克隆细胞系mir-155-5p/3p的表达情况；其中左图为单克隆细胞系（15#、30#、32#、35#）以及对照组细胞mir-155-5p相对表达量；右图为单克隆细胞系（15#、30#、32#、35#）以及对照组细胞mir-155-3p相对表达量；15#、30#、32#、35#为敲除细胞系；mock为正常细胞（对照组）；*为p<0.05，**为p<0.01；
图7westernblot检测不同单克隆细胞系mir-155靶基因ship1蛋白表达情况；其中图a为westernblot电泳结果图；图b为单克隆细胞系（15#、30#、32#）以及对照组细胞mir-155靶基因ship1蛋白表达量。*为p<0.05，**为p<0.01。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1靶位点的设计和sgrna序列的合成
在mirbase（http://www.mirbase.org/）上获得猪mir-155前体序列及成熟体序列，应用http://crispr.mit.edu/在线设计sgrna向导序列，优选序列为：
sgrna39：5’-aacatgtaggagtcagacggagg-3’（seqidno:1），
具体位置见图1。
在上述sgrna向导序列的5’端添加碱基cacc并去除3’端的pam序列，sgrna93序列的5’端第一个碱基不是g，则添加caccg，，形成正链sgrna序列，即sgrna39f；将sgrna向导序列反向互补，5’端添加碱基aaac，形成负链sgrna序列，即sgrna39r；将sgrna39f和sgrna39r序列退火形成双链dna，该双链dna信息如下：
sgrna39f：5’-caccgaacatgtaggagtcagacgg-3’（seqidno:2）
sgrna39r：5’-aaacccgtctgactcctacatgttc-3’（seqidno:3）
2构建sgrna表达载体
2.1实验方法
（1）将合成后的sgrna39f和sgrna39r序列退火形成双链dna
具体方法为：取浓度为100μm的sgrna39-f/r引物各1μl，再加入8μl的ddh2o轻轻混匀后放置在pcr仪上95℃，10min；65℃，60min。
（2）准备线性化pklv2-u6grna5(ggfp)-pgkbfp2agfp-w载体
将pklv2-u6grna5(ggfp)-pgkbfp2agfp-w质粒按照neb公司的bsmbi限制性内切酶说明书进行酶切，反应组分：bsmbi限制性内切酶1μl，nebuffer3.15μl，pklv2-u6grna5(ggfp)-pgkbfp2agfp-w质粒1μg，补灭菌水至50μl；55℃，15min；酶切结束后，将酶切产物在电压110v，1.5%琼脂糖凝胶电泳30min；电泳结束后，按照sanprep柱式dna胶回收试剂盒（上海生工b518131-0050）说明进行切胶回收，测浓度后备用。
（3）取退火后的双链dna与线性化的pklv2-u6grna5(ggfp)-pgkbfp2agfp-w载体进行连接，得到连接产物
反应体系：1μl的10×t4dnaligasebuffer、1μl的t4dnaligase、1μl双链dna、1μlpklv2-u6grna5(ggfp)-pgkbfp2agfp-w质粒酶切后胶回收产物、6μlddh2o轻轻混匀，16℃连接60min。
（4）取5μl步骤（3）得到的连接产物加入感受态细胞dh5α（购自于takara），移液器吹打混匀，冰上孵育30min；冰浴结束后，将1.5mlep管置于42℃水浴锅中热激90s，接着立即置于冰上2min；在超净工作台中向1.5mlep管中加入400μl的不含抗生素的lb液体培养基，作好标记，放置摇床上设置转速226rpm，温度37℃，时间60min；使大肠杆菌复苏并表达抗性基因；摇完后取下来，放到离心机中配平，4000rpm，离心3min；将其拿到超净工作台，弃去其300μl的上清液，剩下部分吹打混匀；吸取其中的100μl均匀加入到lb固体培养基（含100µg/mlamp）上，用涂布器涂布均匀，作好标记，倒置平板放入37℃培养箱中培养12-16h，直到长出单菌落。
设计pcr测序用检测载体阳性克隆引物：
u6-seq-f：5’-tacgatacaaggctgttagagag-3’
sgrna39r：5’-aaacccgtctgactcctacatgttc-3’（seqidno:3）
（5）菌液pcr：提前对超净工作台进行紫外灯照射杀菌消毒，准备好灭菌1.5mlep管，作好标记，加入1mllb液体培养基（含100µg/mlamp），挑取lb琼脂平板上独立且大小均匀的单菌落，放入lb液体培养基中，在37℃摇床上培养6-8h。向pcr管中添加以下组分：2×q5high-fidelity2×mastermix5μl，u6seq-f0.2μl，sgrna39-r0.2μl，菌液dna0.5μl，灭菌水4.1μl。pcr仪反应程序：预变性95℃，5min；变性95℃，30s；退火60℃，30s；延伸72℃，20s；16℃，2min；从变性到延伸设置32个循环。
2.2试验结果
图2为菌液pcr琼脂糖凝胶电泳检测图，marker为dl2000，图示1-10均为阳性菌落pcr条带，该结果说明获得了阳性敲除载体。
对得到的阳性菌落pcr产物进一步测序验证，测序结果与pklv2-u6grna5(ggfp)-pgkbfp2agfp-w载体和sgrna序列完全一致后，对阳性菌液进行扩大培养，提取无内毒素质粒，备用。另外，准备包装辅助质粒pspxa2、pmd.2g的无内毒素质粒提取，备用。
3慢病毒包装与浓缩
hek293t细胞培养在包含89%dmem＋10
