本发明属于疫苗技术领域，特别涉及一种条件复制型重组单纯疱疹病毒、疫苗及其应用。
背景技术：
单纯疱疹病毒(hsv)是α疱疹病毒亚科中的成员，该亚科中的病毒都具有在神经元中建立潜伏感染的特征，而一、二型单纯疱疹(hsv-1/hsv-2)是其中的人类致病病毒。hsv病毒在人群中广泛存在，对全世界范围内hsv-1/2流行率的预测结果显示，15-49岁区间的人群的hsv1感染率为67％，而hsv-2的感染率约为11.3％，并以每年0.5％的速度增长。hsv-1主要在儿童和青少年时期感染，起始于口腔粘膜上皮细胞的原发感染通常是温和无症状的。原发感染过程中产生的子代病毒会快速进入感染组织的感觉神经末梢，并通过微管依赖的逆向轴突运输将病毒核衣壳运送到细胞体，进而侵入中枢神经系统，最后在三叉神经节中建立终身的潜伏感染状态。而处于潜伏的病毒会在应激条件下不定时的重激活，导致宿主罹患口唇疱疹，有少数严重病例导致疱疹性结膜炎及脑炎。但hsv-1并不仅限于感染面部皮肤粘膜，若原发感染发生于生殖器粘膜及周边皮肤，则会与hsv-2相似，潜伏于骶神经节，并在重激活时引发生殖器疱疹。基于以上描述的hsv带来的危害，开发hsv疫苗或者新型治疗药物是控制hsv感染及传播的关键。目前尚未有可用的hsv疫苗问世，目前在研的疫苗类型有灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、复制缺陷病毒疫苗和核酸疫苗等多种形式。其中减毒活疫苗由于有良好的免疫原性，可诱导有效抗病毒免疫反应，是一种有潜力的疫苗类型。
另外，hsv以其巨大的外源基因承载量、广泛的宿主细胞范围、独特的神经系统嗜性、基因组不会与宿主染色体整合以及存在有效抗病毒药物的特点，赋予了hsv在作为基因递送载体的潜力，目前hsv病毒载体在溶瘤病毒、神经系统基因递送以及病毒载体疫苗等应用领域已经取得了一定的成功。现在由hsv病毒改造衍生而来的hsv病毒载体类型主要分为复制缺陷型载体、扩增子载体以及条件复制型载体三种。
然而无论是减毒活病毒疫苗还是病毒载体，其在易感细胞中的复制能力通常会显著降低，亦或是需要细胞系以提供复制能力。这在hsv减毒活病毒疫苗的生产扩增中存在病毒滴度低，扩增困难的限制。而通过改造细胞系来为重组病毒载体提供高效复制能力则会带来重组风险，并且改造细胞系并不符合对载体生产时细胞基质的要求。因此如何在符合安全标准的前提下提高重组hsv病毒或载体的生产效率是其能够成功施用的前提。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种条件复制型重组单纯疱疹病毒、疫苗及其应用，通过外部条件的变化实现所述重组单纯疱疹病毒复制的条件限制性控制，利用所述重组hsv制备形成的疫苗可有效预防hsv原发性及复发性感染或降低由hsv感染引起的生理病理损伤。此外，本发明将该重组病毒作为载体，递送并表达外源基因，即严重急性呼吸综合征冠状病毒2的刺突蛋白基因后，可作为严重急性呼吸综合征冠状病毒2的疫苗，有效降低严重急性呼吸综合征冠状病毒2感染后机体内的病毒载量及呼吸道炎症。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种条件复制型重组单纯疱疹病毒(hsv)，所述病毒重组单纯疱疹病毒在其基因组内包含：
复制必需基因和去稳定结构域(destabilizationdomain，dd)编码基因嵌合形成的融合基因，以及通过基因组改造技术敲入的外源基因；
所述复制必需基因为hsv病毒内源蛋白，包括ul54在内的一类复制必需基因；所述去稳定结构域编码基因改造于fk506结合蛋白12而来的fkbp12和其同类衍生物；
所述外源基因包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2的刺突蛋白基因。
进一步的，所述单纯疱疹病毒型包括一型和二型人类单纯疱疹病毒及由其改造而来的重组病毒。
本发明的另一目的在于，通过外部条件可逆控制所述重组单纯疱疹病毒度复制，具体方案为：
一种控制上述重组单纯疱疹病毒扩增的方法，其中，在稳定物存在的情况下，在易感细胞上扩增所述重组单纯疱疹病毒；在稳定物不存在的情况下，所述重组单纯疱疹病毒的复制受到抑制。
进一步的，所述易感细胞包括人二倍体胚肺细胞kmb17或非洲绿猴肾细胞vero。
进一步的，所述稳定物包括shield-1及其衍生物，其浓度至少大于等于0.1μm。
本发明的另一目的在于：
一种条件复制型重组单纯疱疹病毒疫苗，所述疫苗包括如上述的条件复制型重组单纯疱疹病毒，以及作为药学上可接受的载体。
进一步的，所述载体包括佐剂。
本发明的另一目的在于：
所述条件复制型重组单纯疱疹病毒的应用，其中，所述重组单纯疱疹病毒未插入外源基因时，作为单纯疱疹病毒疫苗诱导机体产生免疫反应，包括在可感染hsv的群体产生针对抗hsv的免疫反应；当插入外源基因后，又可在使用群体产生针对所述外源基因的免疫反应。
所述条件复制型重组单纯疱疹病毒的另一应用，其中，所述重组单纯疱疹病毒作为外源基因传送载体的应用。所述外源基因包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2的刺突蛋白基因，插入外源基因的hsv重组疫苗可有效诱导机体产生针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2的免疫反应，降低严重急性呼吸综合征冠状病毒2感染后的病理症状。
本发明相比现有技术的有益效果为：
1、相比运用传统基因敲除方法构建病毒载体时由于病毒复制能力降低导致的生产低效。利用去稳定结构域可逆调控病毒内源蛋白表达，在加入稳定物的情况下，实现重组hsv病毒疫苗载体的高效扩增，并且其复制增殖能力与野生型病毒一致；
2、本发明所述条件复制型重组单纯疱疹病毒，在不加入稳定物的情况下施用于可感染hsv的群体，有显著降低的病毒毒性与复制能力；
3、本发明所述条件复制型重组单纯疱疹病毒，在不加入稳定物的情况下施用于可感染hsv的群体，可以有效诱导针对hsv的免疫反应，并对hsv的原发性及复发性感染提供保护作用；
4、本发明所述条件复制型重组单纯疱疹病毒，在通过基因组改造技术敲入外源基因后，在不加入稳定物的情况下在施用与个体后，可以有效诱导针对外源基因的免疫反应，例如针对病原体抗原的免疫反应，为病原体的感染提供保护作用；
5、本发明所述条件复制型重组单纯疱疹病毒，在通过基因组改造技术敲入外源基因后，可以有效作为外源基因递送载体在靶器官组织高效表达外源基因，在作为病原体的病毒载体疫苗进行应用时，在施用群体中能有效诱导针对病原体的免疫反应，为易感群体提供保护作用。
附图说明
图1是本发明所述条件型复制重组hsv病毒示意图；
图2是实施例2所述重组hsv-1病毒1d27或hsv-2病毒2d27的改造示意图；
图3是实施例2提供的利用同源重组构建条件型复制重组hsv-1型病毒1d27的筛选示意图；其中，图3a至3c分别代表三轮病毒嗜斑纯化的pcr检测图像，图3c代表经过3轮病毒嗜斑纯化后筛选到的8个2d27重组病毒克隆；
图4是实施例2提供的利用同源重组构建条件型复制重组hsv-2型病毒2d27的筛选示意图；其中，图4a至4c分别代表三轮病毒嗜斑纯化的pcr检测图像，图4d代表经过3轮病毒嗜斑纯化后筛选到的3个2d27重组病毒克隆；
图5是实施例2提供的条件型复制重组hsv-1型病毒1d27和野生型病毒pcr鉴定图；
图6是实施例2提供的条件型复制重组hsv-1型dd-icp27融合蛋白和宿主细胞β肌动蛋白的表达情况免疫印迹检测图像；
图7是实施例2提供的条件型复制重组hsv-2型病毒2d27和野生型病毒pcr鉴定图；
图8是实施例2提供的条件型复制重组hsv-2型病毒糖蛋白b、dd-icp27融合蛋白和宿主细胞β肌动蛋白的表达情况免疫印迹检测图像；
图9是实施例2提供的在加入或不加入稳定物shield-1时，条件型复制重组hsv-2型病毒2d27和野生型病毒在感染复数为3时的病毒生长曲线示意图；
图10是实施例2提供的在加入或不加入稳定物shield-1时，条件型复制重组hsv-2型病毒2d27分别在感染复数为0.01、0.1以及1时感染48小时后的病毒滴度示意图；
图11是在与图10所示同样感染条件下病毒糖蛋白b、dd-icp27融合蛋白和宿主细胞β肌动蛋白的表达情况免疫印迹检测图像；
图12是实施例2提供的在加入或不加入稳定物shield-1时，条件型复制重组hsv-2型病毒2d27和野生型病毒分别在感染复数为0.01、0.1以及1时感染48小时后的病毒滴度示意图；
图13是实施例2提供的在加入或不加入稳定物shield-1时，条件型复制重组hsv-1型病毒1d27和野生型病毒在感染复数为3时的病毒生长曲线示意图；
图14是实施例2提供的在加入或不加入稳定物shield-1时，条件型复制重组hsv-1型病毒1d27分别在感染复数为0.0005、0.001、0.005以及0.01时感染96小时后的病毒滴度示意图；
图15是实施例2提供的条件型复制重组hsv-1型病毒1d27和野生型病毒分别在加入0、0.01、0.1、0.5和1μm的shield-1时以感染复数为0.001感染96小时后的病毒滴度示意图；
图16是实施例2提供的条件型复制重组病毒1d27和2d27分别在有或无shield-1培养条件下的嗜斑检测图像；
图17是实施例3提供的条件型复制重组病毒1d27或2d27和应的野生型病毒hsv1-zw6或hsv2-hj12以指定噬斑形成单位颅脑攻击小鼠后存活率示意图；
图18是实施例4提供的条件型复制重组hsv-1型病毒1d27在1μmshield-1存在下以感染复数为0.001分别非洲绿猴肾vero细胞及人二倍体胚肺细胞kmb17进行感染后的病毒生长曲线示意图；
图19是实施例5提供的条件型复制重组hsv-1型病毒1d27或磷酸盐缓冲液pbs分别在指定时间点(0周和4周)肌肉免疫小鼠后，再在指定时间(12周)颅脑攻击小鼠的时间示意图；
图20是实施例5提供的条件型复制重组hsv-1型病毒1d27或磷酸盐缓冲液pbs分别在0周和4周肌肉免疫小鼠后，在指定时间利用酶联免疫吸附检测针对hsv-1病毒的结合抗体的示意图；
图21是实施例5提供的条件型复制重组hsv-1型病毒1d27或磷酸盐缓冲液pbs分别在0周和4周肌肉免疫小鼠后，在指定时间利用微量血清中和试验检测针对hsv-1病毒的中和抗体滴度的示意图，lod代表检测下限；
图22、图23分别是实施例5提供的条件型复制重组hsv-1型病毒1d27或磷酸盐缓冲液pbs分别肌肉免疫小鼠后，在免疫12周后利用酶联免疫斑点检测在hsv-1病毒糖蛋白b的肽段刺激后，小鼠脾细胞中分泌伽马干扰素的细胞扫描图、细胞数量示意图；
图24是实施例5提供的条件型复制重组hsv-1型病毒1d27或磷酸盐缓冲液pbs分别在0周和4周肌肉免疫小鼠后，再在免疫后12周颅脑攻击小鼠后的存活率示意图；
图25是实施例6提供的表达绿色荧光蛋白的条件型复制重组hsv-1型病毒1e27构建示意图；
图26是1e27在有或没有shield-1的培养条件下，以感染复数＝0.001感染vero细胞后在指示时间点对感染的细胞进行荧光成像的图像；
图27是同图26相同条件下对病毒糖蛋白b、dd-icp27融合蛋白、宿主细胞β肌动蛋白和绿色荧光蛋白的表达情况免疫印迹检测图像；
图28是实施例7提供的表达sars-cov-2病毒刺突蛋白的条件型复制重组hsv-1型病毒g272构建示意图；
图29是实施例7提供的表达sars-cov-2病毒刺突蛋白的条件型复制重组hsv-1型病毒g272的pcr鉴定图；
图30是实施例7提供的表达sars-cov-2病毒刺突蛋白的条件型复制重组hsv-1型病毒g272感染细胞后刺突蛋白、dd-icp27融合蛋白和宿主细胞β肌动蛋白的表达情况免疫印迹检测图像；
图31是实施例7提供的表达sars-cov-2病毒刺突蛋白的条件型复制重组hsv-1型病毒g272在感染复数为0.001时的病毒生长曲线示意图；
图32是实施例7提供的表达sars-cov-2病毒刺突蛋白的条件型复制重组hsv-1型病毒g272以指定噬斑形成单位颅脑攻击小鼠后存活率示意图；
图33是实施例7提供的表达sars-cov-2病毒刺突蛋白的条件型复制重组hsv-1型病毒g272或条件型复制重组hsv-1型病毒1d27分别在0周和4周肌肉免疫小鼠后，在指定时间利用酶联免疫吸附检测针对s1蛋白的结合抗体的示意图；
图34是在指定时间利用微量血清中和试验检测针对s1蛋白的中和抗体滴度的示意图；
图35是在免疫6周后利用酶联免疫斑点检测在s蛋白刺激后，小鼠脾细胞中分泌伽马干扰素的细胞数量示意图，lod代表检测下限；
图36是实施例7提供的表达sars-cov-2病毒刺突蛋白的条件型复制重组hsv-1型病毒g272或条件型复制重组hsv-1型病毒1d27分别在0周和4周肌肉免疫树鼩后，在指定时间利用酶联免疫吸附检测针对s1蛋白的结合抗体的示意图；
图37是在指定时间利用微量血清中和试验检测针对s1蛋白的中和抗体滴度的示意图，lod代表检测下限；
图38是实施例7提供的表达sars-cov-2病毒刺突蛋白的条件型复制重组hsv-1型病毒g272或条件型复制重组hsv-1型病毒1d27分别在0周和4周通过肌肉和鼻腔同时免疫恒河猴后，在指定时间利用酶联免疫吸附检测针对s1蛋白的结合抗体的示意图；
图39是在指定时间利用微量血清中和试验检测针对s1蛋白的中和抗体滴度的示意图；
图40是在免疫6周后利用酶联免疫斑点检测在s蛋白刺激后，外周血淋巴细胞中分泌伽马干扰素和白介素4的细胞数量示意图，lod代表检测下限；
图41是实施例7提供的表达sars-cov-2病毒刺突蛋白的条件型复制重组hsv-1型病毒g272或条件型复制重组hsv-1型病毒1d27通过肌肉和鼻腔同时免疫恒河猴6周后，恒河猴接受了sars-cov2攻击，并隔日检测鼻腔拭子和咽喉拭子样本中的病毒rna含量，lod代表检测下限。
具体实施方式
下面将结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，本发明通过将去稳定结构域dd编码基因fkbp在氮末端与病毒复制必需基因融合后改造的重组hsv病毒，在加入稳定物shield-1后融合蛋白的表达稳定并持续累积，进而保证病毒稳定复制。在不加入稳定物shield-1时融合蛋白被迅速降解导致病毒复制被抑制。因此在体外细胞或者体内组织可通过加入或不加入稳定物shield-1的条件下，控制病毒的复制增殖。
实施例1——去稳定结构域dd编码基因fkbp12与病毒复制必需基因融合的一、二型重组hsv病毒1d27和2d27的构建与筛选
如图2，图2a、图2b分别是将去稳定结构域基因fkbp与hsv-1-zw6或hsv-2hj12病毒株中的ul54基因在氮末端嵌合构建条件型复制重组hsv-1病毒1d27或hsv-2病毒2d27的改造示意图。
本实施例运用病毒dna改造技术中的crispr-cas9系统结合同源重组策略，将去稳定结构域dd编码基因fkbp12与病毒复制必需基因融合，改造病毒基因组，具体步骤为：
1、基因位点的选择及相应质粒的构建
(1)cas9蛋白酶切割位点的选择：分别在一型单纯疱疹病毒zw6株或二型单纯疱疹病毒-hj12株的毒株进行操作，此毒株自临床患者疱液中分离扩增并常规保存。通过crispor预测软件扫描zw6病毒(genbank序列号：kx424525.1)或hj12病毒全基因组序列(genbank序列号：mn187895)中的ul54基因序列氮末端起始密码子附近，带有ngg(n为任意一个核苷酸序列，g代表鸟嘌呤)的基因位点，然后找到该基因位点五末端20个碱基的序列，此即为grna序列，此例中选择的序列具体为tcaatgtcagttgccatgaccgg(zw6)或aatgtcggtagccatgttgtagg(hj12)；
(2)构建crispr-cas9系统表达载体：根据上步筛选的grna序列合成引物，将合成后的序列退火连接，然后将载体px330用核酸内切酶bbsi酶切后的片段用1％质量体积比的琼脂糖凝胶电泳分离后的片段胶回收，将退火产物与回收的载体连接后转化大肠杆菌，提取质粒后测序鉴定，构建crispr-cas9系统表达质粒；(px330载体购自美国addgene公司，编号为42335)；
对于zw6病毒，合成序列具体序列为：
正向引物(hi007)：caccgtcaatgtcagttgccatgac；
反向引物(hi008)：aaacgtcatggcaactgacattgac；
对于hj12病毒，合成序列具体序列为：
正向引物(g156)：caccgaatgtcggtagccatgttgt；
反向引物(g157)：aaacacaacatggctaccgacattc；
(3)构建去稳定结构域dd编码基因fkbp同源重组供体质粒：将体外提取的zw6或hj12病毒基因组为模板用q5高保真dna聚合酶(美国neb公司)以左右端同源臂扩增引物进行扩增，获取长度各为1000kb的同源重组外源基因供体质粒的左右端同源臂，然后以含有去稳定结构域dd编码基因fkbp基因的质粒pcw964为模板用q5高保真dna聚合酶扩增fkbp基因，将扩增后的片段用回收试剂盒回收后利用多片段同源连接试剂盒(南京诺唯赞公司)进行连接后转化大肠杆菌，提取质粒后测序鉴定，构建得到fkbp基因同源重组供体质粒。
构建fkbp基因同源重组供体质粒，设计的引物具体为：
对于zw6病毒：
左端同源臂扩增引物：
正向引物(g384)：
aagagcggtctcacccgtggtgctcgtggcgcttcact；
反向引物(g385)：
aagagcggtctcaccatgaccgggcggtcggct；
fkbp基因扩增引物：
正向引物(g320)：aagagcggtctcaatgggagtgcaggtggaaacca；
反向引物(g321)：aagagcggtctcaggatccttccggttttagaagct；右端同源臂扩增引物：
正向引物(g386)：
aagagcggtctcaatccatggcaactgacattgatatgctaat；
反向引物(g387)：
aagagcggtctcacacaaaggggtcgtgcatgacctgt；
对于hj12病毒：
左端同源臂扩增引物：
正向引物(g110)：
aacttacggtaaatggcccgtacgccggccgcatagtgtcg；
反向引物(g111)：
acctgcactcccatggtggcgttgtaggtcgccggggctgg；
fkbp基因扩增引物：
正向引物(g104)：gccaccatgggagtgcaggtggaa；
反向引物(g105)：ggatccttccggttttagaagctccac；
右端同源臂扩增引物：
正向引物(g112)：
ttctaaaaccggaaggatccatggctaccgacattgatatgctaatc；
反向引物(g113)：
atgagtttggacaaaccacagaccagggtttcccaggaaacc。
2、质粒的共转染及野生型病毒的感染
对于不同型别的重组病毒构建，取0.5μg的对应型别的crispr-cas9系统表达载体，与0.5μg的相对应的fkbp基因同源重组供体质粒混合，用转染试剂jetprimetm(法国polyplus公司)转染至接种至12孔板的hek293t细胞中，24小时后分别取感染复数(moi)＝1的hsv1-zw6或hsv2-hj12病毒进行感染，2小时后换液为含2％胎牛血清的dmem培养基。感染后48小时收集病毒液，分装冻存于-80℃冰箱。
3、重组病毒的挑取与筛选
将收集的病毒根据不同的稀释度稀释，加入到接种至6孔板的vero细胞中，2小时后覆盖上含有1μmshield-1及1％琼脂糖的mem培养基。待3天后出现明显噬斑后，挑取噬斑数在20至200个左右的孔，用10μl移液器吸头垂直刺入琼脂糖层，按动移液器吸取两次挑出病毒，然后用移液器吹吸3-5次来感染预先传到96孔中的vero细胞，感染前将细胞培养基换为200μl含有1μmshield-1的2％胎牛血清的mem。在大约感染48小时后，80％细胞就会出现明显病变效应时，此时吸取50μl细胞上清液用于提取病毒基因组用2xrapidpremix(vazyme)进行pcr鉴定，同时用野生型病毒基因组作为扩增的对照。
对于zw6病毒，用于pcr鉴定的引物为：
正向引物(g390)：aacgaggaggggtttgggagag；
反向引物(g391)：cctctccgtgggggtcttcca；
对于hj12病毒，用于pcr鉴定的引物为：
正向引物(g317)：gacaaggaggagtttcggaaagccg；
反向引物(g210)：gacgggggttggatgcgg。
当挑取的病毒液中无法检测到野生型病毒条带并且能检测到dd-ul54重组片段条带时，标记该孔并将孔中的病毒分装为2管收获冻存于-80℃。通过3轮重复的嗜斑筛选纯化，获得纯化的一型重组hsv病毒1d27和二型重组hsv病毒2d27，如图3、图4所示。将纯化扩增后的病毒以moi＝3感染前一天接种至12孔板的3×10e5个vero细胞中。在感染24h时弃除培养基上清液，加入细胞裂解液ripa裂解病毒感染的细胞样品，用蛋白免疫印迹检测dd-ul54融合蛋白的表达。如图5-图8结果显示，利用抗dd抗体，在感染重组病毒2d27的细胞裂解液中检测到了dd-ul54融合蛋白的表达，其大小约为80千道尔顿，和预期相符。证明了重组病毒中dd和icp27(ul54编码基因)的融合蛋白的表达。
实施例2——重组hsv病毒1d27和2d27的条件型增殖特性
分别将二型病毒hsv2-hj12和重组病毒2d27以moi＝3分别感染前一天接种至12孔板的3x10e5个vero细胞中，分别培养于含有或不含有1μmshield-1，之后将不同时间点收集的野生型病毒和重组病毒样品感染至前一天接种至12孔板的3x10e5个vero细胞在含有1μmshield-1的dmem培养基中测定滴度，鉴定其生长特性。
如图9结果显示，含有1μmshield-1的培养条件下，野生型病毒和重组hsv病毒2d27的增殖动力学曲线大致相同；如图10所示，而在不含有shield-1的培养条件下，重组hsv病毒2d27的滴度下降大约1.5个log10噬斑形成单位每毫升；而在不含有shield-1的培养条件下用2d27以moi＝0.01感染vero细胞，则无子代病毒产生，说明重组病毒2d27的条件复制特性。如图11所示，通过蛋白质免疫印迹检测，重组病毒中dd-icp27融合蛋白的表达在moi＝0.01时无法检测到，表明重组病毒2d27复制抑制由dd-icp27融合蛋白的迅速降解导致。另外，如图12所示，将2d27以moi＝0.01感染vero细胞，在含有0、0.001、0.01、0.1、0.5和1μmshield-1的dmem培养基中继续培养48小时后检测细胞及培养基上清中子代病毒滴度，结果显示在shield-1浓度小于等于0.01μm时则同样无子代病毒产生。
同样的，如图13、14所示，在不含有shield-1的培养条件下，1d27在moi＝3时感染细胞后，子代病毒的滴度下降大约3个log10噬斑形成单位每毫升。而在moi＝0.001时感染细胞则无子代病毒产生。如图15所示，当shield-1浓度达到1μm时，1d27的复制能力与野生型病毒基本一致。
如图16所示，1d27/2d27以相同稀释度感染vero细胞后，分别在含有或不含有1μmshield-1的1.25％甲基纤维素培养基中培养4天，之后对同一稀释度下病毒嗜斑进行成像。同时在不含有1μmshield-1的1.25％甲基纤维素培养基中培养的hsv1-zw6和hsv2-hj12嗜斑图像作为对照。与2d27一致的是，在对同一个病毒样品进行滴度嗜斑检测时，不加药组孔中无法观察到病毒嗜斑形成。这些结果表明，通过dd对icp27的调控可以抑制hsv病毒的复制。
实施例3——重组hsv病毒1d27和2d27的神经毒力检测
由于hsv是一种嗜神经病毒，具有强神经毒性，因此通过病毒在小鼠上进行颅脑注射可以检测病毒在动物体内的神经毒性。将野生型病毒hsv1-zw6、hsv2-hj12和重组病毒1d27、2d27分别以指定噬斑形成单位颅脑注射4至6周龄c57/b小鼠(每组5只)后，统计注射后小鼠生存率，同时以注射磷酸盐缓冲液pbs的小鼠作为对照组。如图17结果显示，注射重组病毒1d27和2d27与注射pbs的小鼠在至少14天内仍然存活，而分别注射了大于等于1x10e4噬斑形成单位或1x10e3噬斑形成单位的hsv1和hsv2野生型病毒的小鼠则在6天内完全死亡，说明重组病毒1d27和2d27的神经毒力较野生型病毒明显下降。
实施例4——hsv-1条件型复制重组病毒1d27在传代细胞与二倍体细胞上的增殖能力比较
条件型复制hsv-1重组病毒1d27在含有1μmshield-1的培养条件下，以moi为0.001分别感染非洲绿猴肾上皮细胞(vero)或者人胚肺二倍体细胞(kmb17)，如图18结果显示，在可复制条件下重组病毒1d27的增殖能力在传代细胞(vero)与二倍体细胞(kmb17)间没有显著性差异。
实施例5——应用hsv-1条件型复制重组病毒1d27诱导抗hsv病毒免疫反应
通过在4至6周龄c57/b小鼠中施用hsv-1条件型复制重组病毒1d27，检测其诱导抗hsv病毒免疫反应效果。分别在0周与4周用hsv-1条件型复制重组病毒1d27以2x10e6噬斑形成单位对小鼠进行后腿肌肉免疫，并在指定时间分别利用酶联免疫吸附实验、微量血清中和试验、酶联免疫斑点实验检测针对hsv-1病毒的结合抗体、中和抗体滴度、hsv-1病毒糖蛋白b的肽段刺激后小鼠脾细胞中分泌伽马干扰素的细胞数量，通过以上三个指标探究施用重组病毒后诱导的抗hsv病毒免疫反应。结果如图19-图24所示。
通过两次免疫1d27，针对hsv-1病毒的结合抗体能有效被诱导，并在至少3个月内保持较高水平；而中和抗体滴度在第二次免疫后由一次免疫后的平均1:48上升至1:128-1:256之间。在免疫后12周分离小鼠脾细胞中的外周淋巴细胞，用hsv-1病毒糖蛋白b的肽段进行刺激，能够激活大量外周淋巴细胞分泌伽马干扰素。
在免疫后12周，分别对施用了重组病毒1d27或者pbs的小鼠进行野生型病毒的颅脑攻击(剂量为1x10e4噬斑形成单位)，施用了重组病毒1d27的小鼠在攻击后6天后存活率为100％，而施用了pbs的小鼠则全部死亡。
实施例6——基于hsv-1条件型复制重组病毒1d27构建表达外源基因的病毒载体
本实施例运用病毒dna改造技术中的非同源敲入策略(专利号公开号：cn108913684a)，将绿色荧光蛋白(egfp)编码基因敲入条件型复制重组病毒1d27基因组的ul23基因区域，构建表达egfp的病毒载体1e27，如图25所示。
如图26所示，当1e27重组病毒以感染复数为0.001感染细胞后，在加药培养的细胞能观察到egfp的大量表达且细胞出现明显细胞病变效应，而相比在不加药培养的细胞中能检测到egfp信号但无明显细胞病变被观察到。如图27的蛋白质印迹检测结果显示，在加入shield-1的情况下，病毒糖蛋白b、dd-icp27融合蛋白和绿色荧光蛋白从感染12小时后开始大量表达。而不加入shield-1的则在感染24小时后才能检测到少量病毒蛋白，而egfp的表达时间和水平在两组之间几乎一致，说明重组病毒1e27中的egfp可以在病毒不复制或低水平复制的情况下持续高效表达，提示1d27具有成为携带大片段外源基因重组病毒载体的潜力。
实施例7——针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的条件型复制重组hsv-1病毒载体疫苗的构建与应用
本实施例运用实施例6中所述的非同源敲入策略，如图28所示，将sars-cov-2病毒基因组的刺突蛋白(spike,s)编码序列敲入条件型复制重组病毒1d27基因组的ul23基因区域，构建表达s蛋白的病毒载体g272并检测其免疫原性，具体步骤为：
1、刺突蛋白编码序列质粒的构建
(1)将非同源敲入双切点供体质粒载体pcw708和带有人密码子优化后的s蛋白表达盒序列的载体pcw1059分别用nhei和noti酶切3小时后凝胶回收载体片段(3511bp)和s蛋白表达盒序列片段(3895bp)，将回收片段按如下体系在16℃下用t4连接酶连接，构建双切点s蛋白基因供体质粒pcw1067。
2、表达s蛋白的病毒载体g272的构建
运用实施例1中2、3所述的构建筛选方法，结合pcr鉴定经过3轮嗜斑筛选过程，获得纯化后的重组病毒g272单克隆，如图29所示；
用于pcr鉴定的引物为：
正向引物(n332)：ccatcccgtggggaccgtctatat；
反向引物(n333)：caacagcgtgccgcagatcttggt；
如图30所示，通过蛋白质免疫印迹，在感染了重组病毒g272的细胞裂解液中检测到了dd-icp27融合蛋白和s蛋白的表达，确认了重组病毒g272的成功构建。
3、表达s蛋白的病毒载体g272的条件型增殖特性鉴定
分别将野生型病毒hsv1-zw6和重组病毒g272以moi＝0.001分别感染前一天接种至12孔板的3x10e5个vero细胞中，分别培养于含有或不含有1μmshield-1，之后将不同时间点收集的野生型病毒和重组病毒样品感染至前一天接种至12孔板的3x10e5个vero细胞在含有1μmshield-1的dmem培养基中测定滴度，如图31所示结果显示，在不含有shield-1的培养条件下无子代病毒产生。
4、表达s蛋白的病毒载体g272的神经毒力检测
将野生型病毒hsv1-zw6、和重组病毒g272分别以指定噬斑形成单位颅脑注射4至6周龄c57/b小鼠(每组5只)后，统计注射后小鼠生存率，同时以注射磷酸盐缓冲液pbs的小鼠作为对照组。如图32结果显示注射1x10e4噬斑形成单位的hsv1-zw6小鼠在5天内完全死亡而注射高达1x10e7噬斑形成单位重组病毒g272的小鼠在至少14天内仍然存活，说明重组病毒g272的神经毒力同样有明显下降。
5、表达s蛋白的病毒载体g272的免疫原性检测
分别在小鼠、树鼩与恒河猴中免疫g272后，检测体内产生的针对s蛋白的免疫反应。各动物分别在第0周及4周接受两次免疫，雌性4-6周龄c57b/c小鼠以后腿肌肉免疫的方式免疫剂量为2x10e6噬斑形成单位的g272，每组6只。雄性1岁龄树鼩以后腿肌肉免疫的方式免疫g272，剂量为1x10e7噬斑形成单位，每组3只。雄性1岁龄恒河猴以前肢与滴鼻组合免疫的方式免疫g272，剂量为2x10e7噬斑形成单位，每组3只。与此同时，均设置了免疫重组病毒1d27的对照组。在指定时间分别利用酶联免疫吸附实验、微量血清中和试验、酶联免疫斑点实验检测针对hsv-1病毒的结合抗体、中和抗体滴度、刺突蛋白刺激后小鼠脾细胞或恒河猴外周血淋巴细胞中分泌伽马干扰素的细胞数量，通过以上三个指标探究施用重组病毒g272后诱导的抗s蛋白免疫反应。结果如图33-图40所示。
免疫g272后，小鼠体内s1蛋白的特异性抗体在第一次免疫后被检测到，并在二次免疫后大幅提高。免疫第六周的小鼠血清中sars-cov2活病毒的平均中和抗体水平到达了1：35另外，使用s蛋白刺激小鼠脾细胞后检测了大量脾脏淋巴细胞分泌伽马干扰素。而树鼩体内s1蛋白特异性抗体及中和抗体都在二次免疫后被检测到，其中sars-cov2活病毒的平均中和抗体水平分别达到1：138。最后，恒河猴中s1蛋白特异性抗体水平在二次免疫后显著提升，同时sars-cov2活病毒的平均中和抗体水平接近1:64。最后，通过elispot检测到经s蛋白刺激后，恒河猴外周血淋巴细胞分泌伽马干扰素和白介素4。这些结果说明表达s蛋白的病毒载体g272能够在施用个体中诱导有效体液免疫及细胞免疫。
6、免疫重组病毒g272的恒河猴对病毒感染的抵抗效果
如图41所示，在免疫后第六周，对免疫g272及1d27的恒河猴通过滴鼻途径攻击sars-cov2，剂量为1e 06pfu。在攻毒后第1、3、5和7天对鼻腔拭子和咽喉拭子样品中病毒rna进行绝对定量检测以反映重组病毒g272对免疫恒河猴的保护效果。在感染sars-cov21天后，在所有恒河猴的鼻腔拭子和咽喉拭子样品中都能检测到病毒基因组rna，但rna水平在感染3天后快速大量下降。在第四天进行二次感染后，免疫了g272的恒河猴鼻腔拭子和咽喉拭子样品rna水平明显下降外，而免疫了重组病毒1d27的恒河猴鼻腔拭子和咽喉拭子样品rna拷贝数迅速升高并维持稳定的较高水平。该结果展现了免疫重组病毒g272的恒河猴对病毒感染的抵抗效果。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
1.一种条件复制型重组单纯疱疹病毒(hsv)，其特征在于，所述重组单纯疱疹病毒在其基因组内包含：
复制必需基因和去稳定结构域编码基因嵌合形成的融合基因；
所述复制必需基因为hsv病毒内源蛋白，包括ul54在内的一类复制必需基因；所述去稳定结构域编码基因改造于fk506结合蛋白12而来的fkbp12和其同类衍生物。
2.根据权利要求1所述的条件复制型重组单纯疱疹病毒，其特征在于，所述hsv的基因组内还包括通过基因组改造技术敲入的外源基因，所述外源基因包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2的刺突蛋白基因。
3.根据权利要求1或2所述的条件复制型重组单纯疱疹病毒，其特征在于，所述单纯疱疹病毒型包括一型和二型人类单纯疱疹病毒及由其改造而来的重组病毒。
4.一种控制如权利要求1-3任一项所述重组单纯疱疹病毒扩增的方法，其特征在于，在稳定物存在的情况下，在易感细胞上扩增所述重组单纯疱疹病毒；在稳定物不存在的情况下，所述重组单纯疱疹病毒的复制受到抑制。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述易感细胞包括人二倍体胚肺细胞(kmb17)或非洲绿猴肾细胞(vero)。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述稳定物包括shield-1及其衍生物，其浓度至少大于等于0.1μm。
7.一种条件复制型重组单纯疱疹病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗包括如权利要求1-3任一项所述的重组单纯疱疹病毒，以及作为药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述载体包括佐剂。
9.如权利要求1-3任一项所述条件复制型重组单纯疱疹病毒的应用，其特征在于，所述重组单纯疱疹病毒未插入外源基因时，作为单纯疱疹病毒疫苗诱导机体产生免疫反应，包括在可感染hsv的群体产生针对抗hsv的免疫反应；当插入外源基因后，又可在使用群体产生针对所述外源基因的免疫反应。
10.如权利要求2或3所述条件复制型重组单纯疱疹病毒的应用，其特征在于，所述重组单纯疱疹病毒作为外源基因传送载体的应用。
技术总结