本发明涉及基因工程领域，具体为一种异源表达卤化酶的纯化方法。
背景技术：
卤化物是含有卤素原子氟、氯、溴或碘的一类有机化合物。大多数卤化物具有重要的生物活性，许多临床上使用的抗生素和抗肿瘤药物都是微生物来源的卤化物，如具有抗菌活性的氯霉素、万古霉素，具有抗肿瘤活性的蝴蝶霉素、c-1027等。2014年批准上市的4个新型抗生素中3个为卤化物，分别为dalvance、oritavanci、sivextro.
表达外源蛋白的一般策略是将目的基因连接到合适的载体上，然后将载体转入表达菌株中表达目的蛋白，最后将表达菌株进行破碎，富集、纯化需要的目的蛋白。该过程需要解决目的蛋白的表达和纯化两个问题：目的基因在表达菌株中表达足够量的蛋白质；2、选择合适的手段对目的蛋白进行纯化。此外，充足的表达量也有利于蛋白质的纯化。
为了后续纯化的方便，技术人员常常利用6×his、mbp等标签来通过亲和层析纯化目的蛋白。除此之外，如何鉴定目的基因是否在表达菌株中表达也是一个问题。通常的手段是将表达菌株破碎富集之后再通过sds-page胶来判定目的基因是否表达，而一个表达载体的构建往往不是一蹴而就的，需要不断地优化，这就造成了很多时间的浪费以及试剂的损失。
综上，本领域技术人员希望开发一种新的蛋白质表达纯化方法，可以对目的蛋白进行高效、高纯度的纯化和富集。
技术实现要素：
本发明的目的在于上述背景技术基础上，提供一种卤化酶异源表达载体及其构建。
为达到上述目的，采用的技术方案为：
一种异源表达卤化酶的纯化方法，所述卤化酶序列如seqidno.1所示，包含以下步骤：
a）.构建链霉菌卤化酶异源表达菌株pet-abxhr，培养诱导收集菌体；
b）.非变性条件下抽提his标签蛋白：
（1）准备细胞，接种，诱导表达，收集细胞；
（2）加入1/20细胞生长体积的nta-0buffer和pmsf，pmsf使用的工作浓度为1mm现用现加；
（3）将细胞悬浮，加入适量溶菌酶，混匀，冰上放置30min，冰上超声或匀浆破碎细胞；
（4）加入10%tritonx-100,使终浓度为0.05%，充分混匀，冰上放置15min；
（5）12000rpm，4℃，离心15min，取上清置于冰上备用或-20℃保存；
（6）将nta树脂装入合适的层析柱，层析用10倍nta体积的nta-0buffer冲洗；
（7）将样品加至nta层析柱中，流速控制在15ml/h左右，分别用nta-20、nta-40、nta-60、nta-80、nta-100、nta-200、nta-300、nta-400buffer洗脱，流速控制在15ml/h左右，收集洗脱液，每管收集一个nta体积；
（8）收集的洗脱液，sds-page蛋白质电泳分析蛋白的结合情况，纯化的目标蛋白质的保存条件根据蛋白质的性质和用途确定。
为了解决现有技术中存在的问题，本发明通过构建一个卤化酶高效表达载体，富集蛋白，利用his标签纯化树脂纯化pet-abxhr卤化酶，在最适缓冲液浓度(nta-60、nta-80)下洗脱出目的蛋白，bca试剂盒确定蛋白浓度大小，纯化的蛋白酶保存于-20℃冰箱备用。本发明提供了一种链霉菌来源的卤化酶表达纯化方法，具有良好的普适性，尤其适于在大肠杆菌中表达的卤化酶。
附图说明
图1为本申请梯度洗脱蛋白sds-page的验证。
具体实施方式
下面结合本发明的具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。若涉及附图，附图中的相同数字表示相同或同种要素。所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1，为本申请梯度洗脱蛋白sds-page验证。bsa为牛血清白蛋白，分子量为66.430kda，与鉴定的卤化酶基因65kda，大小相差不大，作为maker。1为没有加入iptg的pet-abxhr菌株，2和3分别nta-60、nta-80梯度下洗脱出目的蛋白。
为了解决现有技术中存在的问题，本发明通过构建一个卤化酶高效表达载体，富集蛋白，利用his标签纯化树脂纯化pet-abxhr卤化酶，在最适缓冲液浓度(nta-60、nta-80)下洗脱出目的蛋白，bca试剂盒确定蛋白浓度大小，纯化的蛋白酶保存于-20℃冰箱备用。
本发明提供了一种链霉菌来源的卤化酶表达纯化方法，所述卤化酶序列如seqidno.1所示，具有良好的普适性，尤其适于在大肠杆菌中表达的卤化酶。
构建链霉菌卤化酶异源表达菌株pet-abxhr，大量培养诱导收集菌体，非变性条件下抽提his标签蛋白，梯度洗脱目的蛋白，收集的洗脱液进行sds-page蛋白质电泳分析蛋白的结合情况，纯化的目标蛋白质的保存条件根据蛋白质的性质和用途确定。
阳性克隆菌诱导表达步骤：
（1）阳性克隆菌100µl，接种于5个100ml含终浓度为100ng/µl氨苄青霉素的lb液体培养基中；
（2）37℃恒温摇床培养，220rpm，培养至od600=0.3-0.5；
（3）加入终浓度为1.0mm/l的iptg，置于28℃诱导培养。
大量收集细胞步骤：
（1）诱导的菌体于12000rpm，离心3min，弃去上清；
（2）每管分别加入5ml去离子水，吹打混匀，12000rpm，离心3min，弃去上清；重复3次。最后得到沉淀为收集细胞。
非变性条件下抽提his标签蛋白
（1）准备细胞，接种，诱导表达，收集细胞；
（2）加入1/20细胞生长体积的nta-0buffer和pmsf，pmsf使用的工作浓度为1mm现用现加；
（3）将细胞悬浮起来，加入适量溶菌酶，混匀，冰上放置30min，冰上超声或匀浆破碎细胞；
（4）加入10%tritonx-100,使终浓度为0.05%，充分混匀，冰上放置15min；
（5）12000rpm，4℃，离心15min，取上清置于冰上备用或-20℃保存；
（6）将nta树脂装入合适的层析柱，层析用10倍nta体积的nta-0buffer冲洗；
（7）将样品加至nta层析柱中，流速控制在15ml/h左右，分别用nta-20、nta-40、nta-60、nta-80、nta-100、nta-200、nta-300、nta-400buffer洗脱，流速控制在15ml/h左右，收集洗脱液，每管收集一个nta体积；
（8）收集的洗脱液，sds-page蛋白质电泳分析蛋白的结合情况，纯化的目标蛋白质的保存条件根据蛋白质的性质和用途确定。
sds-page蛋白质电泳分析步骤
（1）分别取10µl洗脱液，加入20µl5×sds-page电泳上样缓冲液，99℃金属浴裂解10min；10µl蛋白质分子标准点样，10%的sds-page凝胶电泳分析，50v电泳30min之后100v电泳2h，根据实际情况调整时间；
（2）剥胶之后放置于盛有考马斯亮蓝r250的蛋白染色液中，脱色摇床振荡染色2-6h；
（3）考马斯亮蓝蛋白脱色液脱色6h，双色红外激光成像系统曝光显色，判断蛋白质表达与否。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<110>遵义医科大学
<120>一种异源表达卤化酶的纯化方法
<141>2021-01-07
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>3
<212>prt
<213>streptomycessp.fj31-2
<400>1
<210>2
<211>1251
<212>dna
<213>streptomycessp.fj31-2
<400>2
gtgacacactcaatggacacgacagacacaggcgaccccggtacctcctacgacgtcgtt60
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gcggacgccagggccaagaccaacgacatccactcccgcttcgcgacatga1251
1.一种异源表达卤化酶的纯化方法，其特征是：所述卤化酶序列如seqidno.1所示，包含以下步骤：
a）.构建链霉菌卤化酶异源表达菌株pet-abxhr，培养诱导收集菌体；
b）.非变性条件下抽提his标签蛋白：
（1）准备细胞，接种，诱导表达，收集细胞；
（2）加入1/20细胞生长体积的nta-0buffer和pmsf，pmsf使用的工作浓度为1mm现用现加；
（3）将细胞悬浮，加入适量溶菌酶，混匀，冰上放置30min，冰上超声或匀浆破碎细胞；
（4）加入10%tritonx-100,使终浓度为0.05%，充分混匀，冰上放置15min；
（5）12000rpm，4℃，离心15min，取上清置于冰上备用或-20℃保存；
（6）将nta树脂装入合适的层析柱，层析用10倍nta体积的nta-0buffer冲洗；
（7）将样品加至nta层析柱中，流速控制在15ml/h左右，分别用nta-20、nta-40、nta-60、nta-80、nta-100、nta-200、nta-300、nta-400buffer洗脱，流速控制在15ml/h左右，收集洗脱液，每管收集一个nta体积；
（8）收集的洗脱液，sds-page蛋白质电泳分析蛋白的结合情况，纯化的目标蛋白质的保存条件根据蛋白质的性质和用途确定。
技术总结