本发明涉及一种醇脱氢酶突变体及其应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。
背景技术：
手性双芳基醇是一类重要的手性化合物，可用于合成倍他司汀、罗托沙敏等多种药物，因此，手性双芳基醇在医药领域均具有广泛的应用。
目前，生产手性双芳基醇的方法主要为化学不对称合成法，此方法为以潜手性双芳基酮为原料，以trans-rucl2[(r)-xylbinap][(r)-daipen]、(s)-[ru(binap)cl2]2(ne3)、(s,s)-6-choona等为催化剂或以手性binal-h等为手性还原剂，在一定的条件下(高压)进行不对称还原反应以获得手性双芳基醇(具体可见参考文献“c.y.chen,etal.,org.lett.,2003,5,5039-5042”、“赵志全等,中国医药工业杂志,2006,37,726-727”以及公开号为cn103121966a的专利申请文本)。
但是，化学不对称合成法所使用的催化剂或手性还原剂价格昂贵、反应需要高压条件且合成得到的产物光学纯度低，既不利于工业化生产，也不能满足药物对光学纯度的要求。
酶不对称还原法是指以潜手性双芳基酮为原料，以酶作为催化剂进行不对称还原反应以获得手性双芳基醇的方法。与化学不对称合成法相比，酶不对称还原法具有作用条件温和、成本低廉且合成得到的产物光学纯度高的优势，符合“可持续发展”、“绿色化学”、“环境友好制造”等工业发展的目标。因此，利用酶不对称还原法生产手性双芳基醇对实现手性双芳基醇的大规模工业化生产以及手性双芳基醇在医药领域的大规模应用具有重要意义。
现有的可用于不对称还原潜手性双芳基酮生产手性双芳基醇的酶主要为醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase，简称adh，ec1.1.1.1)，但是，大部分的醇脱氢酶溶剂耐受性不好，这使得醇脱氢酶在工业生产条件下容易失活，这大大阻碍了利用酶不对称还原法生产手性双芳基醇的工业化进程。
技术实现要素：
[技术问题]
需找到溶剂耐受性好的不对称还原潜手性双芳基酮生产手性双芳基醇的醇脱氢酶，以早日实现手性双芳基醇的大规模工业化生产以及手性双芳基醇在医药领域的大规模应用。
[技术方案]
本发明提供了醇脱氢酶突变体，所述醇脱氢酶突变体是以氨基酸序列如seqidno.1所示的醇脱氢酶为亲本，将亲本第140位和/或第237位突变。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为如下(a)～(c)任一：
(a)将亲本第140位突变为亮氨酸；
(b)将亲本第237位突变为甘氨酸；
(c)将亲本第140位突变为亮氨酸，并将第237位突变为甘氨酸。
本发明提供了编码所述醇脱氢酶突变体的基因。
本发明提供了携带所述基因的重组质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pet-28a( )质粒、pet-28b( )质粒或pet-20b( )质粒。
本发明提供了表达所述突变体，或携带所述重组质粒的宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌e.colibl21(de3)。
本发明提供了一种生产手性双芳基醇的方法，所述方法为将所述的醇脱氢酶突变体添加至含有潜手性双芳基酮的反应体系中进行反应，制备得到手性双芳基醇。
在本发明的一种实施方式中，所述潜手性双芳基酮包括(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮、苯基-2-吡啶基甲酮、4-氟二苯甲酮或4-氯二苯甲酮。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中还含有辅酶和/或辅酶循环系统。
在本发明的一种实施方式中，所述辅酶为nadp 、nadph、nad 和/或nadh。
在本发明的一种实施方式中，在辅酶为nadp 和/或nad 时，反应体系中还含有辅酶循环系统，所述辅酶循环系统包括d-葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，或亚磷酸盐和亚磷酸盐脱氢酶，或甲酸和甲酸脱氢酶，或乳酸和乳酸脱氢酶，或甘油和甘油脱氢酶。
在本发明的一种实施方式中，所述醇脱氢酶突变体在反应体系中的添加量为1～500ku/l。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中，潜手性双芳基酮的浓度为100～500mmol/l。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中，辅酶的浓度为0.1～1mmol/l。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中，葡萄糖脱氢酶的加酶量不低于醇脱氢酶突变体的加酶量。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中，d-葡萄糖的浓度为20～1000mmol/l。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1～0.2mmol/l。
在本发明的一种实施方式中，反应的温度为30～35℃、ph为6～8。
本发明还提供了所述醇脱氢酶突变体，或所述基因，或所述重组质粒，或所述宿主细胞，或所述方法在生产手性双芳基醇中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述手性双芳基醇包括(s)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇、(r)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇、苯基-2-吡啶基甲醇和/或4-氟二苯甲酮。
[有益效果]
本发明的醇脱氢酶突变体在乙醇条件下溶剂耐受性好，其中，突变体s237g/t140l的相对酶活(5％乙醇下酶活/10％乙醇下酶活的比值)高达58％，比野生型提高了20.83％，并且其仍然具备良好的利用潜手性双芳基酮转化生成手性双芳基醇的功能，转化率可达99.9％，在工业化制备手性双芳基醇中具备良好的应用前景。
附图说明
图1为重组质粒的的pcr扩增电泳图谱；其中，m：marker，泳道1～3分别为重组质粒pet28a-kpadh-1、pet28a-kpadh-2和pet28a-kpadh-3的酶切产物。
图2为重组大肠杆菌摇瓶诱导发酵获得的表达产物的sds-page电泳分析结果；其中，m：标准蛋白maker；泳道1：重组大肠杆菌e.colibl21/pet28a-kpadh-1摇瓶诱导发酵获得的突变体的纯酶；泳道2：重组大肠杆菌e.colibl21/pet28a-kpadh-2摇瓶诱导发酵获得的突变体的纯酶；泳道3：重组大肠杆菌e.colibl21/pet28a-kpadh-3摇瓶诱导发酵获得的突变体的纯酶。
具体实施方式
下述实施例中涉及的大肠杆菌e.colibl21(de3)购自北纳生物；下述实施例中涉及的pet-28a( )质粒、nadph购自novagen公司；下述实施例中涉及的潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮购自上海生工公司。
(1)下述实施例中涉及的培养基如下：
lb液体培养基：酵母粉5.0g·l-1、胰蛋白胨10.0g·l-1、nacl10.0g·l-1、卡那霉素100mg·l-1。
lb固体培养基：酵母粉5.0g·l-1、胰蛋白胨10.0g·l-1、nacl10.0g·l-1、琼脂粉15g/l、卡那霉素50mg·l-1。
(2)下述实施例中涉及的检测方法如下：
醇脱氢酶酶活的检测方法如下：
将含有1mmnadph、1.0mm底物潜手性(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮的磷酸钠缓冲液(pbs，100mm，ph7.0)于30℃保温2min后，取10μl纯酶液加入磷酸钠缓冲液中于30℃进行反应，反应过程中，使用酶标仪检测反应液于340nm下吸光度的变化，并以此为依据计算酶活；
酶活的计算公式如下：
酶活力(u/ml)＝ew×v×103/(6220×l)；
式中，ew为1分钟内340nm处吸光度的变化；v为反应液的体积，单位为ml；6220为nadph的摩尔消光系数，单位为l/(mol·cm)；l为光程距离，单位为cm；
酶活的定义：在该条件下每分钟催化氧化lμmolnadph所需酶量为一个酶活力单位(1u)。
(3)醇脱氢酶不对称还原潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮生成手性双芳基醇(r)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的转化效率和立体选择性的检测方法如下：
将含有1mmnadph、1.0mm底物潜手性(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮的磷酸钠缓冲液(pbs，100mm，ph7.0)于30℃保温2min后，取10μl纯酶液加入磷酸钠缓冲液中于30℃反应60min；反应结束后，沸水终止反应，取100μl反应液，加入500μl乙酸乙酯，震荡1～2min，12000rpm离心2～5min，取上清到离心管中，待有机相自然挥发完全，加入500μl色谱纯乙醇，进行手性液相色谱分析转化效率和ee值；
色谱条件具体如下：daicelchiralcelod-h(5μm，250mm×4.6mm)液相色谱柱，流动相为正已烷:乙醇:乙醇胺(90:10:0.01，v/v/v)，流速0.8ml/min，柱温30℃，紫外检测波长254nm，进样量10μl，(s)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇和(r)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇保留时间分别为11.12min和12.71min；
转化效率的计算方法如下：
ee值的计算方法如下：
as：反应液中(s)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的摩尔浓度；ar：反应液中(r)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的摩尔浓度；asub：反应液中未反应完的(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮的摩尔浓度。
实施例1：醇脱氢酶突变体的制备、表达及纯化
化学合成编码氨基酸序列如seqidno.1所示的醇脱氢酶的基因(基因的核苷酸序列如seqidno.2所示)；将获得的基因与pet-28a( )质粒经双酶切(ndeⅰ和xhoⅰ)后进行连接，连接产物转化大肠杆菌e.colibl21(de3)，转化产物涂布于lb固体培养基，于37℃培养8～10h，在lb固体培养基上挑取5个转化子，接入lb液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将提取得到的质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得含有编码野生型醇脱氢酶的基因的重组质粒pet28a-kpadh以及含有编码野生型醇脱氢酶的基因的重组菌e.colibl21/pet28a-kpadh。
利用全质粒pcr技术，以获得的重组质粒pet28a-kpadh为模板进行定点突变，获得含有编码醇脱氢酶突变体t140l(第140位苏氨酸突变为亮氨酸)、s237g(第327位丝氨酸突变为甘氨酸)、t140l/s237g；
其中，突变t140l，s237g所用引物如下：
t140l-f：catagacaaaatgatccattgttaactttagat(seqidno.3)；
t140l-r：ttcttcatctaaagttaacaatggatcattttg(seqidno.4)；
s237g-f：gaaaagactcacttcggacaattcatt(seqidno.5)；
s237g-r：aacatcaatgaattgtccgaagtgagt(seqidno.6)，
pcr反应体系(50μl)为：kod酶(2.5u/ml)l.0μl，模板(5～50ng)l.0μl，dntp4.0μl，10×reactionbuffer5.0μl，上下游引物各1.0μl，ddh2o补足至50μl；
pcr产物扩增条件均为：(1)94℃变性3min，(2)94℃变性30sec，(3)54℃退火30sec，(4)72℃延伸150sec，重复步骤(2)～(4)进行10～15个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存pcr扩增产物。
pcr扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结束后，向10μl扩增产物中加入0.5μl甲基化模板消化酶(dpni)，枪头吹吸进行混匀，于37℃条件下反应1h，将dpni处理后的扩增产物转化大肠杆菌e.colibl21(de3)，转化产物涂布于lb固体培养基，于37℃培养8～10h，在lb固体培养基上挑取5个转化子，接入lb液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将提取得到的质粒进行酶切验证(验证结果可见图1)以及测序验证，验证正确即获得分别含有编码醇脱氢酶突变体t140l、s237g和t140l/s237g的基因的重组质粒pet28a-kpadh-1、pet28a-kpadh-2、pet28a-kpadh-3，与其相对应的即为分别含有编码醇脱氢酶突变体t140l、s237g和t140l/s237g的基因的重组菌e.colibl21/pet28a-kpadh-1、e.colibl21/pet28a-kpadh-2、重组菌e.colibl21/pet28a-kpadh-3。
将获得的重组菌e.colibl21/pet28a-kpadh以及重组菌e.colibl21/pet28a-kpadh-1、e.colibl21/pet28a-kpadh-2、e.colibl21/pet28a-kpadh-3分别涂布于lb固体培养基，于37℃培养8～10h，获得单菌落；挑取单菌落接入lb液体培养基，于37℃培养12～14h，获得种子液；将种子液按照2ml/100ml的接种量接入lb液体培养基，于37℃、200rpm培养至od600达到0.8后，在发酵液中加入终浓度为0.2mm的iptg，于25℃继续诱导培养8h，得到发酵液；将发酵液于4℃、8000rpm离心10min后，收集细胞；将收集得到的细胞悬浮于磷酸钾缓冲液(100mmol·l-1，ph6.0)中进行超声破碎，收集分别含有野生型醇脱氢酶、醇脱氢酶突变体m1～m64以及醇脱氢酶突变体s5的细胞破碎上清液。
将获得的细胞破碎上清液使用亲和柱histrapffcrude(镍柱)进行纯化，纯化过程如下：先使用缓冲液a(20mmol·l-1磷酸钠，500mmol·l-1nacl，20mmol·l-1咪唑，ph7.4)平衡镍柱，并实施例1获得的细胞破碎上清液过镍柱，继续使用缓冲液a洗脱未与镍柱结合的蛋白，待穿透峰流尽后，从缓冲液a到缓冲液b(20mmol·l-1磷酸钠，500mmol·l-1nacl，500mmol·l-1咪唑，ph7.4)进行梯度洗脱，将结合到镍柱上的重组蛋白洗脱下来，获得野生型醇脱氢酶、醇脱氢酶突变体t140l、s237g和t140l/s237g的纯酶液。
将获得的醇脱氢酶突变体t140l、s237g和t140l/s237g的纯酶液进行sds-page分析，分析结果见图2。
由图2可知，醇脱氢酶突变体t140l、s237g和t140l/s237g的纯酶液均在45kda左右显示单条带，且杂蛋白较少，说明镍柱纯化效果较好。
实施例2：醇脱氢酶突变体的乙醇溶剂耐受性
将实施例1获得的野生型醇脱氢酶、醇脱氢酶突变体t140l、s237g和t140l/s237g的纯酶液在温度30℃下，在测酶活反应体系下加乙醇到终体积分数分别为5％和10％，反应3min，反应结束后，测定野生型醇脱氢酶、醇脱氢酶突变体的相对酶活(5％乙醇下酶活/10％乙醇下酶活的比值)作为评价溶剂耐受性的方法，检测结果见表1。
表1酶的乙醇耐受性
由表1可知，突变体t140l、s237g和t140l/s237g在酶活以及相对酶活方面有着不同程度的提高，醇脱氢酶突变体t140l在5％乙醇浓度下的酶活与wt相比并未有显著变化，但其相对酶活比wt提高16.67％，醇脱氢酶突变体s237g在5％乙醇浓度下的酶活与wt相比提高了1.5倍左右，其相对酶活比wt提高约12.50％，醇脱氢酶突变体t140l/s237g在5％乙醇浓度下的酶活与wt相比提高了2倍左右，但其相对酶活比wt提高约为20.83％。
实施例3：利用醇脱氢酶突变体不对称还原潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮生成手性双芳基醇(r)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇
此反应中，辅酶将h 传递给辅酶，辅酶再将h 传递给底物，从而完成反应。因而本实施例中采用葡萄糖脱氢酶与葡萄糖来为反应提供必要的h ，若在反应过程中添加其他组合：如d-葡萄糖和葡萄糖脱氢酶、或亚磷酸盐和亚磷酸盐脱氢酶、或甲酸和甲酸脱氢酶、或乳酸和乳酸脱氢酶、或甘油和甘油脱氢酶等能够提供h 的组合，结合辅酶nadp 和/或nad 都能实现此反应；或在反应中直接添加共氢的辅酶nadh、nadph也能保证反应的正常进行。
将实施例1获得的野生型醇脱氢酶(25u/mg)以及醇脱氢酶突变体s237g(61u/mg)以7g/l的添加量添加至分别含有100mm潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮的100mm磷酸钾缓冲液(ph7.0)中，在30℃、ph7.0、200rpm条件下反应12h，得到反应液；除潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮外，磷酸钾缓冲液中还含有浓度为0.02mm的辅酶nadp 、浓度为1.5mm的葡萄糖和浓度为5％(v/v)的乙醇，在反应过程中还加入了葡萄糖脱氢酶gdh，gdh的加酶量不低于醇脱氢酶的加酶量，以保证偶联反应的正常进行。
反应12h，采用手性液相色谱方法检测产物，结果显示野生型醇脱氢酶以及醇脱氢酶突变体s237g分别在反应时间内达到>99.9％的转化率。
将突变体t140l和t140l/s237g按照上述方法以潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮为底物，进行反应，制备得到的(r)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇，转化率也可达99.9％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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1.醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述醇脱氢酶突变体是以氨基酸序列如seqidno.1所示的醇脱氢酶为亲本，将亲本第140位和/或第237位突变。
2.根据权利要求1所述的醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体为如下(a)～(c)任一：
(a)将亲本第140位突变为亮氨酸；
(b)将亲本第237位突变为甘氨酸；
(c)将亲本第140位突变为亮氨酸，并将第237位突变为甘氨酸。
3.编码权利要求1或2所述醇脱氢酶突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的重组质粒。
5.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的载体为pet-28a( )质粒、pet-28b( )质粒或pet-20b( )质粒。
6.表达权利要求1或2所述突变体，或携带权利要求4或5所述重组质粒的宿主细胞。
7.一种生产手性双芳基醇的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1或2所述的醇脱氢酶突变体添加至含有潜手性双芳基酮的反应体系中进行反应，制备得到手性双芳基醇。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述反应体系中还含有辅酶和/或辅酶循环系统。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述辅酶循环系统包括d-葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，或亚磷酸盐和亚磷酸盐脱氢酶，或甲酸和甲酸脱氢酶，或乳酸和乳酸脱氢酶，或甘油和甘油脱氢酶。
10.权利要求1或2所述醇脱氢酶突变体，或权利要求3所述基因，或权利要求4或5所述重组质粒，或权利要求6所述宿主细胞，或权利要求7-9任一所述方法在生产手性双芳基醇中的应用。
技术总结