本发明涉及一种发酵制备葡萄糖脱氢酶的方法，特别是指一种利用维生素b2提高fad依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法。
背景技术：
fad依赖的葡萄糖脱氢酶(fad-dependentglucosedehydrogenase，简称fad-gdh，ec1.1.99.10)，与葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，简称god)、吡喃糖脱氢酶、胆碱脱氢酶和甲醇氧化酶同属于gmc氧化还原酶(glucose-methanol-choline-oxidoreductase)家族。它是以fad为辅基能够在nad(p) 等存在的情况下催化β-d-葡萄糖生成d-葡萄糖酸-δ-内酯，而d-葡萄糖酸-δ-内酯会自发形成葡萄糖酸。
在目前使用的血糖检测用酶中，葡萄糖氧化酶(god)因其能利用氧作为电子受体，样品中氧分压的改变会使检测结果产生误差，而gdh不利用氧作为电子受体，不会产生此种偏差，因此gdh被认为是代替god的最具潜力的检测用酶。
申请号为201710949621.8的发明专利申请中公开了一种产fad依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母及其构建方法和，通过fad依赖的葡萄糖脱氢酶密码子优化，人工合成基因片段，构建重组表达载体pmd-gdh，转化毕赤酵母x33菌株(cgmccno.14382)后利用甲醇诱导培养实现分泌表达。在10l发酵罐培养时经过136小时诱导培养，产量为257600u/l。
通常通过改进发酵工艺，来提高产量。辅因子对细胞生长和胞内物质代谢至关重要。发酵液中的溶氧水平与微生物细胞内的nadh/nad 比率也有密切关系。同时，微生物胞外氧化还原态势能够影响微生物胞内的nadh/nad 的比率。维生素b2是一种非常重要的辅酶，是合成黄素单核苷酸(fmn)和黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)的前体物质。fmn和fad是黄素酶-nadh脱氢酶的重要组成部分，作为呼吸链的组成成分，与糖、脂和氨基酸的代谢密切相关。维生素b2是nadh脱氢酶的重要组成部分。理论上维生素b2可以通过调节微生物胞内nadh脱氢酶活性进而调节胞内的nadh/nad 比率，但利用外源添加维生素b2来提高fad依赖的葡萄糖脱氢酶产量的报道尚未见到。
技术实现要素：
本发明提出一种利用维生素b2提高fad依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，通过外源添加维生素b2后能够提高fad依赖的葡萄糖脱氢酶的产量。
本发明的整体技术构思是：
利用维生素b2提高fad依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，是将保藏编号为cgmccno.14382的巴斯德毕赤酵母pichiapastoris接种至以甘油为碳源的发酵培养液中进行培养；包括如下工艺步骤：
a、菌株培养阶段
接种量为10％～15％，发酵培养基选用bsm培养基，每升发酵培养液中含有4～4.5mlptm1，在温度为28℃～30℃、搅拌转速为600～700转/分钟、ph＝4.8～5.2、通风量为1.2～2.0vvm的条件下通气搅拌培养l8～24小时；
b、碳源饲喂阶段
当发酵过程中甘油耗尽时流加包含10～14ml/lptm1且质量体积比为50％的甘油，流加量为12～16ml/h/l，流加时间为4～6小时；
c、饥饿饲喂阶段
至od600≈160～180，停止流加甘油至培养基中甘油耗尽；
d、诱导表达阶段
流加包含10～14ml/lptm1的甲醇使发酵液中甲醇终浓度维持在0.2％～0.3％左右，控制ph＝5.9～6.1，控制甲醇溶液的流加速度使发酵液中溶氧量≈0，在诱导过程加维生素b2水溶液至培养液中维生素b2终浓度为0.5mm～1mm，当酶活不再升高时停止发酵。
本发明的具体技术构思还有：
为便于实现工业化生产，优选的技术实现手段是，还包括扩大培养阶段，是将保藏编号为cgmccno.14382的巴斯德毕赤酵母pichiapastoris制成种子液。
优选的一级种子的制备方法是将保藏编号为cgmccno.14382的巴斯德毕赤酵母pichiapastoris接种到5mlypd液体培养基中，在温度为28～30℃、震荡速率为200～250转/分钟的条件下振荡培养12～16小时制成一级种子。
优选的种子液的制备方法是，按体积比为3％～5％接种量将一级种子转接于80～120mlbmgy的摇瓶培养基中，在温度为28℃～30℃、转速为200～250转/分钟的条件下培养6～10小时，至od600≈6～8制成种子液。
优选的发酵培养液的装量为，发酵培养液在反应釜中的装量为45％～56％。
所述的步骤a、d中调整ph采用浓氨水。
为更好地控制反应的终点，提高工业化生产的经济性，优选的技术实现手段是，步骤d中每隔12小时取样一次检测od600和菌体湿重，每隔12小时测定表达的葡萄糖脱氢酶的活性。
为验证本发明的技术效果，申请人采用如下方法：
酶活检测：
毕赤酵母菌经8000转/分钟离心5分钟收集上清，测定fad依赖葡萄糖脱氢酶的活力，具体方法如下：dcip反应体系包括终浓度50mm乙酸钠缓冲液，ph＝5.5，300μmdcip和100mm葡萄糖。具体如下：
1、反应体系3.1ml：底物葡萄糖2.9ml、9×10-3mol/ldcip100μl、酶液100μl；
2、检测520nm处吸光值的变化(吸光值下降)；
3、计算公式：
酶活(u/ml)＝△a×3.1×稀释倍数d/6.9×0.1×3min。
酶活测定方法参见sygmundc，staudiglp，klausbergerm，etal.heterologousoverexpressionofglomerellacingulatafad-dependentglucosedehydrogenaseinescherichiacoliandpichiapastoris[j].microbialcellfactories，10，1(2011-12-12)，2011，10(1):1-9.
本发明所具备的实质性特点及取得的技术进步在于：
本发明采用外源添加维生素b2，培养108小时后fad依赖的葡萄糖脱氢酶的产量比对照组提高34.55％(最高可达40.39％)，对同体积的发酵液而言，fad依赖的葡萄糖脱氢酶的产量得到提高。实验结果还显示外源添加维生素b2后可以延长诱导培养时间至132小时，不外源添加维生素b2时，诱导108小时后酶活开始降低，诱导培养132小时后产量大于620000u/l(最高可达718840u/l)；实现同体积发酵液获得更高的产量。所以外源添加维生素b2后能够显著提高fad依赖的葡萄糖脱氢酶的产量。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不应理解为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书所做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
利用维生素b2提高fad依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，是将保藏编号为cgmccno.14382的巴斯德毕赤酵母pichiapastoris接种至以甘油为碳源的发酵培养液中进行培养；包括如下工艺步骤：
a、菌株培养阶段
接种量为15％，发酵培养基选用bsm培养基，每升发酵培养液中含有4.5mlptm1，在温度为30℃、搅拌转速为700转/分钟、ph＝5.2、通风量为2.0vvm的条件下通气搅拌培养24小时；
b、碳源饲喂阶段
当发酵过程中甘油耗尽时流加包含14ml/lptm1且质量体积比为50％的甘油，流加量为16ml/h/l，流加时间为6小时；
c、饥饿饲喂阶段
至od600≈180，停止流加甘油至培养基中甘油耗尽；
d、诱导表达阶段
流加包含14ml/lptm1的甲醇使发酵液中甲醇终浓度维持在0.3％左右，控制ph＝6.1，控制甲醇溶液的流加速度使发酵液中溶氧量≈0，在诱导过程加维生素b2水溶液至培养液中维生素b2终浓度为1mm，当酶活不再升高时停止发酵。
还包括扩大培养阶段，是将保藏编号为cgmccno.14382的巴斯德毕赤酵母pichiapastoris接种到5mlypd液体培养基中，在温度为30℃、震荡速率为250转/分钟的条件下振荡培养16小时制成一级种子。
按体积比为5％接种量将一级种子转接于120mlbmgy的摇瓶培养基中，在温度为30℃、转速为250转/分钟的条件下培养10小时，至od600≈8制成种子液。
发酵培养液在反应釜中的装量为56％。
所述的步骤a、d中调整ph采用浓氨水。
步骤d中每隔12小时取样一次检测od600和菌体湿重，每隔12小时测定表达的葡萄糖脱氢酶的活性。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：
利用维生素b2提高fad依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，是将保藏编号为cgmccno.14382的巴斯德毕赤酵母pichiapastoris接种至以甘油为碳源的发酵培养液中进行培养；包括如下工艺步骤：
a、菌株培养阶段
接种量为10％，发酵培养基选用bsm培养基，每升发酵培养液中含有4mlptm1，在温度为28℃、搅拌转速为600转/分钟、ph＝4.8、通风量为1.2vvm的条件下通气搅拌培养l8小时；
b、碳源饲喂阶段
当发酵过程中甘油耗尽时流加包含10ml/lptm1且质量体积比为50％的甘油，流加量为12ml/h/l，流加时间为4小时；
c、饥饿饲喂阶段
至od600≈160，停止流加甘油至培养基中甘油耗尽；
d、诱导表达阶段
流加包含10ml/lptm1的甲醇使发酵液中甲醇终浓度维持在0.2％左右，控制ph＝5.9，控制甲醇溶液的流加速度使发酵液中溶氧量≈0，在诱导过程加维生素b2水溶液至培养液中维生素b2终浓度为0.5mm，当酶活不再升高时停止发酵。
还包括扩大培养阶段，是将保藏编号为cgmccno.14382的巴斯德毕赤酵母pichiapastoris接种到5mlypd液体培养基中，在温度为28℃、震荡速率为200转/分钟的条件下振荡培养12小时制成一级种子。
按体积比为3％接种量将一级种子转接于80mlbmgy的摇瓶培养基中，在温度为28℃、转速为200转/分钟的条件下培养6小时，至od600≈6制成种子液。
发酵培养液在反应釜中的装量为45％。
其余内容同实施例1。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：
利用维生素b2提高fad依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，是将保藏编号为cgmccno.14382的巴斯德毕赤酵母pichiapastoris接种至以甘油为碳源的发酵培养液中进行培养；包括如下工艺步骤：
a、菌株培养阶段
接种量为13％，发酵培养基选用bsm培养基，每升发酵培养液中含有4.3mlptm1，在温度为29℃、搅拌转速为650转/分钟、ph＝5.0、通风量为1.6vvm的条件下通气搅拌培养21小时；
b、碳源饲喂阶段
当发酵过程中甘油耗尽时流加包含12ml/lptm1且质量体积比为50％的甘油，流加量为14ml/h/l，流加时间为5小时；
c、饥饿饲喂阶段
至od600≈170，停止流加甘油至培养基中甘油耗尽；
d、诱导表达阶段
流加包含12ml/lptm1的甲醇使发酵液中甲醇终浓度维持在0.25％左右，控制ph＝6.0，控制甲醇溶液的流加速度使发酵液中溶氧量≈0，在诱导过程加维生素b2水溶液至培养液中维生素b2终浓度为0.75mm，当酶活不再升高时停止发酵。
还包括扩大培养阶段，是将保藏编号为cgmccno.14382的巴斯德毕赤酵母pichiapastoris接种到5mlypd液体培养基中，在温度为29℃、震荡速率为230转/分钟的条件下振荡培养14小时制成一级种子。
按体积比为4％接种量将一级种子转接于100mlbmgy的摇瓶培养基中，在温度为29℃、转速为230转/分钟的条件下培养8小时，至od600≈7制成种子液。
发酵培养液在反应釜中的装量为50％。
其余内容同实施例1。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：
利用维生素b2提高fad依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，是将保藏编号为cgmccno.14382的巴斯德毕赤酵母pichiapastoris接种至以甘油为碳源的发酵培养液中进行培养；包括如下工艺步骤：
a、菌株培养阶段
接种量为11％，发酵培养基选用bsm培养基，每升发酵培养液中含有4。1mlptm1，在温度为28、搅拌转速为620转/分钟、ph＝4.9、通风量为1.3vvm的条件下通气搅拌培养l9小时；
b、碳源饲喂阶段
当发酵过程中甘油耗尽时流加包含11ml/lptm1且质量体积比为50％的甘油，流加量为13ml/h/l，流加时间为4.5小时；
c、饥饿饲喂阶段
至od600≈165，停止流加甘油至培养基中甘油耗尽；
d、诱导表达阶段
流加包含11ml/lptm1的甲醇使发酵液中甲醇终浓度维持在0.22％左右，控制ph＝5.9，控制甲醇溶液的流加速度使发酵液中溶氧量≈0，在诱导过程加维生素b2水溶液至培养液中维生素b2终浓度为0.6mm，当酶活不再升高时停止发酵。
还包括扩大培养阶段，是将保藏编号为cgmccno.14382的巴斯德毕赤酵母pichiapastoris接种到5mlypd液体培养基中，在温度为28℃、震荡速率为210转/分钟的条件下振荡培养13小时制成一级种子。
按体积比为3.5％接种量将一级种子转接于90mlbmgy的摇瓶培养基中，在温度为28℃、转速为210转/分钟的条件下培养7小时，至od600≈6制成种子液。
发酵培养液在反应釜中的装量为48％。
其余内容同实施例1。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于：
利用维生素b2提高fad依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，是将保藏编号为cgmccno.14382的巴斯德毕赤酵母pichiapastoris接种至以甘油为碳源的发酵培养液中进行培养；包括如下工艺步骤：
a、菌株培养阶段
接种量为14％，发酵培养基选用bsm培养基，每升发酵培养液中含有4.4mlptm1，在温度为30℃、搅拌转速为690转/分钟、ph＝5.1、通风量为1.8vvm的条件下通气搅拌培养22小时；
b、碳源饲喂阶段
当发酵过程中甘油耗尽时流加包含13ml/lptm1且质量体积比为50％的甘油，流加量为15ml/h/l，流加时间为5.5小时；
c、饥饿饲喂阶段
至od600≈175，停止流加甘油至培养基中甘油耗尽；
d、诱导表达阶段
流加包含13ml/lptm1的甲醇使发酵液中甲醇终浓度维持在0.28％左右，控制ph＝6.1，控制甲醇溶液的流加速度使发酵液中溶氧量≈0，在诱导过程加维生素b2水溶液至培养液中维生素b2终浓度为0.9mm，当酶活不再升高时停止发酵。
还包括扩大培养阶段，是将保藏编号为cgmccno.14382的巴斯德毕赤酵母pichiapastoris接种到5mlypd液体培养基中，在温度为30℃、震荡速率为240转/分钟的条件下振荡培养15小时制成一级种子。
按体积比为4.5％接种量将一级种子转接于110mlbmgy的摇瓶培养基中，在温度为30℃、转速为240转/分钟的条件下培养9小时，至od600≈8制成种子液。
发酵培养液在反应釜中的装量为53％。
其余内容同实施例1。
申请人对实施例1-5中获得的葡萄糖脱氢酶的酶活进行了测定，并与未加入维生素b2进行了对照，结果如下：
表一实施例1-5与对照诱导培养108小时酶活(u/l)
表二实施例1-5与对照诱导培养最终酶活(u/l)
通过以上实验不难看出，加入维生素b2诱导培养108小时，实施例1-5相比对照酶活提高34.55％-40.39％，
实验结果还显示外源添加维生素b2后可以延长诱导培养时间至132小时，对照诱导108小时后酶活开始降低，发酵终止；实施例1-5相比对照酶活提高15.81％-20％，可以看出最终产量得到明显提高，所以实现同体积发酵液获得更高的产量。
1.利用维生素b2提高fad依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，是将保藏编号为cgmccno.14382的巴斯德毕赤酵母pichiapastoris接种至以甘油为碳源的发酵培养液中进行培养；其特征在于包括如下工艺步骤：
a、菌株培养阶段
接种量为10％～15％，发酵培养基选用bsm培养基，每升发酵培养液中含有4～4.5mlptm1，在温度为28℃～30℃、搅拌转速为600～700转/分钟、ph＝4.8～5.2、通风量为1.2～2.0vvm的条件下通气搅拌培养l8～24小时；
b、碳源饲喂阶段
当发酵过程中甘油耗尽时流加包含10～14ml/lptm1且质量体积比为50％的甘油，流加量为12～16ml/h/l，流加时间为4～6小时；
c、饥饿饲喂阶段
至od600≈160～180，停止流加甘油至培养基中甘油耗尽；
d、诱导表达阶段
流加包含10～14ml/lptm1的甲醇使发酵液中甲醇终浓度维持在0.2％～0.3％左右，控制ph＝5.9～6.1，控制甲醇溶液的流加速度使发酵液中溶氧量≈0，在诱导过程加维生素b2水溶液至培养液中维生素b2终浓度为0.5mm～1mm，当酶活不再升高时停止发酵。
2.根据权利要求1所述的利用维生素b2提高fad依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，其特征在于还包括扩大培养阶段，是将保藏编号为cgmccno.14382的巴斯德毕赤酵母pichiapastoris制成种子液。
3.根据权利要求2所述的利用维生素b2提高fad依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，其特征在于所述的扩大培养是将保藏编号为cgmccno.14382的巴斯德毕赤酵母pichiapastoris接种到5mlypd液体培养基中，在温度为28～30℃、震荡速率为200～250转/分钟的条件下振荡培养12～16小时制成一级种子。
4.根据权利要求3所述的利用维生素b2提高fad依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，其特征在于按体积比为3％～5％接种量将一级种子转接于80～120mlbmgy的摇瓶培养基中，在温度为28℃～30℃、转速为200～250转/分钟的条件下培养6～10小时，至od600≈6～8制成种子液。
5.根据权利要求1所述的利用维生素b2提高fad依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，其特征在于发酵培养液在反应釜中的装量为45％～56％。
6.根据权利要求1所述的利用维生素b2提高fad依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，其特征在于所述的步骤a、d中调整ph采用浓氨水。
7.根据权利要求1所述的利用维生素b2提高fad依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，其特征在于步骤d中每隔12小时取样一次检测od600和菌体湿重，每隔12小时测定表达的葡萄糖脱氢酶的活性。
技术总结