本发明涉及一种baeyer-villiger单加氧酶及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
baeyer-villiger单加氧酶(bvmo)属于黄素蛋白单加氧酶的一个分支，除了催化羰基的亲核氧化，还能实现杂原子的亲电氧化，主要以含硼、硒、硫等杂原子的有机化合物为主。由于其底物谱宽这一特性，在工业催化中得到了广泛应用。
光学活性亚砜作为一种重要的手性化合物，在化学合成工业的几乎每个领域都有很大的需求而吸引了众多关注，涉及到新型合成试剂、药物和功能材料的设计与开发。
手性亚砜作为一类极其有用的化合物，在不对称合成和医药领域具有广泛而重要的应用。通过化学方法很难实现硫醚的选择性亚砜化，因此酶介导的选择性亚砜化在过去几十年来都是有机化学家关注的热点之一。目前，许多酶和微生物整细胞作为催化剂已经被成功地用来催化合成手性亚砜，成为化学法的有益补充，其优点可以概括为更高的立体选择性。这主要是由于酶对底物的专一性识别作用、环境相容性和安全性。生物催化剂通常为微生物、植物以及动物细胞或者分离得到的酶，这些都是可再生的，使用后在环境中很容易降解，对环境没有污染。生物催化过程的反应条件温和，通常以水作为溶剂体系，比使用有机溶剂和有毒催化剂的化学法安全得多。正是由于生物催化的这些优势，利用生物法合成手性亚砜受到了越来越多的关注。关于手性亚砜生物法合成的报道也是从易制得的前体硫醚出发，经过微生物整细胞或者游离的酶对其进行氧化加氧反应，得到光学纯的亚砜。例如，adam等人以苯甲硫醚为唯一碳源，通过富集培养从土壤中筛选出了一株菌株，然后用其整细胞对一系列芳基烷基硫醚进行了不对称氧化，生成的亚砜产物为s构型，最高的ee值高达以上99％，但是其对底物的耐受性很低，底物浓度只有1mm。而利用具有bv单加氧酶活性的菌株对一系列的苯基烷基硫醚和对甲基苯基烷基硫醚进行氧化时，可以生成s构型的产物，但ee值都很低(《ahighlyenantioselectivebiocatalyticsulfoxidationbythetopsoilbacteriumpseudomonasfrederiksbergensis》，公开于2004年)。后续有研究更加深入地报道了真菌对前手性硫醚的不对称氧化，包括芳基烷基硫醚、节基烷基硫醚、杂芳基烷基硫醚以及二烷基硫醚等等；几乎对所有硫醚的氧化都生成s构型的产物，ee值大于80％，得率大于79％(holland等，《biotransformationofsulfidesbyrhodocoeccuserythropolis》，公开于2003年)。众所周知，微生物整细胞中起催化作用的归根结底还是各种酶，而目前能立体选择性氧化硫醚生成相应亚砜(或砜)的酶主要有过氧化物酶和单加氧酶。其中，辣根过氧化物酶、钒加卤酶和氯过氧化物酶等催化一系列脂肪族和芳香族硫醚的氧化已经得到研究，但是产物的对映体纯度并不能达到要求。不同来源的过氧化物酶催化硫醚的不对称亚砜化反应，存在底物上载量低、产物ee值低等问题。
ε-己内酯作为一种重要的有机合成中间体，可以合成聚己内酯或与淀粉等物质共混改性，其应用也是非常广泛的。ε-己内酯的合成在生产的安全性以及产品的稳定性等方面有一定的难度，合成技术难度较大。随着己内酯用途的不断扩大，市场需要越来越大，有关ε-己内酯的研究也日趋受到广大科研工作者的重视。根据ε-己内酯的合成工艺和原料的不同，ε-己内酯的合成方法有1,6-己二醇脱氢法、6-羟基己酸分子内缩合法、己二酸酸化法、环己酮氧化法等。无论是从原料，还是从反应装置以及反应条件等各个因素考虑，环己酮氧化法都是目前最为有效的方法，也是当前工业化生产ε-己内酯的方法。传统的ε-己内酯生产使用过氧酸法，但是过氧酸在运输及存储过程中存在极大的安全隐患，反应产生大量废酸，容易造成环境污染。
生物氧化法是指采用生物酶或者是微生物发酵氧化环己酮合成ε-己内酯的一种方法。酶具有高效性和专一性的特点，因此利用生物酶氧化法具备其特有的优势。chmo是环己酮单氧酶的简称，已有报道采用生物酶作为催化剂催化氧化环己酮的baeyer-villiger氧化反应。已有报道使用醋酸钙不动杆菌催化环己酮氧化反应，发现可以提高环己酮的氧化反应速率(mandal等《biocatalytictransformationofcyclohexanonebyfusariumsp》，公开于2002年)。虽然使用白地霉菌ncyc49可以有效的催化环己酮的baeyer-villiger氧化反应，ε-己内酯的收率最高能够达到90％以上，但是对于反应体系中氧气浓度要求高，需要在严格控制在高浓度氧气反应体系中进行(carballeira等《biotransformationofcyclohexanoneusingimmobilizedgeotrichumcandidumncyc49factorsaffectingtheselectivityoftheprocess》公开于2004年)。并且，采用单胞菌属催化环己酮氧化时，环己酮的转化率以及ε-己内酯的收率都不高(郑爱芳等《由环己酮生物合成己内酯的研究》，公开于2006年)。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是针对已经报道的baeyer-villiger单加氧酶的对底物硫醚的低催化活性，热稳定性差、产物ee值低、环己酮转化率及产物收率不高等问题，提供另外一种baeyer-villiger单加氧酶，该酶所具有的良好的可溶性，对线性酮、环酮和硫醚底物表现出的高立体选择性，并对环己酮和苯甲硫醚所具有的高催化活性，能够直接有效解决目前单加氧酶所存在的问题。
本发明的第一个目的是提供一种制备光学活性亚砜的方法，所述方法是以氨基酸序列如seqidno.2所示的单加氧酶为催化剂，以硫醚为底物。
在本发明的一种实施方式中，编码所述单加氧酶的核苷酸序列如seqidno.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述光学活性亚砜包括苯甲亚砜、对氯苯甲亚砜、对甲氧基苯甲亚砜、对氨基苯甲亚砜。
在本发明的一种实施方式中，以苯甲硫醚为底物，催化生成s-苯甲亚砜。
在本发明的一种实施方式中，苯甲硫醚在反应体系中的浓度为30-100mmol·l-1。
在本发明的一种实施方式中，所述单加氧酶以30-100ku·l-1的量添加至反应体系中。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中还含有醇脱氢酶酶和甲醇。
在本发明的一种实施方式中，葡萄糖脱氢酶的添加量为10-100ku·l-1。
在本发明的一种实施方式中，甲醇在反应体系中的浓度为3-8％。
在本发明的一种实施方式中，在反应体系中加入tris-hcl缓冲液以维持ph，tris-hcl缓冲液的浓度为50-150mmol·l-1。
在本发明的一种实施方式中，在25-40℃下反应2-30h。
本发明的第二个目的是提供单加氧酶在制备s-苯甲亚砜中的应用，所述单加氧酶的氨基酸序列如seqidno.2所示。
在本发明的一种实施方式中，以苯甲硫醚为底物，以所述单加氧酶为催化剂，制备s-苯甲亚砜。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中还含有醇脱氢酶。
本发明的第三个目的是提供一种制备ε-内酯中的方法，以单加氧酶为催化剂，所述单加氧酶的氨基酸序列如seqidno.2所示。
在本发明的一种实施方式中，以环己酮为底物。
在本发明的一种实施方式中，环己酮的浓度为50-200mmol·l-1。
在本发明的一种实施方式中，所述单加氧酶的添加量为10-50ku·l-1。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中还含有醇脱氢酶和甲醇。
在本发明的一种实施方式中，所述醇脱氢酶包括葡萄糖脱氢酶，在反应体系中加入20-50ku·l-1的葡萄糖脱氢酶。
在本发明的一种实施方式中，甲醇在反应中的浓度为3-8％。
在本发明的一种实施方式中，在ph8-10、25-35℃下反应。
本发明还提供所述方法在制备光学活性亚砜中的应用。
本发明还提供所述方法在制备ε-内酯中的应用。
有益效果：本发明提供了一种baeyer-villiger单加氧酶可作为催化剂应用于备光学纯s-苯甲亚砜，该酶可溶性好、适用的反应条件温和、环境友好。本发明的baeyer-villiger单加氧酶催化效果佳，底物适用性广，能够催化环酮、硫醚，并且能够耐受高浓度的底物。可将高浓度苯甲硫醚转化成s-苯甲亚砜，转化率可达95％以上，立体选择性强(e.e.>96％)，为工业化大规模生产光学活性亚砜提供了一种新的方法，具有很好的应用开发前景。
附图说明
图1为pet28a-rabvmo重组质粒物理图谱。
图2为重组baeyer-villiger单加氧酶的蛋白电泳图；m，marker；泳道1、2、3分别为重组基因工程菌bl21(de3)/pet28a-rabvmo诱导后上清、沉淀及纯酶。
图3为baeyer-villiger单加氧酶的选择性分析液相检测图。
具体实施方式
实施例1：重组大肠杆菌的构建
化学合成核苷酸序列如seqidno.1所示的baeyer-villiger单加氧酶编码基因序列，将其命名为rabvmo，所编码的蛋白质的氨基酸序列如seqidno.2所示。
用限制性内切酶ndei和bamhi将质粒pet28a酶切后和rabvmo的核苷酸片段，通过t4dna连接酶将基因rabvmo与酶切过的质粒pet28进行连接，即得重组表达载体pet28a-rabvmo(图1)。将构建好的重组表达载体pet28a-rabvmo转入大肠杆菌bl21(de3)感受态中，涂布含卡那霉素抗性lb固体平板，过夜培养后进行菌落pcr验证，阳性克隆子即为重组大肠杆菌bl21(de3)/pet28a-rabvmo。挑取阳性克隆子于lb培养基中过夜培养，次日按1ml/100ml转接量转接入新鲜lb培养中，培养至od600达到0.6～0.8时，加入0.2mmol·l-1iptg，30℃诱导培养6小时后，4℃、8000r/min离心10min收集菌体。将收集好的菌体悬浮于磷酸钾缓冲液(100mmol·l-1，ph8.0)中，超声破碎，并通过sds-page分析蛋白的表达情况(图2)。
由图2可知，目的蛋白全部都在上清中，说明重组酶在大肠杆菌中成功得到可溶表达。
实施例2：baeyer-villiger单加氧酶的性质
(1)baeyer-villiger单加氧酶的分离纯化
悬浮重组细胞于a液(20mmol·l-1磷酸钠，500mmol·l-1nacl，20mmol·l-1咪唑，ph7.4)中，超声波破碎离心后获得粗酶液。纯化所使用的柱子为亲和柱histrapffcrude(镍柱)，利用重组蛋白上的组氨酸标签进行亲和结合来完成。首先使用a液将镍柱平衡，粗酶液上样，继续使用a液将穿透峰洗脱下来，待平衡后用b液(20mmol·l-1磷酸钠，500mmol·l-1nacl，1000mmol·l-1咪唑，ph7.4)进行梯度洗脱，将结合到镍柱上的重组蛋白洗脱下来，获得重组baeyer-villiger单加氧酶。对纯化后的蛋白进行酶活测定(苯甲硫醚为底物)及sds-page分析(图2)。由图2可知，镍柱纯化后，在61kda左右显示单条带，且杂蛋白较少，说明镍柱纯化效果较好。之后使用hitrapdesalting脱盐柱(gehealthcare)将纯化后的环己酮单加氧酶置换到tris-hcl(100mmol·l-1，ph9.0)缓冲液中，进行下一步酶学性质分析。
(2)baeyer-villiger单加氧酶的酶活力测定
测定baeyer-villiger单加氧酶对底物苯甲硫醚的酶活力。测定体系为：适量酶液、5mmol·l-1苯甲硫醚。于30℃静置反应15min。反应结束后，取样进行液相检测。液相检测条件：色谱柱为手性od-h色谱柱(250mm×4.6mm×5μm)，流动相为正己烷：异丙酮(90：10)，流速为0.2～1ml·min-1,检测波长为254nm。
酶活力单位定义(u)：
在30℃下，baeyer-villiger单加氧酶催化底物苯甲硫醚生成1μmol的苯甲亚砜所需要的酶量，定义为一个酶活力单位(u)。
(3)底物谱分析
测定baeyer-villiger单加氧酶(rabvmo)催化不同的硫醚的酶活力，以苯甲硫醚为底物测得的酶活为100％对照，其他底物测得的酶活力以二者的百分比计算。测定结果如表1所示。
表1rabvmo的底物谱
表1显示，rabvmo底物谱很广泛，能够催化硫醚，环酮及线性酮，分别生成亚砜、内酯和酯。
(4)酶的最适ph
配制100mmol·l-1不同ph的缓冲液：磷酸缓冲液(ph6.0～9.0)、tris-hcl(8.0～9.0)、甘氨酸–naoh缓冲液(ph9.0～11.0)。然后以苯甲硫醚为底物，测定rabvmo在不同ph缓冲液的相对酶活力。rabvmo的最适反应ph为tris-hcl，8.0-9.0，酶活力为0.31-0.92u·mg–1。在ph为1.0～11的甘氨酸–naoh缓冲液中，酶活降至25％以下。
(5)酶的最适温度
分别以苯甲硫醚为底物，测定rabvmo在不同温度(20～55℃)下，反应15min的酶活，测得的最高酶活定为100％，其他温度下测得的酶活以相对于最高活力的百分比计算。结果显示rabvmo的最适反应温度为30～40℃，酶活可保持在0.90～1.16u·mg–1。
表2rabvmo在不同温度下的酶活
(6)酶的热稳定性
以苯甲硫醚为底物，分别测定rabvmo在30℃下的热稳定性，将0小时酶的初始活力定为100％，其他时间点测得的酶活以相对于0小时酶的初始活力的百分比计算。结果显示rabvmo在30℃下8h后，酶活能保持在98％以上，在16h时能保持在86％，25h后活力降低为初始活力的50％。
表3rabvmo的热稳定性
(7)动力学参数分析
测定rabvmo对底物苯甲硫醚的动力学参数。酶活测定体系列举如下：tris-hcl缓冲液(100mmol·l-1，ph9.0)，苯甲硫醚(0～15mmol·l-1)。通过计算比酶活来表征反应速率，从而计算动力学参数。测定的rabvmo对底物苯甲硫醚的动力学参数分别为km为0.158mmol·l-1，vmax为1.890μmol·min–1·mg–1。
(8)金属离子对酶活的影响
将终浓度为1mmol·l-1的氯化盐形式的金属离子加入到纯酶液中，于30℃下温育15min后，在pbs缓冲液(100mmol·l-1，ph8.0)中以苯甲硫醚为底物测定其残余酶活。同等条件下，不加任何金属离子测得的酶活力定为100％，加入金属离子测得的酶活力以对照的百分比计算。结果表2所示。
表4金属离子对baeyer-villiger单加氧酶酶活力的影响
由表4可知，当加入edta时baeyer-villiger单加氧酶的活力没有受到抑制，因此该酶为非金属离子依赖的酶。
(9)立体选择性分析
测定rabvmo催化底物苯甲硫醚的选择性。反应体系(10ml)为：适量纯化的酶液、5mmol·l-1苯甲硫醚。于30℃静置反应15min。反应结束后，取样进行液相检测。检测条件：手性od-h色谱柱(250mm×4.6mm×5μm)，检测波长为254nm，流动相为正己烷：异丙醇(90：10)，流速为0.2～1ml/min。由图3可知，该酶具有非常好的立体选择性，仅有s-苯甲亚砜生成。
实施例3：baeyer-villiger单加氧酶应用于s-苯甲亚砜的制备
取2～500u所得的重组baeyer-villiger单加氧酶和2～500u的葡萄糖脱氢酶(gdh，购自诺唯赞公司，5u/g)于tris-hcl缓冲液(ph9，100mmol·l-1)中，加入5％甲醇，在反应体系中浓度为30～100mmol·l-1的苯甲硫醚(表5)，反应液总体积为10ml。将反应置于30℃下，取样检测转化过程，条件如下：手性od-h色谱柱(250mm×4.6mm×5μm)，检测波长为254nm，流动相为正己烷：异丙醇(90：10)，流速为0.2～1ml/min。
对反应过程实时取样检测，当检测到产物不再增加时，反应结束。
结果如表5所示，baeyer-villiger单加氧酶在高底物浓度下能够保持很好的催化性能，转化率能保持在95％以上，得率可达99.5％。
表5bv单加氧酶制备s-苯甲亚砜
实施例4：baeyer-villiger单加氧酶应用于ε-内酯的制备
取2～500u所得的重组baeyer-villiger单加氧酶和2～500u的葡萄糖脱氢酶(gdh，购自诺唯赞公司，5u/g)于tris-hcl缓冲液(ph9，100mmol·l-1)中，加入5％甲醇，在反应体系中浓度为50～200mmol·l-1的环己酮(表6)，反应液总体积为10ml。将反应置于30℃下，取样检测转化过程，条件如下：岛津气相gc-2014，非手性柱：at-se-54(30m×0.25mm×0.33μm)，分析程序如下：100℃保持1min，然后以10℃/min的速度升至180℃，最后在180℃保持3min。对反应过程实时取样检测，当检测到产物不再增加时，反应结束。
结果如表6所示，baeyer-villiger单加氧酶在高底物浓度下能够保持很好的催化性能，转化率能保持在95％以上。
表6bv单加氧酶制备ε-内酯
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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1.一种制备光学活性亚砜的方法，其特征在于，以氨基酸序列如seqidno.2所示的单加氧酶为催化剂，催化硫醚生成光学活性亚砜。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光学活性亚砜包括苯甲亚砜、对氯苯甲亚砜、对甲氧基苯甲亚砜、对氨基苯甲亚砜。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，以苯甲硫醚为底物，催化生成s-苯甲亚砜。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，苯甲硫醚在反应体系中的浓度为30-100mmol·l-1。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述单加氧酶以30-100ku·l-1的量加入反应体系中。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在25-40℃下反应2-30h。
7.单加氧酶在制备s-苯甲亚砜中的应用，其特征在于，所述单加氧酶氨基酸序列如seqidno.2所示。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，以苯甲硫醚为底物，以所述单加氧酶为催化剂，制备s-苯甲亚砜。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，反应体系中还含有醇脱氢酶。
10.权利要求1-6任一所述方法在制备光学活性亚砜中的应用。
技术总结