本发明涉及生物技术领域，具体涉及trdrs2蛋白及其相关生物材料在调控里氏木霉合成和分泌蛋白能力中的应用。
背景技术：
利用纤维素酶将廉价而丰富的植物生物质材料降解为可用于微生物发酵的简单糖原来进行生物燃料或其他大宗化学品的生产具有相当广阔的应用前景。目前，用于工业生产纤维素酶的主要工业菌株为丝状真菌里氏木霉(trichodermareesei)，它是一种嗜温的腐生真菌，可用于生产食品、饲料、纺织、制浆和造纸等行业用纤维素和半纤维素酶。目前已成为研究纤维素降解的重要模式菌株。里氏木霉是fda认证的安全生产菌株，具有强大的蛋白分泌能力，并且具有与高等哺乳动物相似的糖基化系统，因此里氏木霉也是一种非常理想的重组蛋白表达宿主，近年来作为一种优良的异源蛋白表达宿主被广泛使用。目前，生物质降解酶类的成本过高是木质纤维素类物质有效利用的主要障碍之一，为了进一步提高里氏木霉的纤维素酶半纤维素酶产量，同时提高其表达异源蛋白的分泌量，如何提高里氏木霉的胞外蛋白合成分泌量成为了近年来的研究热点。
目前研究表明里氏木霉纤维素酶基因的表达调控是在转录水平进行的，受到转录激活因子的促进和碳代谢抑制蛋白的阻遏，在以往的研究中，人们采用基因克隆、酵母杂交等传统方法分离、仅仅鉴定了3个转录激活因子(ace2、hap2/3/5、xyr1)和2个阻遏蛋白(creⅰ、aceⅰ)。同时也有研究表明阻遏蛋白的缺失可以显著提高里氏木霉外分泌蛋白的表达水平。基于里氏木霉纤维素酶表达调控的复杂性，在其转录调控过程中应该还有许多关键的调控因子仍然没被发现。通过对一些具有转录因子典型结构的蛋白进行功能分析，研究其在纤维素酶半纤维素酶生物合成中的作用有望从机制本身进一步提高里氏木霉合成和分泌蛋白的能力。
里氏木霉trdrs2基因(genbank登录号：ncu00352)，编码磷脂转移atp酶(phospholipid-transportingatpase)，参与核糖体的组装，目前尚未见其与蛋白分泌途径相关的报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供来源于里氏木霉的trdrs2蛋白及其相关生物材料在调控里氏木霉(trichodermareesei)合成和分泌蛋白能力中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供了如下a-c中任一种物质在调控里氏木霉(trichodermareesei)胞外蛋白分泌量中的应用；
a、trdrs2蛋白；
b、编码所述trdrs2蛋白的核酸分子；
c、含有所述核酸分子的表达盒或重组载体或重组细胞；
所述trdrs2蛋白为如下a1)-a4)中任一种：
a1)序列表中序列6所示的蛋白质；
a2)在a1)所述蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；
a3)将a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与里氏木霉胞外蛋白分泌量相关的蛋白质；
a4)与a1)具有98％以上同一性且与里氏木霉胞外蛋白分泌量相关的蛋白质。
为了实现上述目的，本发明又提供了b1)或b2)所示的物质在提高里氏木霉(trichodermareesei)胞外蛋白分泌量中的应用：
b1)使里氏木霉(trichodermareesei)中trdrs2蛋白活性丧失的物质；
b2)敲除里氏木霉(trichodermareesei)中编码trdrs2蛋白的核酸分子的物质；
所述trdrs2蛋白为如下a1)-a4)中任一种：
a1)序列表中序列6所示的蛋白质；
a2)在a1)所述蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；
a3)将a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与里氏木霉胞外蛋白分泌量相关的蛋白质；
a4)与a1)具有98％以上同一性且与里氏木霉胞外蛋白分泌量相关的蛋白质。
上述应用中，所述编码trdrs2蛋白的核酸分子为如下c1)-c3)中任一种：
c1)序列表中序列1或序列2所示的dna分子；
c2)与c1)具有95％以上同一性且编码所述蛋白质的dna分子；
c3)在严格条件下与c1)或c2)任一种限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白的dna分子。
其中，序列表中序列1所示的dna分子为里氏木霉trdrs2基因的cdna序列，由4188个碱基组成；序列表中序列2所示的dna分子为里氏木霉trdrs2基因及其上下游各2500bp的基因组dna序列，序列表中的序列2的第1-2500位为所述trdrs2基因上游2500bp序列，序列表中的序列2的第6689-9188位为所述trdrs2基因下游2500bp序列，所述trdrs2基因及其上下游序列可见如下网站：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/cp016236.1？report＝genbank&log$＝nucltop&blast_rank＝1&rid＝g7gav51w014。
上述应用中，所述敲除里氏木霉(trichodermareesei)中编码trdrs2蛋白的核酸分子的物质为敲除里氏木霉(trichodermareesei)中编码trdrs2蛋白的核酸分子的dna片段或含有所述dna片段的重组载体或含有所述dna片段的重组细胞。
进一步的，所述敲除里氏木霉(trichodermareesei)中编码trdrs2蛋白的核酸分子的dna片段含有trdrs2基因上游同源臂和trdrs2基因下游同源臂。
其中，所述同源重组中采用的上游同源臂可选自trdrs2基因上游序列，长度至少1000bp，所述同源重组中采用的下游同源臂可选自trdrs2基因及其下游序列，长度至少1000bp。在本发明的实施例中，所述同源重组中采用的上游同源臂的核苷酸序列可为序列表中序列3的第1-2000位(即序列2的第501-2501位)，所述同源重组中采用的下游同源臂的核苷酸序列可为序列表中序列3的第6189-8188位(即序列2的第6689-8688位)。
更进一步的，所述敲除里氏木霉(trichodermareesei)中编码trdrs2蛋白的核酸分子的dna片段为序列表中序列4所示的dna片段。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种重组里氏木霉菌的构建方法。
本发明提供的重组里氏木霉菌的构建方法为如下m1)或m2)：
m1)包括如下步骤：使里氏木霉(trichodermareesei)中trdrs2蛋白活性丧失，得到所述重组里氏木霉菌；
m2)包括如下步骤：敲除里氏木霉(trichodermareesei)中编码trdrs2蛋白的核酸分子，得到所述重组里氏木霉菌。
上述方法中，所述m2)中，所述敲除里氏木霉(trichodermareesei)中编码trdrs2蛋白的核酸分子的方法可为同源重组、随机插入突变或rnai。
进一步的，所述同源重组中采用的上游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列3的第1-2000位，所述同源重组中采用的下游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列3的第6189-8188位。
更进一步的，用于发生同源重组的组件(敲除组件)由trdrs2基因上下游同源臂中插入便于筛选转化子的筛选标记基因组成。在本发明的实施例中，所述同源重组通过将序列表中序列4所示的dna片段导入所述里氏木霉(trichodermareesei)实现。序列表中序列4第1-2000位为trdrs2的上游同源臂，第3914-5913位为trdrs2的下游同源臂，第2001-3913位为pyr4基因。其中，pyr4为筛选标记基因，是营养选择性标记基因乳清酸核苷-5'-单磷酸脱羧酶的基因。
为了实现上述目的，本发明最后提供了如下n1)-n6)任一所述的生物材料：
n1)由上述方法构建得到的重组里氏木霉菌；
n2)上述使里氏木霉(trichodermareesei)中trdrs2蛋白活性丧失的物质；
n3)上述敲除里氏木霉(trichodermareesei)中编码trdrs2蛋白的核酸分子的物质；
n4)上述敲除里氏木霉(trichodermareesei)中编码trdrs2蛋白的核酸分子的dna片段；
n5)含有n4)所述dna片段的重组载体；该重组载体用于保存敲除组件；
n6)含有n4)所述dna片段的重组细胞；该重组细胞用于保存敲除组件。
上述方法或上述生物材料在制备或合成或表达胞外蛋白中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述应用或方法中，所述重组细胞可为非人的动物细胞、微生物细胞或植物细胞。
上述任一所述应用或方法中，所述胞外蛋白包括里氏木霉(trichodermareesei)的内源蛋白，如纤维素酶和/或半纤维素酶，还可包括导入里氏木霉(trichodermareesei)的外源蛋白。其中，在不包含外源蛋白的里氏木霉菌株中，所述调控里氏木霉(trichodermareesei)胞外蛋白分泌量可体现为调控纤维素酶和/或半纤维素酶的分泌量。
上述任一所述应用或方法中，所述里氏木霉为里氏木霉菌株tu6△tku70。
本发明的实验证明，将里氏木霉出发菌株中的trdrs2基因敲除后得到了胞外蛋白分泌量明显增加的trdrs2基因敲除株，说明trdrs2是与里氏木霉(trichodermareesei)胞外蛋白分泌量相关的一个调控基因，敲除trdrs2基因可提高里氏木霉合成和分泌蛋白的能力。本发明为构建胞外蛋白分泌量增加的里氏木霉宿主菌和工程菌提供了技术基础。
附图说明
图1为trdrs2敲除菌株的pcr鉴定图谱。pa：出发株；t1-t7：转化子。
图2为trdrs2敲除菌株和出发菌株发酵上清液的sds-page分析。1-3：t.reesei出发株；4-6：t.reesei△drs2；m：蛋白分子标准。
图3为trdrs2敲除菌株和出发菌株发酵上清液蛋白浓度测定结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
下述实施例中的所有引物均由上海生工合成。
下述实施例中所涉及的里氏木霉菌株tu6△tku70为尿嘧啶营养缺陷菌株，由奥地利维也纳大学monikaschmoll实验室馈赠，tu6△tku70即为如下文献中的ku70.4转化子(将红褐肉座菌(hypocreajecorina，即trichodermareesei的有性型)tu-6菌株中的tku70缺失得到的转化子)：genetargetinginanonhomologousendjoiningdeficienthypocreajecorina.zhangguangtaoa,etal.journalofbiotechnology139(2009)146–151.，公众可从福建师范大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中所涉及的培养基、试剂的配方如下：
1)土豆培养基pda(100ml)：20g去皮马铃薯，切碎，加入90ml水，煮沸30min，双层纱布过滤，加入2g葡萄糖和1.8g琼脂粉，用水定容至100ml，115℃高压蒸气灭菌。
2)基本培养基(minimalmedium，mm)：溶剂为水，每升培养基中溶质及其质量为：0.05g(nh4)2so4，0.15gkh2po4，0.006gmgso4，0.006gcacl2，0.00005gfeso4·7h2o，0.000016gmnso4·h2o，0.000014gznso4·7h2o，0.00002gcocl2。
3)发酵培养基：在mm培养基中加入下列碳源(如2％纤维素、2％乳糖、2％葡萄糖、2％甘油，终浓度)之一，ph5.2±0.1。
a1、含1.0m山梨醇但不含尿苷的mm培养基平板：在mm中加入山梨醇至终浓度为1.0m，再加入琼脂制成固体培养基。
a2、mm 0.1％tritonx100的平板：在含有2％葡萄糖的mm中加入tritonx100至体积终浓度为0.1％，再加入琼脂制成固体培养基。
a3、含2％葡萄糖的mm液体培养基：在mm中加入葡萄糖至终浓度为2％(质量百分浓度)得到的液体培养基。
a4、mm 2％微晶纤维素液体培养基：在mm中加入微晶纤维素至终浓度为2％(质量百分浓度)得到的液体培养基。
4)lb培养基：溶剂是水，每升培养基中溶质及其质量百分含量为：1％蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母提取物。
5)里氏木霉染色体dna提取缓冲液(ph7.5)：
edta1mm
磷酸缓冲液50mm
甘油5％
6)原生质体制备及转化相关试剂：
0.2m磷酸缓冲液ph7.4(每100ml)
0.2mna2hpo481ml
0.2mnah2po419ml
1.2mol/l的mgso4溶液
mgso41.2m
磷酸缓冲液ph7.410mm
0.6m的山梨醇溶液
山梨醇0.6m
tris.clph7.00.01m
1.0m的山梨醇溶液
山梨醇1.0m
cacl20.01m
tris.clph7.50.01m
peg溶液
peg400050％
cacl20.05m
tris.clph7.50.01m
实施例1、敲除里氏木霉trdrs2基因构建胞外蛋白分泌量增加的重组里氏木霉菌
本实施例中，通过将序列表中序列4所示的dna片段(敲除组件)导入里氏木霉出发菌株-里氏木霉菌株tu6△tku70中通过同源重组将trdrs2基因敲除得到了胞外蛋白分泌量明显增加的trdrs2基因敲除株(重组里氏木霉菌)。
一、trdrs2基因敲除的重组里氏木霉菌的构建
1、trdrs2基因(含两侧同源臂)及pyr4基因表达盒的pcr扩增
1)以里氏木霉菌株tu6△tku70基因组dna为模板，分别采用pdrs2-1f/pdrs2-1r引物对和pdrs2-3f/pdrs2-3r引物对进行pcr扩增，分别扩增得到大小为2000bp的trdrs2上游同源臂、大小为2000bp的trdrs2下游同源臂。
扩增程序为：98℃预变性30s，98℃变性10s，68℃退火20s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃扩展延伸5min。
2)以里氏木霉菌株qm9414(atcc26921)基因组dna为模板，采用pdrs2-2f/pdrs2-2r引物对进行pcr扩增，扩增得到大小为1913bp的营养选择性标记基因乳清酸核苷-5'-单磷酸脱羧酶的pyr4基因。
扩增程序为：98℃预变性30s，98℃变性10s，68℃退火20s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃扩展延伸5min。
3)将步骤1)和2)所得pcr产物分别于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定大小并测序，结果表明所扩增的上游同源臂为序列表中序列4第1-2055位所示的序列，所扩增的pyr4基因为序列表中序列4第1978-3933位所示的序列，所扩增的下游同源臂为序列表中序列4第3914-5913位所示的序列。
所用到的引物序列如下：
pdrs2-1f：ctccaaggtgttggggatcgtgtgccgcgtttcttgggcgttgctgg；
pdrs2-1r：gatacccgatattgcgactttgggggccggaggacgagcagtggttag；
pdrs2-2f：ctaaccactgctcgtcctccggcccccaaagtcgcaatatcgggtatc；
pdrs2-2r：caattttttctttgctttttcaactgcatccaaaccatcctac；
pdrs2-3f：gtaggatggtttggatgcagttgaaaaagcaaagaaaaaattg；
pdrs2-3r：tttggtgtgaagaggggagggggatatgtaaggggaaattggggtc。
2、psk骨架的pcr扩增
以商业化质粒pbluescriptiisk( )(stratagene公司)为模板，分别采用psk-f/psk-r引物对进行pcr扩增，得到大小为2899bp的psk骨架，其末端分别含有大小为25bp的trdrs2上游同源臂、大小为25bp的trdrs2下游同源臂。
扩增程序为：98℃预变性30s，98℃变性10s，68℃退火20s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃扩展延伸5min。
所用到的引物序列如下：
psk-f：ccaccacatacatacagacagaccccaatttccccttacatatcc；
psk-r：gcacacgatccccaacaccttggagcaattcgccctatagtgagt。
3、里氏木霉pdrs2敲除载体的构建及敲除组件的获得
1)采取nebgibson
1-1)以骨架的加样量为30-50ng为标准来确定骨架片段的添加量。
1-2)根据骨架片段大小与所加体积将其换算成摩尔数。
1-3)以骨架为标准，保证加样时插入片段和骨架片段的摩尔比例为1:2-1:3，插入片段间的摩尔比为1:1，从而得到各个片段的摩尔数。
1-4)用摩尔数除以相应浓度得到各个片段所需的加样体积。
1-5)将每个片段添加相应的体积到pcr管中，随后添加等量(片段总体积)的gibson
1-6)将混合液在50℃下孵育60min，最后取2μl反应液转化大肠杆菌感受态细胞。
2)将混合后的四个片段进行连接，然后转化大肠杆菌，再挑取转化子进行测序鉴定，即得到trdrs2基因的敲除载体pdrs2。
3)以质粒pdrs2为模板，采用pdrs2-1f/pdrs2-3r引物对进行pcr扩增，扩增条件为：98℃预变性30s，98℃变性10s，68℃退火20s，72℃延伸3.6min，30个循环；最后72℃扩展延伸5min。pcr扩增所得的产物即为包含trdrs2基因上下游同源臂以及pyr4基因表达框的敲除组件片段，其序列如序列表中的序列4，序列4的第1-47位为pdrs2-1f，第5868-5913位为pdrs2-3r的反向互补序列，第1-2000位为trdrs2的上游同源臂，第3914-5913位为trdrs2的下游同源臂，第2001-3913位为pyr4基因片段。
4、里氏木霉菌株tu6△tku70的原生质体制备
a.取新鲜培养的斜面或平板(培养基是pda)上的里氏木霉菌株tu6△tku70孢子，用适量无菌水洗涤孢子制成孢子悬液，200目筛子过滤除去残余的菌丝。将过滤的孢子悬液接种至装有100mlmm培养基的500ml三角瓶中，28℃培养13-14h，至菌丝伸展。
b.将培养液经200目筛子过滤，收集菌体，无菌水洗涤2-3次，最后用1.2m的mgso4溶液洗涤一次，让溶液自然流尽。
c.将筛子上的菌体冲洗到装有15ml裂解液的三角瓶中(裂解液是含有150mg裂解酶和15mg纤维素酶的1.2mmgso4溶液)，30℃反应1.5h，显微镜下观察原生质体产生的情况，1h后每隔10min取样观察一次。
d.当原生质体大量产生并且仍有大量菌丝存在时，加等体积0.6m的山梨醇溶液终止反应，200目筛子过滤除去残余的菌丝，室温3000rpm离心10min，收集原生质体沉淀。
e.沿着沉淀一侧倒去上清，原生质体沉淀用1.0m山梨醇溶液重悬，室温3000rpm离心10min。
f.重复步骤e，弃上清将原生质体悬浮于200μl1.0m山梨醇溶液中，得到里氏木霉菌株tu6△tku70的原生质体，血球板计数器观察并计数。
5、trdrs2敲除组件转化里氏木霉菌株tu6△tku70原生质体
a.将步骤3中用pdrs2-1f/pdrs2-3r引物对进行pcr扩增获得的敲除组件(其序列如序列表中的序列4)进行回收并用2倍体积的无水乙醇及1/10体积的3.0m醋酸钠溶液(ph5.2)过夜沉淀，然后用70％乙醇溶液洗涤2次，再用灭菌ddh2o溶解，使敲除组件的浓度达每微升微克级。
b.将一定量(体积不超过20μl)制备好的敲除组件加入到步骤3制备的里氏木霉菌株tu6△tku70原生质体中，轻轻混匀，再往其中加入50μlpeg4000，再次混匀，冰上放置30min；同时用等体积的无菌水代替dna作为对照组。
c.再往上述管中各加入1mlpeg4000，混匀，室温放置20min。
d.加入1ml1.0m山梨醇溶液，混匀后分四次与四支4ml融化的mm培养基(58℃以下)混合，立即铺于含1.0m山梨醇但不含尿苷的mm培养基平板上，30℃培养4～7天。在不含尿苷的mm培养基中，只有转入pyr4的菌株才能生长。
6、转化子的筛选及分子鉴定
待转化子长出后，将其转移至pda平板上，28℃培养3-5天有孢子生成后，将平板上的孢子用无菌水将孢子洗下来制备成孢子悬液，做梯度稀释后，将其涂布在mm 0.1％tritonx100的平板上分单孢。待菌丝长出后，抽提基因组dna，pcr鉴定阳性转化子，所用鉴定引物如下：
pdrs2-4-f：tgtacatgttgagctatgac；
pdrs2-pyr4-r：gagatggcacaattctgctgtg；
pdrs2-drs2-r：ccaggtcgtcgtcattgag。
序列表中的序列2是trdrs2基因及其上下游2500bp的片段。pdrs2-4-f对应于序列2的第372-391位，pdrs2-drs2-r对应于序列2的2612-2630位。序列表中的序列5是里氏木霉trdrs2敲除菌株的trdrs2基因被pyr4替换后的基因组序列。pdrs2-4-f对应于序列2的第372-391位，pdrs2-pyr4-r对应于序列5的第2743-2764位。
其中，pdrs2-4-f引物结合于敲除组件中同源臂的外侧序列，pdrs2-pyr4-r位于pyr4基因序列中，pdrs2-drs2-r位于drs2基因序列中，如果trdrs2敲除组件定点整合在trdrs2位点，则pdrs2-4-f/pdrs2-pyr4-r引物对理论上应该扩增出大小为2393bp的片段，pdrs2-4-f/pdrs2-drs2-r引物对不应该扩增出片段。而出发菌株里氏木霉菌株tu6△tku70则为pdrs2-4-f/pdrs2-pyr4-r引物对无法扩增出片段，pdrs2-4-f/pdrs2-drs2-r引物对理论上应该扩增出大小为2259bp的片段。用pdrs2-4-f/pdrs2-pyr4-r扩增出大小为2393bp的pcr产物，用pdrs2-4-f/pdrs2-drs2-r引物对无法扩增出pcr产物的菌株即为trdrs2敲除菌株(记作t.reesei△drs2)，其pcr鉴定结果如图1。其中，pa为里氏木霉菌株tu6△tku70dna为模板，t-1～t-7为筛选转化子dna为模板。p1：采用pdrs2-4-f/pdrs2-pyr4-r引物对的pcr扩增产物；p2：采用pdrs2-4-f/pdrs2-drs2-r引物对的pcr扩增产物。最终筛选得到t-1、t-2、t-3、t-5和t-7为目标里氏木霉△drs2同核体，t-4和t-6则为杂合子。
trdrs2敲除菌株(记作t.reesei△drs2)的基因组序列为将里氏木霉菌株tu6△tku70基因组序列中的trdrs2基因序列替换为pyr4基因序列后得到的序列。
二、对照株、敲除菌株发酵液蛋白表达分泌差异分析
在步骤一得到遗传稳定的转化株后，将里氏木霉菌株tu6△tku70(t.reeseiwt，简称wt)与trds2敲除菌株(t.reesei△drs2，简称△drs2)转至pda平板上产孢，然后用无菌水洗涤孢子并用200目筛子过滤制备成孢子悬液，添加孢子悬液于含有50ml含2％葡萄糖的mm液体培养基的250ml三角瓶中，使其终浓度为108个/ml，28℃，200rpm预培养48h，添加20％微晶纤维素液体培养基5ml，28℃，200rpm震荡培养168h，期间，从48h开始，每隔24h取发酵上清液(胞外发酵液)，进行sds-page电泳分析。里氏木霉菌株tu6△tku70和trdrs2敲除菌株的培养条件及接种量完全相同。每次取样的里氏木霉菌株tu6△tku70和trdrs2敲除菌株的发酵上清液体积相同。每次取样，里氏木霉菌株tu6△tku70和trdrs2敲除菌株各取三瓶。对发酵168h后的里氏木霉菌株tu6△tku70与trdrs2敲除菌株的分泌蛋白进行sds-page电泳(图2)，结果表明，trdrs2敲除菌株外分泌蛋白的量均显著高于里氏木霉菌株tu6△tku70。
对168h发酵上清液的总蛋白浓度进行测定，具体方法如下：
(1)在酶标板中加入20μl适当稀释的样品液，均设置1个重复对照。同时设置标准组：7个标准品，各设1个重复，分别加入20μl浓度分别为0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml的bsa(牛血清血蛋白)标准液。
(2)各酶标孔同时加入200μlbradford工作液，即刻混匀。
(3)室温(25-30℃)反应5min后，以0μg/ml样品孔读数值为空白参照，以酶标仪读取各孔的a595值。
(4)以标准组中的a595两对照平均值为纵坐标，所对应的蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
(5)以标准曲线为参照计算出其稀释后的蛋白质浓度值，并由稀释倍数计算得到原样品蛋白质浓度。
检测结果表明：里氏木霉trdrs2敲除菌株△drs2的蛋白浓度为158.21μg/ml，里氏木霉菌株tu6△tku70的蛋白浓度为55.54μg/ml(图3)，敲除trdrs2基因后，里氏木霉的外分泌蛋白浓度是出发菌株蛋白浓度的3倍，trdrs2敲除菌株比里氏木霉菌株tu6△tku70胞外蛋白分泌量明显提高。说明trdrs2基因具有调控里氏木霉胞外蛋白分泌量的功能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>福建师范大学
<120>trdrs2蛋白及其相关生物材料在调控里氏木霉合成和分泌蛋白能力中的应用
<160>6
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>4188
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>1
atggctggacgacatcccataggaggccatggcgggccctcgaccaccgacgacctgctg60
ctcgacctggacaatgagcagcccgtctacaacgccggccagcggtcggccctcaatgac120
gacgacctggcgcgggcctacgagcacgaccacgacaacgacccccagagccgcccgtcg180
gtgtcgtacgacgactttgtcggcgccgagccgtcatatcccccagcagggcgccccggc240
ctggcgcaggcagcgcagccgtcggggcagtcgtcgggcccgtaccacgctcagcagttc300
agccagtcgtcggacctcgacaacttcccgcgctacgccgacgacttcgacgacgacgac360
atgtactaccagcacggcggcgcggcgggcgcggggccggcgtcggctggcagggacaat420
gcgagggcccgcaacagcgtgctgtcgctgggaggcggcctctttggcaagctgaagcac480
cgcctgggcatgggccagggctactccgagatggacctccccttgacggagccgggccac540
gatcgaggcggccccatagcgggctcgtcgcagccgccggaccagcagcccgcgggcaag600
aaggcgggcaacttcaagtttggctttggccgcggcaagcccgatcccgcgtccctgggc660
ccgagaatcatccacctcaacaacccgcccgccaacgcggccaacaagtacgtcggcaac720
cacatctcgacggcaaagtacaacgtcgccacgttcctccccaagttcctctttgagcag780
ttctccaaggtcgccaacatcttcttcctcttcacggccgcgttgcagcagatccccgga840
ctgtcgcccaccaacaagtacaccacaatcggacccctggctgttgtgctcctggtttct900
gctggcaaggaattggtggaggattaccggagaagagtggcggacaatgccctcaacaca960
tccaaggcgcgagtcctgcgcggctcgacgtttacggaaacgaaatggaacaccgtggcc1020
gtgggcgacgtggttagggtcgagtccgaggagccgttccccgccgatctggtgcttctg1080
gcaagttccgagcccgagggtctctgttatatcgaaacggcgaacctggatggcgagacc1140
aacttgaagatcaagcaggccctccccgagacgtcgacgctggtgtcccccagcgaagtc1200
agccggctgggaggtcgcatcaagtcggagcagcccaacagcagtctgtacacgtacgaa1260
gcgacgctgatcatgcaagccggaggaggagaaaaggagctggcactgaaccctgagcag1320
ctgcttctccgaggtgccactctgagaaacactccctggatccacggcatcgtcgtcttc1380
accggccacgagaccaagctgatgcgaaacgcgaccgcgacgccgatcaagcggaccaag1440
gtcgagaggcagctcaactggctcgtgctcatgctggtcggcatgctgctggtgctcagc1500
gtcatcagtaccattggagacttggtgatgcgaggcgccaccggcgattcgctttcgtat1560
ctctacctggacaagatcgacagcgctggcgttgcggcctcgacgttcttcaaggacatg1620
gtcacgtactgggtgctcttctccgcgctggtccccatctccctctttgtcacggtggaa1680
ttggtcaagtattggcacggcatcctcatcaacgacgacctcgacatgtactacgacaag1740
acggatacgccggccacttgccgaacgtcgagtctggtcgaggagcttggcatggtcgag1800
tacgtgttctctgacaagactggcacgctcacttgcaacatgatggagttcaagcagtgc1860
tcgattggcggcatcatgtatgccgaagaggttcccgaggaccgccgagcgagcggcgcc1920
gacgacgaagagacggctatttacgacttcaaggcgctccaggccaacctgacccaaggc1980
catccgaccgcgggcatgattgatcatttcctttcgctgctcgcaacctgccacacggtc2040
atccccgagatggatgaaaagggtcagatcaagtaccaagcggcctctcccgacgaaggt2100
gccctggtggccggagcggttaccatgggatacaagtttactgcacgaaagccaaagtcg2160
gtcattatagaagccaacgggcgagagatggaatacgagctgctggccgtctgcgaattc2220
aactcgacgcgcaagcgaatgtctgccatcttccgctgcccggacggaaagattcgagtc2280
tactgcaaaggtgccgacaccgtcattcttgagcggctcaacgatcagaacccccacgtc2340
gaaatcaccctgcggcacctggaggagtacgcctcggaggggctgcggacgctctgcttg2400
gccatgcgcgaggtgcccgaacaggagtaccgcgaatggcgccagatctttgacacggcg2460
gcgacgacggtgggcggcaaccgagccgatgagctggacaaggctgccgaaatcattgaa2520
cacgacttttacctcctgggagctactgccattgaggaccgcctgcaagacggcgttccg2580
gagacgatccacacgctgcagcaagccaacatcaaggtctgggttctgacaggagaccga2640
caggaaacggccatcaacattggcatgagttgcaagctcctgagcgaggacatgatgctc2700
ttgattgtcaacgaagagtcgtcggccgcaactcgtgataacatccaaaagaagctcgat2760
gccatcaggacgcaaggcgacggtaccattgagatggagtccctggcgctcgtcattgac2820
ggcaagtccctgacatatgcgctcgagaaggacatggagaagcttttcctcgatctcgcc2880
atcatgtgcaaggccgtcatctgctgccgtgtgtcccccctgcaaaaggccctggtcgtc2940
aagctcgtcaagaagtaccagaagcagtcgattctcctcgccattggcgacggggccaac3000
gacgtctccatgatccaggcggcgcacattggcgtcggcatcagcggtgttgaaggtctg3060
caggccgctcggagcgccgacgtggccattgcccagttcaggtacctccggaagctgctg3120
cttgtccacggcgcgtggagttaccagcgcgtgagcaagacgattctgttttcgttctac3180
aagaacattgccctgtatctgacgcagttctggtacacgttccaaaacgtcttctccggc3240
caggtcatttacgagtcgtggacgttgtccttctacaacgtcttctacaccgttcttccg3300
ccgctggccattggcattctggaccagttcatctctgcgcgcctgctcgatcgctacccc3360
cagctgtacatgatgggccagcagaattccgccttcaagctcaaggtctttgcgcagtgg3420
atcgccaacgccatctaccactccctcctcctctacgtctttgccgagctcatctggtac3480
ggcgacgtgattgacggccaggggcagaccgacggccactgggtgtggggaaccgccctg3540
tacggctccgtcctgctcaccgtgctgggcaaggcggccttggtgaccaacaactggacc3600
aagtaccatgtcatggccatcccgggcagcatggtcatctggtgggtgttcatcgccgtg3660
tacggcactgtggcgcccaaggtcaagatttcccccgagtactttggcgtcatccccaag3720
ctgtacagcagccccgtcttctggctgcagatattcgtccttgccctgctgtgtctgtcg3780
cgcgatattgcttggaagtacgccaagcgcatgtactggccgcagacgtaccaccacatt3840
caggagattcaaaaatacaacattcaggactaccggcctaggtatgtacacgtgcccagc3900
acagcccctctcctcccctcttcttgccccaggaatccatctgcggtttgaatagaggca3960
tgtctatatatgagagagagccacgcgctaacgtgccatgacaggatggagcaattccag4020
aaagccatccgcaaggttcggcaggtgcagcgtatgcgcaagcagcgtggctatgccttt4080
tcgcaggccgacgagagccagacgcgcgtgcttcaggcatacgacacgaccaagcaccga4140
ggccgatatggagaaatggccagctcacgacctatagacgggatataa4188
<210>2
<211>12500
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>2
aaaggacgagatggaccgcgccaagaacgggccgccgctgaggtttgagatgccggcgct60
gtttgttgcggcgagcaaggacaatgctttgccgccggccatgtccaagggcatggacgc120
tttctacaaggaccttaccagggccgaggtggatgctacgcattgggctttgacgcaggc180
tggggatgaggtcaatcgggtgattggagagtggttgaacaaggcgctcaatggtgcgac240
caaggctgcgttgtagaaatcgaggagaatattcaaatgatcatgaattgggctaacata300
aggaaacccccgacttgcttggatctcagcatttgctagacatctggtagcagcttgctg360
taactcccttttgtacatgttgagctatgaccgtatacccctgaatatagttcccgtaga420
atctagttgtgccgtccatatcgtttcgaggttgacaggtatcaagtaaacatttcttcg480
tgactctgcctccaacatgtctccaaggtgttggggatcgtgtgccgcgtttcttgggcg540
ttgctggtgttgaacaaacatgctgttgctttgtggccacacgcacatacacacacacgc600
cgctttggggagattccgttcactgcttcgcgccccttctgctttagtaccttcaagagt660
ccattaattgattcattcctggcgagtcatttcacttcagagtgtttttgtaagcatcaa720
cagtcggtgccttggaggtggactttttgtttggctttccacacatgggacatgctgtgt780
gctaatgtgagcttgggtgttcatgtgaagggggaaaaggcggagagactcacagtccgt840
ctggtaggcacacttctggcaataggaatggccttgagtgattttggttttgcactttga900
gcacgaactattcccactgtcagtcaaaagcgcaatgcacatatagagaatgcgattgcg960
taggtaggatggtgcacatacctggagtactgtgcgtatggattctttgctgcttttgac1020
agcagcttgctctggaggcccgttagcgagcattatcgaggaatgacgggaagcagtctt1080
cgtttacctttgacactccggtgttgcccagagttgctgatttggagctgcctgcctttg1140
cgctggctggcgagccgtagtacatttcgctcttcttcttgacctctggagtcgcaagct1200
tggtgctcttggtgagcttcagacacttgctgcacaccatcgcggcgtctgaatgggggg1260
tttatctgattgagtcgggttgagtatcgatggatttgataaggaatatgtcagatagcg1320
ttcgatactattgtccgtggttcagcttgatggccgcatgctcgactttctggtgtttga1380
tgggtgaatcgcagtggcaaggctgacatcaacggcaacgcgaaacccggcactccgtac1440
ggcttccgcggccatactgttccgaattcccaacgaccagctgcaaagtatcctcaaccg1500
tgctctggcattcggcaaggtaccatgctcgcacaatctcgctggtgggggactttgtcg1560
caaaagggacaacgctcagggggacccgccaaacaggcctctcagcagtggagcagcagc1620
agcacatcagtgcagttcaaggcgaggtccagcctgtggcatccccccaagcgatccatg1680
gatgcgctagagcacttgcagagagagcgctggagcccttggacgacgttgaccccggac1740
ggccccctttcaggccacttggcgcaagagagcttccaggtcatcaagggttcaagacgg1800
gctcgtatgcatcagatcaaatcaaacagcatcccaggggagcgctggagaacttgagct1860
tacaggtgtttggcattgatccgtgctcccagtctataattattaccctacgggggacct1920
ctcgggtatcagcgccttggtcgcagaactgcactgagctttcgtgcccccaagattcaa1980
atcgtcgggtccaactgcgcctctgtttcactgccgacagtgctgacgtaccaaacgcct2040
gagcctcgacagcgtcccgctacggagtgggagcgatttagcggcagctcgccgaaacga2100
ggctgtgcagggacgggaaccttcattggattggaacaccttctcgaacgctttttttta2160
gcggaacagcatcagactctacagcgagcggccctgccctatcgatatcgcgggaccaga2220
ccaggtgtcgaccccgatcgttctcgagctgctgtgcgagtccgtctcctgcatacctaa2280
cctaaggaacctctacctatagacatccaatacattcgcatccacccgcgagcggctgcg2340
gtttcacattccagccctcccacggacgcagcgaaacagccgcgaaacatccaaaaacac2400
cacaacacacacagcttctcgggctggcccaccctcatcgaagcccgcatgcgttgcccc2460
tccgcctcagcgaccgcctaaccactgctcgtcctccggcatggctggacgacatcccat2520
aggaggccatggcgggccctcgaccaccgacgacctgctgctcgacctggacaatgagca2580
gcccgtctacaacgccggccagcggtcggccctcaatgacgacgacctggcgcgggccta2640
cgagcacgaccacgacaacgacccccagagccgcccgtcggtgtcgtacgacgactttgt2700
cggcgccgagccgtcatatcccccagcagggcgccccggcctggcgcaggcagcgcagcc2760
gtcggggcagtcgtcgggcccgtaccacgctcagcagttcagccagtcgtcggacctcga2820
caacttcccgcgctacgccgacgacttcgacgacgacgacatgtactaccagcacggcgg2880
cgcggcgggcgcggggccggcgtcggctggcagggacaatgcgagggcccgcaacagcgt2940
gctgtcgctgggaggcggcctctttggcaagctgaagcaccgcctgggcatgggccaggg3000
ctactccgagatggacctccccttgacggagccgggccacgatcgaggcggccccatagc3060
gggctcgtcgcagccgccggaccagcagcccgcgggcaagaaggcgggcaacttcaagtt3120
tggctttggccgcggcaagcccgatcccgcgtccctgggcccgagaatcatccacctcaa3180
caacccgcccgccaacgcggccaacaagtacgtcggcaaccacatctcgacggcaaagta3240
caacgtcgccacgttcctccccaagttcctctttgagcagttctccaaggtcgccaacat3300
cttcttcctcttcacggccgcgttgcagcagatccccggactgtcgcccaccaacaagta3360
caccacaatcggacccctggctgttgtgctcctggtttctgctggcaaggaattggtgga3420
ggattaccggagaagagtggcggacaatgccctcaacacatccaaggcgcgagtcctgcg3480
cggctcgacgtttacggaaacgaaatggaacaccgtggccgtgggcgacgtggttagggt3540
cgagtccgaggagccgttccccgccgatctggtgcttctggcaagttccgagcccgaggg3600
tctctgttatatcgaaacggcgaacctggatggcgagaccaacttgaagatcaagcaggc3660
cctccccgagacgtcgacgctggtgtcccccagcgaagtcagccggctgggaggtcgcat3720
caagtcggagcagcccaacagcagtctgtacacgtacgaagcgacgctgatcatgcaagc3780
cggaggaggagaaaaggagctggcactgaaccctgagcagctgcttctccgaggtgccac3840
tctgagaaacactccctggatccacggcatcgtcgtcttcaccggccacgagaccaagct3900
gatgcgaaacgcgaccgcgacgccgatcaagcggaccaaggtcgagaggcagctcaactg3960
gctcgtgctcatgctggtcggcatgctgctggtgctcagcgtcatcagtaccattggaga4020
cttggtgatgcgaggcgccaccggcgattcgctttcgtatctctacctggacaagatcga4080
cagcgctggcgttgcggcctcgacgttcttcaaggacatggtcacgtactgggtgctctt4140
ctccgcgctggtccccatctccctctttgtcacggtggaattggtcaagtattggcacgg4200
catcctcatcaacgacgacctcgacatgtactacgacaagacggatacgccggccacttg4260
ccgaacgtcgagtctggtcgaggagcttggcatggtcgagtacgtgttctctgacaagac4320
tggcacgctcacttgcaacatgatggagttcaagcagtgctcgattggcggcatcatgta4380
tgccgaagaggttcccgaggaccgccgagcgagcggcgccgacgacgaagagacggctat4440
ttacgacttcaaggcgctccaggccaacctgacccaaggccatccgaccgcgggcatgat4500
tgatcatttcctttcgctgctcgcaacctgccacacggtcatccccgagatggatgaaaa4560
gggtcagatcaagtaccaagcggcctctcccgacgaaggtgccctggtggccggagcggt4620
taccatgggatacaagtttactgcacgaaagccaaagtcggtcattatagaagccaacgg4680
gcgagagatggaatacgagctgctggccgtctgcgaattcaactcgacgcgcaagcgaat4740
gtctgccatcttccgctgcccggacggaaagattcgagtctactgcaaaggtgccgacac4800
cgtcattcttgagcggctcaacgatcagaacccccacgtcgaaatcaccctgcggcacct4860
ggaggagtacgcctcggaggggctgcggacgctctgcttggccatgcgcgaggtgcccga4920
acaggagtaccgcgaatggcgccagatctttgacacggcggcgacgacggtgggcggcaa4980
ccgagccgatgagctggacaaggctgccgaaatcattgaacacgacttttacctcctggg5040
agctactgccattgaggaccgcctgcaagacggcgttccggagacgatccacacgctgca5100
gcaagccaacatcaaggtctgggttctgacaggagaccgacaggaaacggccatcaacat5160
tggcatgagttgcaagctcctgagcgaggacatgatgctcttgattgtcaacgaagagtc5220
gtcggccgcaactcgtgataacatccaaaagaagctcgatgccatcaggacgcaaggcga5280
cggtaccattgagatggagtccctggcgctcgtcattgacggcaagtccctgacatatgc5340
gctcgagaaggacatggagaagcttttcctcgatctcgccatcatgtgcaaggccgtcat5400
ctgctgccgtgtgtcccccctgcaaaaggccctggtcgtcaagctcgtcaagaagtacca5460
gaagcagtcgattctcctcgccattggcgacggggccaacgacgtctccatgatccaggc5520
ggcgcacattggcgtcggcatcagcggtgttgaaggtctgcaggccgctcggagcgccga5580
cgtggccattgcccagttcaggtacctccggaagctgctgcttgtccacggcgcgtggag5640
ttaccagcgcgtgagcaagacgattctgttttcgttctacaagaacattgccctgtatct5700
gacgcagttctggtacacgttccaaaacgtcttctccggccaggtcatttacgagtcgtg5760
gacgttgtccttctacaacgtcttctacaccgttcttccgccgctggccattggcattct5820
ggaccagttcatctctgcgcgcctgctcgatcgctacccccagctgtacatgatgggcca5880
gcagaattccgccttcaagctcaaggtctttgcgcagtggatcgccaacgccatctacca5940
ctccctcctcctctacgtctttgccgagctcatctggtacggcgacgtgattgacggcca6000
ggggcagaccgacggccactgggtgtggggaaccgccctgtacggctccgtcctgctcac6060
cgtgctgggcaaggcggccttggtgaccaacaactggaccaagtaccatgtcatggccat6120
cccgggcagcatggtcatctggtgggtgttcatcgccgtgtacggcactgtggcgcccaa6180
ggtcaagatttcccccgagtactttggcgtcatccccaagctgtacagcagccccgtctt6240
ctggctgcagatattcgtccttgccctgctgtgtctgtcgcgcgatattgcttggaagta6300
cgccaagcgcatgtactggccgcagacgtaccaccacattcaggagattcaaaaatacaa6360
cattcaggactaccggcctaggtatgtacacgtgcccagcacagcccctctcctcccctc6420
ttcttgccccaggaatccatctgcggtttgaatagaggcatgtctatatatgagagagag6480
ccacgcgctaacgtgccatgacaggatggagcaattccagaaagccatccgcaaggttcg6540
gcaggtgcagcgtatgcgcaagcagcgtggctatgccttttcgcaggccgacgagagcca6600
gacgcgcgtgcttcaggcatacgacacgaccaagcaccgaggccgatatggagaaatggc6660
cagctcacgacctatagacgggatataaaaaaagcaaagaaaaaattggggggaggaaag6720
agcaacagttttgtgttttaggggtgggctgtaatgatttttatctgccatcacgtctca6780
tgtcatcaagagagagagaaaaaaacagaggagggtggtgttactccttgggggggtgaa6840
aggacgaggaggagagggcaagcggcacacaagggaggtgcgtcccttttgtcctcgtta6900
tgccgattcggaagccagacgagggctatgatggttgattttgtttgctgtttgcggttt6960
ttctgaaactagctattatgccatatatgatgtctttgtctggggtgtctcttgttgggt7020
gttcttttcttgacatttattatcatggcttgttactgaaggggatgtgagatttctagg7080
tagaaggataggaaggcggttgaatggaaatttacattgacatgagatgcttggttattt7140
gaagtgaggagaggtaagagtgatggtagtgttggtatatggatgatgttgcacggtgcg7200
atgcattgagcttgaaatgaaacagccgtggagattcgatgttcactgagaagagttggc7260
ttgtatactggttgggtatagatatctcgtatgtcttgtgcctcattcgcacgatgtcta7320
ccgtacgatgaagaggaagcttccgcctgccggacgagcttcccatgccggagagtaact7380
ctctctctctaatctataataggtactttgccttgggccttacggtggcaccgtttgaag7440
cttatatcaagtcactgacaaaagtgtgtaaaggatggataaatctccataaacagattg7500
tttcgaacggaccttgggtgaatatcccgtagcagatgggacaatacgacactagattat7560
tgacaaagagtttcggagacacaatgtcacacaggacaacaacagactcctcccccacgg7620
ataagatagattagagtggcggagatccggagatgcacccttctgcatgacttgacgaga7680
agcgcaagagtctctaccaggtatttctgtaaggggactcgtcgtacgagtttgaacagc7740
aaatacctaagcaagagaggagtatgaacttgcacagcattatatgtgcgactacctaga7800
tacgctgtgtcacatgtttatatgccgcgatgctgttgtatcggcatctgttgcattgta7860
tacctaattagttgtcttgatgtccttaatactatcttctaaagtactaggtagttgata7920
ctatgaatagtctacctactttatatcgcacgcaaggggcgaagacaatgcgtggcgttg7980
catgaggcagtctcgcgcaccacgacacgacacaaagagcactttataggtaggtatgta8040
cctagttttttggctcctgttcatcccgaggcaggtgcactctagatagaagaggactag8100
gcagtgctgcgtttccatggcttcagataggtacctatctacctacctaccaaccaaggt8160
gttaccttattttgtgtatgacagcttttaccttaggtaatgagcagcacttcaagacgg8220
actctttagaagaaatcagaattcgagagccagctcaacaacggcaagagtgatactggt8280
atttgtcatctgcctacattgctggatgtgttaaatcaggcaaacctgacacaatatcgg8340
tacacagtctcaatgcctgatgcaaagccaactgatatcacatccgattctacctaaaag8400
cagcatcatgtacgagacggtattcttgacctgcatcaagctttcgcccccccccccccc8460
ccccccccccccccccccccccccccatatgcgtacgtcccgtatcacaggcatcaaaat8520
cccaccgatatcccatgcaggtcccccttccatctctcacagcttccccccctctgtaac8580
accacatgatgtacagtacaagccacgctgcaccgcagctctcctacataatgatactac8640
tactaacaccaccacatacatacagacagaccccaatttccccttacatatccccctccc8700
ctcttcacaccaaaaacggaaagaaaaaaaaataagaggagagagagataaggtccgtat8760
cattggtatgagagataacagctctgtagcaaaagattgacatcttgcatgcttatcagc8820
tggttctcttgattctgaatcctcaggccagaagacgcgccgacatcgctgatgtactcg8880
agacgattgcaacccaaaccaatcacatccatcacacttgtgcagaatgctgcctttcag8940
cgaaaatttaaccatgttcaataacattatcctttattcattgatttctcaattgcttcc9000
ttgccatctatgggttctgttcgcgtccccagagatgcatcgccgtcttttgataaagta9060
tatacataagttgactcccatgtacagttgcccaccaaacatcaaattaccatccaagta9120
cccatatgccgtgctttatatctaacccagtggacgtgtaataatcttgtgccaagaggc9180
cataacagtctttgtgaagtactaagagaaacaggaggaaaagggaagtgaagaaaagga9240
aaagaaaaagaatccacaagtcgagttcgacaagatgtcgaagcgaggcgacgtaacgct9300
ccggggtcaggattggtggattgcagtcacactatgcggtgcatggtgacaagcaagagc9360
ggctgataagagaagctcgagttgggatgttgaaaaagcgccgtgaggggcccagattga9420
agccgtccaaagtgggaaaggatccgaaatcccctcgctgccggaccactaatgacagtg9480
atcgaacagtgaaaacagttgaaaacatcaaaacttttgttgtgcgtaagtgtgtatctc9540
cctgaagaacgccaaagggaaaaaaaaagaaaggaagaatagaagaataacagttgtgcg9600
gagtgtggtgcgaatgggctcggcaacagcaaaggagccggacgagaccaggacctcaag9660
tcggttggaggtggcacaacagcgtgctgccagtcgacggcgagacccttgccgctgggc9720
atccgcacccctgtaaccccgcagtccgaatcaatgcgccgtttggccagaattctggca9780
aaatgcggaggcgcggtgtgcgtcggaggtcccatcacgacatctgcacgcgccagtcct9840
tgttcgtctgcgtcttattgcctggccacccccacagcggtggccgacgctcccaggcca9900
gtctggtgataggccgctgcgagcccagctgctgctagccggcgtgccgtgcgcaagggg9960
ggggaaaggggccgctagagacgctcgaggcggatgggactgcagccaaccgcttcgtcc10020
catctcagggcctcaaacaattaacccccccgccagcacacccacctggctgcgtccgaa10080
atcaccgagtcagcatggggatgacaagctcgacgctctttggccgcgagctgccgcctg10140
gggtcctcgagggcagcggccggtccatggccccagaccctgcctcgtgcgagtaggtgc10200
ccccgtaggccaggtcgagggtgctcgggtggctgtacagaaggctggccgatggtcgcg10260
tgtacgagttgttggggctggtagctgagctgcggctgaagggccagatgccactccccg10320
acggcgacggggggctgggtggcctcacgttgagggatcgcagggcagacatggccgagg10380
tgtggtagttgagcgcggtgtctggtgaagccggcggagagttggtgaagtgcatcgagc10440
tgggccgtgagggcgaggcccgtggcacaatgtctcgcggctcggacccggccaaggact10500
cggtcaggatgcggcgctggttgacgtagacagaggagtaatagctgcgaaccgacttgg10560
cctgcgcggacgagtcttggtctacccggcggcatctacacacatgtgtgttagtggacg10620
tgatcaacccagctcctccaaggttcgtcgtcaagaagagaaacatacgcatcggagcag10680
tacagaaccagctcgtcgtgggtgtggaattccttttcgcaaatcatgctgcaggaacac10740
aaaaggtcagttacatggcctcagcagcgtcacaaacaacaggagtggcttccataccag10800
tactgagggaagctctctcgctcgtcgttgtcccaaatctccgtgtcggtctcgcgacca10860
cctcgccccaacttctgggcggcggacggagtgtgtcgtcgagtcatggttggtcgcttg10920
tactgagcgggtgttgcggtcactgcctttcgcacgtctgttgtcgatgcggtggcagtg10980
taagggccggacttgcgtcgctggtgaggcatttggaatgcagatagaagaggagcaagg11040
gaaaaagtgcgtgggcgaactcgaggtgttatcctggcagctcggagagcgtgggggaaa11100
actaccaggaccgtccaaggcgtgagacgaccaaaatcagggaagccagacagaacgctg11160
tgctggctttatctccggcaggcagcgcagccaaatcaggcgggtgtatgcgacacgtcg11220
tattggagagtgcgcgagattaataagagagtgacgctttgctcgacaggcgtgacttgg11280
gctgaagaatgacgggaggtcacaccggcgtagagagggtgaagattgatcgacaggacc11340
cggaagatggaaggatgctgcagatcgattcgtcgggcagatttgctgttatccactctt11400
ggtgttcagttgacaggagcagagcgtcgactgctgagtagcttaaaagggccaaatata11460
gcagtggtatcgacggtcagatgataagcaccgcagagggtgagatgaggtggatgggag11520
ggcgtttggtgtaagtggtggcacgggatgaaggtctagtgctgggttgaccggaggctg11580
agctggactgtgatgtgtcgtcgataatggggtggtggtgtaaggcgtattcgcagattg11640
atggaggaagggaaaagaacggatgaggaagtagatttgaacgagagtgagaggaggaag11700
aggaggaggaagaggtcggaaaagactggcgtgtgagacgcttttgttgtcgtgcttctg11760
cttctccgtatttgtgcaggctgtaagaggtacttgtataatatgcaatctgatggcagc11820
cgaaagcggagactcgcagttcactgcttggtgacaaagtttccagcagggcgatcggcg11880
cggacgggagtaactttgcgtccagggcgggtgccagcagcagcagcaggtaccgatggt11940
gacacactgtcgacgccgggctccacaatgtcgcgatagtggtactttggccctcgactc12000
ggactttgcttggggggggcaggcagcgatgactcttttgtttttgtgggctctcttgtc12060
tccttttttctttcttgcgttaagcttctttttgtgaatgctatttttttttcttctcct12120
ttattccgctttaatatattttccccttcagaaacagaaagaagctttccaatgtttcaa12180
aataaaacgtaaattgtggaacacagtctggcaggctcttgtcgaagtcgggcgtggtgc12240
gaatcgctcggatgaagcctcggtggtagggctggactcgttcgggcggatgtactaccc12300
agtactcgtgtggaggtacctgtaagacgggatcgcgccggagaggtacttgtgtgcaca12360
ggtgggagcggtcgcaaggccgtagcgtttattgagttgctgacgtgcttatgggccaag12420
attcgtacagtattagaagctggagcacgaataatacccaagcatggggtgcagcagttg12480
gtttcagttgcttgtcttgc12500
<210>3
<211>8188
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>3
ctccaaggtgttggggatcgtgtgccgcgtttcttgggcgttgctggtgttgaacaaaca60
tgctgttgctttgtggccacacgcacatacacacacacgccgctttggggagattccgtt120
cactgcttcgcgccccttctgctttagtaccttcaagagtccattaattgattcattcct180
ggcgagtcatttcacttcagagtgtttttgtaagcatcaacagtcggtgccttggaggtg240
gactttttgtttggctttccacacatgggacatgctgtgtgctaatgtgagcttgggtgt300
tcatgtgaagggggaaaaggcggagagactcacagtccgtctggtaggcacacttctggc360
aataggaatggccttgagtgattttggttttgcactttgagcacgaactattcccactgt420
cagtcaaaagcgcaatgcacatatagagaatgcgattgcgtaggtaggatggtgcacata480
cctggagtactgtgcgtatggattctttgctgcttttgacagcagcttgctctggaggcc540
cgttagcgagcattatcgaggaatgacgggaagcagtcttcgtttacctttgacactccg600
gtgttgcccagagttgctgatttggagctgcctgcctttgcgctggctggcgagccgtag660
tacatttcgctcttcttcttgacctctggagtcgcaagcttggtgctcttggtgagcttc720
agacacttgctgcacaccatcgcggcgtctgaatggggggtttatctgattgagtcgggt780
tgagtatcgatggatttgataaggaatatgtcagatagcgttcgatactattgtccgtgg840
ttcagcttgatggccgcatgctcgactttctggtgtttgatgggtgaatcgcagtggcaa900
ggctgacatcaacggcaacgcgaaacccggcactccgtacggcttccgcggccatactgt960
tccgaattcccaacgaccagctgcaaagtatcctcaaccgtgctctggcattcggcaagg1020
taccatgctcgcacaatctcgctggtgggggactttgtcgcaaaagggacaacgctcagg1080
gggacccgccaaacaggcctctcagcagtggagcagcagcagcacatcagtgcagttcaa1140
ggcgaggtccagcctgtggcatccccccaagcgatccatggatgcgctagagcacttgca1200
gagagagcgctggagcccttggacgacgttgaccccggacggccccctttcaggccactt1260
ggcgcaagagagcttccaggtcatcaagggttcaagacgggctcgtatgcatcagatcaa1320
atcaaacagcatcccaggggagcgctggagaacttgagcttacaggtgtttggcattgat1380
ccgtgctcccagtctataattattaccctacgggggacctctcgggtatcagcgccttgg1440
tcgcagaactgcactgagctttcgtgcccccaagattcaaatcgtcgggtccaactgcgc1500
ctctgtttcactgccgacagtgctgacgtaccaaacgcctgagcctcgacagcgtcccgc1560
tacggagtgggagcgatttagcggcagctcgccgaaacgaggctgtgcagggacgggaac1620
cttcattggattggaacaccttctcgaacgcttttttttagcggaacagcatcagactct1680
acagcgagcggccctgccctatcgatatcgcgggaccagaccaggtgtcgaccccgatcg1740
ttctcgagctgctgtgcgagtccgtctcctgcatacctaacctaaggaacctctacctat1800
agacatccaatacattcgcatccacccgcgagcggctgcggtttcacattccagccctcc1860
cacggacgcagcgaaacagccgcgaaacatccaaaaacaccacaacacacacagcttctc1920
gggctggcccaccctcatcgaagcccgcatgcgttgcccctccgcctcagcgaccgccta1980
accactgctcgtcctccggcatggctggacgacatcccataggaggccatggcgggccct2040
cgaccaccgacgacctgctgctcgacctggacaatgagcagcccgtctacaacgccggcc2100
agcggtcggccctcaatgacgacgacctggcgcgggcctacgagcacgaccacgacaacg2160
acccccagagccgcccgtcggtgtcgtacgacgactttgtcggcgccgagccgtcatatc2220
ccccagcagggcgccccggcctggcgcaggcagcgcagccgtcggggcagtcgtcgggcc2280
cgtaccacgctcagcagttcagccagtcgtcggacctcgacaacttcccgcgctacgccg2340
acgacttcgacgacgacgacatgtactaccagcacggcggcgcggcgggcgcggggccgg2400
cgtcggctggcagggacaatgcgagggcccgcaacagcgtgctgtcgctgggaggcggcc2460
tctttggcaagctgaagcaccgcctgggcatgggccagggctactccgagatggacctcc2520
ccttgacggagccgggccacgatcgaggcggccccatagcgggctcgtcgcagccgccgg2580
accagcagcccgcgggcaagaaggcgggcaacttcaagtttggctttggccgcggcaagc2640
ccgatcccgcgtccctgggcccgagaatcatccacctcaacaacccgcccgccaacgcgg2700
ccaacaagtacgtcggcaaccacatctcgacggcaaagtacaacgtcgccacgttcctcc2760
ccaagttcctctttgagcagttctccaaggtcgccaacatcttcttcctcttcacggccg2820
cgttgcagcagatccccggactgtcgcccaccaacaagtacaccacaatcggacccctgg2880
ctgttgtgctcctggtttctgctggcaaggaattggtggaggattaccggagaagagtgg2940
cggacaatgccctcaacacatccaaggcgcgagtcctgcgcggctcgacgtttacggaaa3000
cgaaatggaacaccgtggccgtgggcgacgtggttagggtcgagtccgaggagccgttcc3060
ccgccgatctggtgcttctggcaagttccgagcccgagggtctctgttatatcgaaacgg3120
cgaacctggatggcgagaccaacttgaagatcaagcaggccctccccgagacgtcgacgc3180
tggtgtcccccagcgaagtcagccggctgggaggtcgcatcaagtcggagcagcccaaca3240
gcagtctgtacacgtacgaagcgacgctgatcatgcaagccggaggaggagaaaaggagc3300
tggcactgaaccctgagcagctgcttctccgaggtgccactctgagaaacactccctgga3360
tccacggcatcgtcgtcttcaccggccacgagaccaagctgatgcgaaacgcgaccgcga3420
cgccgatcaagcggaccaaggtcgagaggcagctcaactggctcgtgctcatgctggtcg3480
gcatgctgctggtgctcagcgtcatcagtaccattggagacttggtgatgcgaggcgcca3540
ccggcgattcgctttcgtatctctacctggacaagatcgacagcgctggcgttgcggcct3600
cgacgttcttcaaggacatggtcacgtactgggtgctcttctccgcgctggtccccatct3660
ccctctttgtcacggtggaattggtcaagtattggcacggcatcctcatcaacgacgacc3720
tcgacatgtactacgacaagacggatacgccggccacttgccgaacgtcgagtctggtcg3780
aggagcttggcatggtcgagtacgtgttctctgacaagactggcacgctcacttgcaaca3840
tgatggagttcaagcagtgctcgattggcggcatcatgtatgccgaagaggttcccgagg3900
accgccgagcgagcggcgccgacgacgaagagacggctatttacgacttcaaggcgctcc3960
aggccaacctgacccaaggccatccgaccgcgggcatgattgatcatttcctttcgctgc4020
tcgcaacctgccacacggtcatccccgagatggatgaaaagggtcagatcaagtaccaag4080
cggcctctcccgacgaaggtgccctggtggccggagcggttaccatgggatacaagttta4140
ctgcacgaaagccaaagtcggtcattatagaagccaacgggcgagagatggaatacgagc4200
tgctggccgtctgcgaattcaactcgacgcgcaagcgaatgtctgccatcttccgctgcc4260
cggacggaaagattcgagtctactgcaaaggtgccgacaccgtcattcttgagcggctca4320
acgatcagaacccccacgtcgaaatcaccctgcggcacctggaggagtacgcctcggagg4380
ggctgcggacgctctgcttggccatgcgcgaggtgcccgaacaggagtaccgcgaatggc4440
gccagatctttgacacggcggcgacgacggtgggcggcaaccgagccgatgagctggaca4500
aggctgccgaaatcattgaacacgacttttacctcctgggagctactgccattgaggacc4560
gcctgcaagacggcgttccggagacgatccacacgctgcagcaagccaacatcaaggtct4620
gggttctgacaggagaccgacaggaaacggccatcaacattggcatgagttgcaagctcc4680
tgagcgaggacatgatgctcttgattgtcaacgaagagtcgtcggccgcaactcgtgata4740
acatccaaaagaagctcgatgccatcaggacgcaaggcgacggtaccattgagatggagt4800
ccctggcgctcgtcattgacggcaagtccctgacatatgcgctcgagaaggacatggaga4860
agcttttcctcgatctcgccatcatgtgcaaggccgtcatctgctgccgtgtgtcccccc4920
tgcaaaaggccctggtcgtcaagctcgtcaagaagtaccagaagcagtcgattctcctcg4980
ccattggcgacggggccaacgacgtctccatgatccaggcggcgcacattggcgtcggca5040
tcagcggtgttgaaggtctgcaggccgctcggagcgccgacgtggccattgcccagttca5100
ggtacctccggaagctgctgcttgtccacggcgcgtggagttaccagcgcgtgagcaaga5160
cgattctgttttcgttctacaagaacattgccctgtatctgacgcagttctggtacacgt5220
tccaaaacgtcttctccggccaggtcatttacgagtcgtggacgttgtccttctacaacg5280
tcttctacaccgttcttccgccgctggccattggcattctggaccagttcatctctgcgc5340
gcctgctcgatcgctacccccagctgtacatgatgggccagcagaattccgccttcaagc5400
tcaaggtctttgcgcagtggatcgccaacgccatctaccactccctcctcctctacgtct5460
ttgccgagctcatctggtacggcgacgtgattgacggccaggggcagaccgacggccact5520
gggtgtggggaaccgccctgtacggctccgtcctgctcaccgtgctgggcaaggcggcct5580
tggtgaccaacaactggaccaagtaccatgtcatggccatcccgggcagcatggtcatct5640
ggtgggtgttcatcgccgtgtacggcactgtggcgcccaaggtcaagatttcccccgagt5700
actttggcgtcatccccaagctgtacagcagccccgtcttctggctgcagatattcgtcc5760
ttgccctgctgtgtctgtcgcgcgatattgcttggaagtacgccaagcgcatgtactggc5820
cgcagacgtaccaccacattcaggagattcaaaaatacaacattcaggactaccggccta5880
ggtatgtacacgtgcccagcacagcccctctcctcccctcttcttgccccaggaatccat5940
ctgcggtttgaatagaggcatgtctatatatgagagagagccacgcgctaacgtgccatg6000
acaggatggagcaattccagaaagccatccgcaaggttcggcaggtgcagcgtatgcgca6060
agcagcgtggctatgccttttcgcaggccgacgagagccagacgcgcgtgcttcaggcat6120
acgacacgaccaagcaccgaggccgatatggagaaatggccagctcacgacctatagacg6180
ggatataaaaaaagcaaagaaaaaattggggggaggaaagagcaacagttttgtgtttta6240
ggggtgggctgtaatgatttttatctgccatcacgtctcatgtcatcaagagagagagaa6300
aaaaacagaggagggtggtgttactccttgggggggtgaaaggacgaggaggagagggca6360
agcggcacacaagggaggtgcgtcccttttgtcctcgttatgccgattcggaagccagac6420
gagggctatgatggttgattttgtttgctgtttgcggtttttctgaaactagctattatg6480
ccatatatgatgtctttgtctggggtgtctcttgttgggtgttcttttcttgacatttat6540
tatcatggcttgttactgaaggggatgtgagatttctaggtagaaggataggaaggcggt6600
tgaatggaaatttacattgacatgagatgcttggttatttgaagtgaggagaggtaagag6660
tgatggtagtgttggtatatggatgatgttgcacggtgcgatgcattgagcttgaaatga6720
aacagccgtggagattcgatgttcactgagaagagttggcttgtatactggttgggtata6780
gatatctcgtatgtcttgtgcctcattcgcacgatgtctaccgtacgatgaagaggaagc6840
ttccgcctgccggacgagcttcccatgccggagagtaactctctctctctaatctataat6900
aggtactttgccttgggccttacggtggcaccgtttgaagcttatatcaagtcactgaca6960
aaagtgtgtaaaggatggataaatctccataaacagattgtttcgaacggaccttgggtg7020
aatatcccgtagcagatgggacaatacgacactagattattgacaaagagtttcggagac7080
acaatgtcacacaggacaacaacagactcctcccccacggataagatagattagagtggc7140
ggagatccggagatgcacccttctgcatgacttgacgagaagcgcaagagtctctaccag7200
gtatttctgtaaggggactcgtcgtacgagtttgaacagcaaatacctaagcaagagagg7260
agtatgaacttgcacagcattatatgtgcgactacctagatacgctgtgtcacatgttta7320
tatgccgcgatgctgttgtatcggcatctgttgcattgtatacctaattagttgtcttga7380
tgtccttaatactatcttctaaagtactaggtagttgatactatgaatagtctacctact7440
ttatatcgcacgcaaggggcgaagacaatgcgtggcgttgcatgaggcagtctcgcgcac7500
cacgacacgacacaaagagcactttataggtaggtatgtacctagttttttggctcctgt7560
tcatcccgaggcaggtgcactctagatagaagaggactaggcagtgctgcgtttccatgg7620
cttcagataggtacctatctacctacctaccaaccaaggtgttaccttattttgtgtatg7680
acagcttttaccttaggtaatgagcagcacttcaagacggactctttagaagaaatcaga7740
attcgagagccagctcaacaacggcaagagtgatactggtatttgtcatctgcctacatt7800
gctggatgtgttaaatcaggcaaacctgacacaatatcggtacacagtctcaatgcctga7860
tgcaaagccaactgatatcacatccgattctacctaaaagcagcatcatgtacgagacgg7920
tattcttgacctgcatcaagctttcgcccccccccccccccccccccccccccccccccc7980
ccccccatatgcgtacgtcccgtatcacaggcatcaaaatcccaccgatatcccatgcag8040
gtcccccttccatctctcacagcttccccccctctgtaacaccacatgatgtacagtaca8100
agccacgctgcaccgcagctctcctacataatgatactactactaacaccaccacataca8160
tacagacagaccccaatttccccttaca8188
<210>4
<211>5913
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>4
ctccaaggtgttggggatcgtgtgccgcgtttcttgggcgttgctggtgttgaacaaaca60
tgctgttgctttgtggccacacgcacatacacacacacgccgctttggggagattccgtt120
cactgcttcgcgccccttctgctttagtaccttcaagagtccattaattgattcattcct180
ggcgagtcatttcacttcagagtgtttttgtaagcatcaacagtcggtgccttggaggtg240
gactttttgtttggctttccacacatgggacatgctgtgtgctaatgtgagcttgggtgt300
tcatgtgaagggggaaaaggcggagagactcacagtccgtctggtaggcacacttctggc360
aataggaatggccttgagtgattttggttttgcactttgagcacgaactattcccactgt420
cagtcaaaagcgcaatgcacatatagagaatgcgattgcgtaggtaggatggtgcacata480
cctggagtactgtgcgtatggattctttgctgcttttgacagcagcttgctctggaggcc540
cgttagcgagcattatcgaggaatgacgggaagcagtcttcgtttacctttgacactccg600
gtgttgcccagagttgctgatttggagctgcctgcctttgcgctggctggcgagccgtag660
tacatttcgctcttcttcttgacctctggagtcgcaagcttggtgctcttggtgagcttc720
agacacttgctgcacaccatcgcggcgtctgaatggggggtttatctgattgagtcgggt780
tgagtatcgatggatttgataaggaatatgtcagatagcgttcgatactattgtccgtgg840
ttcagcttgatggccgcatgctcgactttctggtgtttgatgggtgaatcgcagtggcaa900
ggctgacatcaacggcaacgcgaaacccggcactccgtacggcttccgcggccatactgt960
tccgaattcccaacgaccagctgcaaagtatcctcaaccgtgctctggcattcggcaagg1020
taccatgctcgcacaatctcgctggtgggggactttgtcgcaaaagggacaacgctcagg1080
gggacccgccaaacaggcctctcagcagtggagcagcagcagcacatcagtgcagttcaa1140
ggcgaggtccagcctgtggcatccccccaagcgatccatggatgcgctagagcacttgca1200
gagagagcgctggagcccttggacgacgttgaccccggacggccccctttcaggccactt1260
ggcgcaagagagcttccaggtcatcaagggttcaagacgggctcgtatgcatcagatcaa1320
atcaaacagcatcccaggggagcgctggagaacttgagcttacaggtgtttggcattgat1380
ccgtgctcccagtctataattattaccctacgggggacctctcgggtatcagcgccttgg1440
tcgcagaactgcactgagctttcgtgcccccaagattcaaatcgtcgggtccaactgcgc1500
ctctgtttcactgccgacagtgctgacgtaccaaacgcctgagcctcgacagcgtcccgc1560
tacggagtgggagcgatttagcggcagctcgccgaaacgaggctgtgcagggacgggaac1620
cttcattggattggaacaccttctcgaacgcttttttttagcggaacagcatcagactct1680
acagcgagcggccctgccctatcgatatcgcgggaccagaccaggtgtcgaccccgatcg1740
ttctcgagctgctgtgcgagtccgtctcctgcatacctaacctaaggaacctctacctat1800
agacatccaatacattcgcatccacccgcgagcggctgcggtttcacattccagccctcc1860
cacggacgcagcgaaacagccgcgaaacatccaaaaacaccacaacacacacagcttctc1920
gggctggcccaccctcatcgaagcccgcatgcgttgcccctccgcctcagcgaccgccta1980
accactgctcgtcctccggcccccaaagtcgcaatatcgggtatcgccgccggcattgaa2040
tcgccttctccgctagcatcgactactgctgctctgctctcgttgccagcgctgctccct2100
agaattttgaccaggggacgagcccgacattaaagcaactccctcgcctcgagacgactc2160
ggatcgcacgaaattctcccaatcgccgacagttcctactcctcttcctcccgcacggct2220
gtcgcgcttccaacgtcattcgcacagcagaattgtgccatctctctcttttttttcccc2280
ccctctaaaccgccacaacggcaccctaagggttaaactatccaaccagccgcagcctca2340
gcctctctcagcctcatcagccatggcaccacacccgacgctcaaggccaccttcgcggc2400
caggagcgagacggcgacgcacccgctgacggcttacctgttcaagctcatggacctcaa2460
ggcgtccaacctgtgcctgagcgccgacgtgccgacagcgcgcgagctgctgtacctggc2520
cgacaagattggcccgtcgattgtcgtgctcaagacgcactacgacatggtctcgggctg2580
ggacttccacccggagacgggcacgggagcccagctggcgtcgctggcgcgcaagcacgg2640
cttcctcatcttcgaggaccgcaagtttggcgacattggccacaccgtcgagctgcagta2700
cacgggcgggtcggcgcgcatcatcgactgggcgcacattgtcaacgtcaacatggtgcc2760
cggcaaggcgtcggtggcctcgctggcccagggcgccaagcgctggctcgagcgctaccc2820
ctgcgaggtcaagacgtccgtcaccgtcggcacgcccaccatggactcgtttgacgacga2880
cgccgactccagggacgccgagcccgccggcgccgtcaacggcatgggctccattggcgt2940
cctggacaagcccatctactcgaaccggtccggcgacggccgcaagggcagcatcgtctc3000
catcaccaccgtcacccagcagtacgagtccgtctcctcgccccggttaacaaaggccat3060
cgccgagggcgacgagtcgctcttcccgggcatcgaggaggcgccgctgagccgcggcct3120
cctgatcctcgcccaaatgtccagccagggcaacttcatgaacaaggagtacacgcaggc3180
ctgcgtcgaggccgcccgggagcacaaggactttgtcatgggcttcatctcgcaggagac3240
gctcaacaccgagcccgacgatgcctttatccacatgacgcccggctgccagctgccccc3300
cgaagacgaggaccagcagaccaacggatcggtcggtggagacggccagggccagcagta3360
caacacgccgcacaagctgattggcatcgccggcagcgacattgccattgtgggccgggg3420
catcctcaaggcctcagaccccgtagaggaggcagagcggtaccgatcagcagcgtggaa3480
agcctacaccgagaggctgctgcgataggggagggaagggaagaaagaagtaaagaaagg3540
catttagcaagaagggggaaaagggagggaggacaaacggagctgagaaagagctcttgt3600
ccaaagcccggcatcatagaatgcagctgtatttaggcgacctctttttccatcttgtcg3660
atttttgttatgacgtaccagttgggatgatggatgattgtaccccagctgcgattgatg3720
tgtatctttgcatgcaacaacacgcgatggcggaggcgaactgcacattggaaggttcat3780
atatggtcctgacatatctggtggatctggaagcatggaattgtatttttgatttggcat3840
ttgcttttgcgcgtggagggaacatatcaccctcgggcatttttcatttggtaggatggt3900
ttggatgcagttgaaaaagcaaagaaaaaattggggggaggaaagagcaacagttttgtg3960
ttttaggggtgggctgtaatgatttttatctgccatcacgtctcatgtcatcaagagaga4020
gagaaaaaaacagaggagggtggtgttactccttgggggggtgaaaggacgaggaggaga4080
gggcaagcggcacacaagggaggtgcgtcccttttgtcctcgttatgccgattcggaagc4140
cagacgagggctatgatggttgattttgtttgctgtttgcggtttttctgaaactagcta4200
ttatgccatatatgatgtctttgtctggggtgtctcttgttgggtgttcttttcttgaca4260
tttattatcatggcttgttactgaaggggatgtgagatttctaggtagaaggataggaag4320
gcggttgaatggaaatttacattgacatgagatgcttggttatttgaagtgaggagaggt4380
aagagtgatggtagtgttggtatatggatgatgttgcacggtgcgatgcattgagcttga4440
aatgaaacagccgtggagattcgatgttcactgagaagagttggcttgtatactggttgg4500
gtatagatatctcgtatgtcttgtgcctcattcgcacgatgtctaccgtacgatgaagag4560
gaagcttccgcctgccggacgagcttcccatgccggagagtaactctctctctctaatct4620
ataataggtactttgccttgggccttacggtggcaccgtttgaagcttatatcaagtcac4680
tgacaaaagtgtgtaaaggatggataaatctccataaacagattgtttcgaacggacctt4740
gggtgaatatcccgtagcagatgggacaatacgacactagattattgacaaagagtttcg4800
gagacacaatgtcacacaggacaacaacagactcctcccccacggataagatagattaga4860
gtggcggagatccggagatgcacccttctgcatgacttgacgagaagcgcaagagtctct4920
accaggtatttctgtaaggggactcgtcgtacgagtttgaacagcaaatacctaagcaag4980
agaggagtatgaacttgcacagcattatatgtgcgactacctagatacgctgtgtcacat5040
gtttatatgccgcgatgctgttgtatcggcatctgttgcattgtatacctaattagttgt5100
cttgatgtccttaatactatcttctaaagtactaggtagttgatactatgaatagtctac5160
ctactttatatcgcacgcaaggggcgaagacaatgcgtggcgttgcatgaggcagtctcg5220
cgcaccacgacacgacacaaagagcactttataggtaggtatgtacctagttttttggct5280
cctgttcatcccgaggcaggtgcactctagatagaagaggactaggcagtgctgcgtttc5340
catggcttcagataggtacctatctacctacctaccaaccaaggtgttaccttattttgt5400
gtatgacagcttttaccttaggtaatgagcagcacttcaagacggactctttagaagaaa5460
tcagaattcgagagccagctcaacaacggcaagagtgatactggtatttgtcatctgcct5520
acattgctggatgtgttaaatcaggcaaacctgacacaatatcggtacacagtctcaatg5580
cctgatgcaaagccaactgatatcacatccgattctacctaaaagcagcatcatgtacga5640
gacggtattcttgacctgcatcaagctttcgccccccccccccccatatgcgtacgtccc5700
gtatcacaggcatcaaaatcccaccgatatcccatgcaggtcccccttccatctctcaca5760
gcttccccccctctgtaacaccacatgatgtacagtacaagccacgctgcaccgcagctc5820
tcctacataatgatactactactaacaccaccacatacatacagacagaccccaatttcc5880
ccttacatatccccctcccctcttcacaccaaa5913
<210>5
<211>10225
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>5
aaaggacgagatggaccgcgccaagaacgggccgccgctgaggtttgagatgccggcgct60
gtttgttgcggcgagcaaggacaatgctttgccgccggccatgtccaagggcatggacgc120
tttctacaaggaccttaccagggccgaggtggatgctacgcattgggctttgacgcaggc180
tggggatgaggtcaatcgggtgattggagagtggttgaacaaggcgctcaatggtgcgac240
caaggctgcgttgtagaaatcgaggagaatattcaaatgatcatgaattgggctaacata300
aggaaacccccgacttgcttggatctcagcatttgctagacatctggtagcagcttgctg360
taactcccttttgtacatgttgagctatgaccgtatacccctgaatatagttcccgtaga420
atctagttgtgccgtccatatcgtttcgaggttgacaggtatcaagtaaacatttcttcg480
tgactctgcctccaacatgtctccaaggtgttggggatcgtgtgccgcgtttcttgggcg540
ttgctggtgttgaacaaacatgctgttgctttgtggccacacgcacatacacacacacgc600
cgctttggggagattccgttcactgcttcgcgccccttctgctttagtaccttcaagagt660
ccattaattgattcattcctggcgagtcatttcacttcagagtgtttttgtaagcatcaa720
cagtcggtgccttggaggtggactttttgtttggctttccacacatgggacatgctgtgt780
gctaatgtgagcttgggtgttcatgtgaagggggaaaaggcggagagactcacagtccgt840
ctggtaggcacacttctggcaataggaatggccttgagtgattttggttttgcactttga900
gcacgaactattcccactgtcagtcaaaagcgcaatgcacatatagagaatgcgattgcg960
taggtaggatggtgcacatacctggagtactgtgcgtatggattctttgctgcttttgac1020
agcagcttgctctggaggcccgttagcgagcattatcgaggaatgacgggaagcagtctt1080
cgtttacctttgacactccggtgttgcccagagttgctgatttggagctgcctgcctttg1140
cgctggctggcgagccgtagtacatttcgctcttcttcttgacctctggagtcgcaagct1200
tggtgctcttggtgagcttcagacacttgctgcacaccatcgcggcgtctgaatgggggg1260
tttatctgattgagtcgggttgagtatcgatggatttgataaggaatatgtcagatagcg1320
ttcgatactattgtccgtggttcagcttgatggccgcatgctcgactttctggtgtttga1380
tgggtgaatcgcagtggcaaggctgacatcaacggcaacgcgaaacccggcactccgtac1440
ggcttccgcggccatactgttccgaattcccaacgaccagctgcaaagtatcctcaaccg1500
tgctctggcattcggcaaggtaccatgctcgcacaatctcgctggtgggggactttgtcg1560
caaaagggacaacgctcagggggacccgccaaacaggcctctcagcagtggagcagcagc1620
agcacatcagtgcagttcaaggcgaggtccagcctgtggcatccccccaagcgatccatg1680
gatgcgctagagcacttgcagagagagcgctggagcccttggacgacgttgaccccggac1740
ggccccctttcaggccacttggcgcaagagagcttccaggtcatcaagggttcaagacgg1800
gctcgtatgcatcagatcaaatcaaacagcatcccaggggagcgctggagaacttgagct1860
tacaggtgtttggcattgatccgtgctcccagtctataattattaccctacgggggacct1920
ctcgggtatcagcgccttggtcgcagaactgcactgagctttcgtgcccccaagattcaa1980
atcgtcgggtccaactgcgcctctgtttcactgccgacagtgctgacgtaccaaacgcct2040
gagcctcgacagcgtcccgctacggagtgggagcgatttagcggcagctcgccgaaacga2100
ggctgtgcagggacgggaaccttcattggattggaacaccttctcgaacgctttttttta2160
gcggaacagcatcagactctacagcgagcggccctgccctatcgatatcgcgggaccaga2220
ccaggtgtcgaccccgatcgttctcgagctgctgtgcgagtccgtctcctgcatacctaa2280
cctaaggaacctctacctatagacatccaatacattcgcatccacccgcgagcggctgcg2340
gtttcacattccagccctcccacggacgcagcgaaacagccgcgaaacatccaaaaacac2400
cacaacacacacagcttctcgggctggcccaccctcatcgaagcccgcatgcgttgcccc2460
tccgcctcagcgaccgcctaaccactgctcgtcctccggcccccaaagtcgcaatatcgg2520
gtatcgccgccggcattgaatcgccttctccgctagcatcgactactgctgctctgctct2580
cgttgccagcgctgctccctagaattttgaccaggggacgagcccgacattaaagcaact2640
ccctcgcctcgagacgactcggatcgcacgaaattctcccaatcgccgacagttcctact2700
cctcttcctcccgcacggctgtcgcgcttccaacgtcattcgcacagcagaattgtgcca2760
tctctctcttttttttccccccctctaaaccgccacaacggcaccctaagggttaaacta2820
tccaaccagccgcagcctcagcctctctcagcctcatcagccatggcaccacacccgacg2880
ctcaaggccaccttcgcggccaggagcgagacggcgacgcacccgctgacggcttacctg2940
ttcaagctcatggacctcaaggcgtccaacctgtgcctgagcgccgacgtgccgacagcg3000
cgcgagctgctgtacctggccgacaagattggcccgtcgattgtcgtgctcaagacgcac3060
tacgacatggtctcgggctgggacttccacccggagacgggcacgggagcccagctggcg3120
tcgctggcgcgcaagcacggcttcctcatcttcgaggaccgcaagtttggcgacattggc3180
cacaccgtcgagctgcagtacacgggcgggtcggcgcgcatcatcgactgggcgcacatt3240
gtcaacgtcaacatggtgcccggcaaggcgtcggtggcctcgctggcccagggcgccaag3300
cgctggctcgagcgctacccctgcgaggtcaagacgtccgtcaccgtcggcacgcccacc3360
atggactcgtttgacgacgacgccgactccagggacgccgagcccgccggcgccgtcaac3420
ggcatgggctccattggcgtcctggacaagcccatctactcgaaccggtccggcgacggc3480
cgcaagggcagcatcgtctccatcaccaccgtcacccagcagtacgagtccgtctcctcg3540
ccccggttaacaaaggccatcgccgagggcgacgagtcgctcttcccgggcatcgaggag3600
gcgccgctgagccgcggcctcctgatcctcgcccaaatgtccagccagggcaacttcatg3660
aacaaggagtacacgcaggcctgcgtcgaggccgcccgggagcacaaggactttgtcatg3720
ggcttcatctcgcaggagacgctcaacaccgagcccgacgatgcctttatccacatgacg3780
cccggctgccagctgccccccgaagacgaggaccagcagaccaacggatcggtcggtgga3840
gacggccagggccagcagtacaacacgccgcacaagctgattggcatcgccggcagcgac3900
attgccattgtgggccggggcatcctcaaggcctcagaccccgtagaggaggcagagcgg3960
taccgatcagcagcgtggaaagcctacaccgagaggctgctgcgataggggagggaaggg4020
aagaaagaagtaaagaaaggcatttagcaagaagggggaaaagggagggaggacaaacgg4080
agctgagaaagagctcttgtccaaagcccggcatcatagaatgcagctgtatttaggcga4140
cctctttttccatcttgtcgatttttgttatgacgtaccagttgggatgatggatgattg4200
taccccagctgcgattgatgtgtatctttgcatgcaacaacacgcgatggcggaggcgaa4260
ctgcacattggaaggttcatatatggtcctgacatatctggtggatctggaagcatggaa4320
ttgtatttttgatttggcatttgcttttgcgcgtggagggaacatatcaccctcgggcat4380
ttttcatttggtaggatggtttggatgcagttgaaaaagcaaagaaaaaattggggggag4440
gaaagagcaacagttttgtgttttaggggtgggctgtaatgatttttatctgccatcacg4500
tctcatgtcatcaagagagagagaaaaaaacagaggagggtggtgttactccttgggggg4560
gtgaaaggacgaggaggagagggcaagcggcacacaagggaggtgcgtcccttttgtcct4620
cgttatgccgattcggaagccagacgagggctatgatggttgattttgtttgctgtttgc4680
ggtttttctgaaactagctattatgccatatatgatgtctttgtctggggtgtctcttgt4740
tgggtgttcttttcttgacatttattatcatggcttgttactgaaggggatgtgagattt4800
ctaggtagaaggataggaaggcggttgaatggaaatttacattgacatgagatgcttggt4860
tatttgaagtgaggagaggtaagagtgatggtagtgttggtatatggatgatgttgcacg4920
gtgcgatgcattgagcttgaaatgaaacagccgtggagattcgatgttcactgagaagag4980
ttggcttgtatactggttgggtatagatatctcgtatgtcttgtgcctcattcgcacgat5040
gtctaccgtacgatgaagaggaagcttccgcctgccggacgagcttcccatgccggagag5100
taactctctctctctaatctataataggtactttgccttgggccttacggtggcaccgtt5160
tgaagcttatatcaagtcactgacaaaagtgtgtaaaggatggataaatctccataaaca5220
gattgtttcgaacggaccttgggtgaatatcccgtagcagatgggacaatacgacactag5280
attattgacaaagagtttcggagacacaatgtcacacaggacaacaacagactcctcccc5340
cacggataagatagattagagtggcggagatccggagatgcacccttctgcatgacttga5400
cgagaagcgcaagagtctctaccaggtatttctgtaaggggactcgtcgtacgagtttga5460
acagcaaatacctaagcaagagaggagtatgaacttgcacagcattatatgtgcgactac5520
ctagatacgctgtgtcacatgtttatatgccgcgatgctgttgtatcggcatctgttgca5580
ttgtatacctaattagttgtcttgatgtccttaatactatcttctaaagtactaggtagt5640
tgatactatgaatagtctacctactttatatcgcacgcaaggggcgaagacaatgcgtgg5700
cgttgcatgaggcagtctcgcgcaccacgacacgacacaaagagcactttataggtaggt5760
atgtacctagttttttggctcctgttcatcccgaggcaggtgcactctagatagaagagg5820
actaggcagtgctgcgtttccatggcttcagataggtacctatctacctacctaccaacc5880
aaggtgttaccttattttgtgtatgacagcttttaccttaggtaatgagcagcacttcaa5940
gacggactctttagaagaaatcagaattcgagagccagctcaacaacggcaagagtgata6000
ctggtatttgtcatctgcctacattgctggatgtgttaaatcaggcaaacctgacacaat6060
atcggtacacagtctcaatgcctgatgcaaagccaactgatatcacatccgattctacct6120
aaaagcagcatcatgtacgagacggtattcttgacctgcatcaagctttcgccccccccc6180
cccccccccccccccccccccccccccccccatatgcgtacgtcccgtatcacaggcatc6240
aaaatcccaccgatatcccatgcaggtcccccttccatctctcacagcttccccccctct6300
gtaacaccacatgatgtacagtacaagccacgctgcaccgcagctctcctacataatgat6360
actactactaacaccaccacatacatacagacagaccccaatttccccttacatatcccc6420
ctcccctcttcacaccaaaaacggaaagaaaaaaaaataagaggagagagagataaggtc6480
cgtatcattggtatgagagataacagctctgtagcaaaagattgacatcttgcatgctta6540
tcagctggttctcttgattctgaatcctcaggccagaagacgcgccgacatcgctgatgt6600
actcgagacgattgcaacccaaaccaatcacatccatcacacttgtgcagaatgctgcct6660
ttcagcgaaaatttaaccatgttcaataacattatcctttattcattgatttctcaattg6720
cttccttgccatctatgggttctgttcgcgtccccagagatgcatcgccgtcttttgata6780
aagtatatacataagttgactcccatgtacagttgcccaccaaacatcaaattaccatcc6840
aagtacccatatgccgtgctttatatctaacccagtggacgtgtaataatcttgtgccaa6900
gaggccataacagtctttgtgaagtactaagagaaacaggaggaaaagggaagtgaagaa6960
aaggaaaagaaaaagaatccacaagtcgagttcgacaagatgtcgaagcgaggcgacgta7020
acgctccggggtcaggattggtggattgcagtcacactatgcggtgcatggtgacaagca7080
agagcggctgataagagaagctcgagttgggatgttgaaaaagcgccgtgaggggcccag7140
attgaagccgtccaaagtgggaaaggatccgaaatcccctcgctgccggaccactaatga7200
cagtgatcgaacagtgaaaacagttgaaaacatcaaaacttttgttgtgcgtaagtgtgt7260
atctccctgaagaacgccaaagggaaaaaaaaagaaaggaagaatagaagaataacagtt7320
gtgcggagtgtggtgcgaatgggctcggcaacagcaaaggagccggacgagaccaggacc7380
tcaagtcggttggaggtggcacaacagcgtgctgccagtcgacggcgagacccttgccgc7440
tgggcatccgcacccctgtaaccccgcagtccgaatcaatgcgccgtttggccagaattc7500
tggcaaaatgcggaggcgcggtgtgcgtcggaggtcccatcacgacatctgcacgcgcca7560
gtccttgttcgtctgcgtcttattgcctggccacccccacagcggtggccgacgctccca7620
ggccagtctggtgataggccgctgcgagcccagctgctgctagccggcgtgccgtgcgca7680
aggggggggaaaggggccgctagagacgctcgaggcggatgggactgcagccaaccgctt7740
cgtcccatctcagggcctcaaacaattaacccccccgccagcacacccacctggctgcgt7800
ccgaaatcaccgagtcagcatggggatgacaagctcgacgctctttggccgcgagctgcc7860
gcctggggtcctcgagggcagcggccggtccatggccccagaccctgcctcgtgcgagta7920
ggtgcccccgtaggccaggtcgagggtgctcgggtggctgtacagaaggctggccgatgg7980
tcgcgtgtacgagttgttggggctggtagctgagctgcggctgaagggccagatgccact8040
ccccgacggcgacggggggctgggtggcctcacgttgagggatcgcagggcagacatggc8100
cgaggtgtggtagttgagcgcggtgtctggtgaagccggcggagagttggtgaagtgcat8160
cgagctgggccgtgagggcgaggcccgtggcacaatgtctcgcggctcggacccggccaa8220
ggactcggtcaggatgcggcgctggttgacgtagacagaggagtaatagctgcgaaccga8280
cttggcctgcgcggacgagtcttggtctacccggcggcatctacacacatgtgtgttagt8340
ggacgtgatcaacccagctcctccaaggttcgtcgtcaagaagagaaacatacgcatcgg8400
agcagtacagaaccagctcgtcgtgggtgtggaattccttttcgcaaatcatgctgcagg8460
aacacaaaaggtcagttacatggcctcagcagcgtcacaaacaacaggagtggcttccat8520
accagtactgagggaagctctctcgctcgtcgttgtcccaaatctccgtgtcggtctcgc8580
gaccacctcgccccaacttctgggcggcggacggagtgtgtcgtcgagtcatggttggtc8640
gcttgtactgagcgggtgttgcggtcactgcctttcgcacgtctgttgtcgatgcggtgg8700
cagtgtaagggccggacttgcgtcgctggtgaggcatttggaatgcagatagaagaggag8760
caagggaaaaagtgcgtgggcgaactcgaggtgttatcctggcagctcggagagcgtggg8820
ggaaaactaccaggaccgtccaaggcgtgagacgaccaaaatcagggaagccagacagaa8880
cgctgtgctggctttatctccggcaggcagcgcagccaaatcaggcgggtgtatgcgaca8940
cgtcgtattggagagtgcgcgagattaataagagagtgacgctttgctcgacaggcgtga9000
cttgggctgaagaatgacgggaggtcacaccggcgtagagagggtgaagattgatcgaca9060
ggacccggaagatggaaggatgctgcagatcgattcgtcgggcagatttgctgttatcca9120
ctcttggtgttcagttgacaggagcagagcgtcgactgctgagtagcttaaaagggccaa9180
atatagcagtggtatcgacggtcagatgataagcaccgcagagggtgagatgaggtggat9240
gggagggcgtttggtgtaagtggtggcacgggatgaaggtctagtgctgggttgaccgga9300
ggctgagctggactgtgatgtgtcgtcgataatggggtggtggtgtaaggcgtattcgca9360
gattgatggaggaagggaaaagaacggatgaggaagtagatttgaacgagagtgagagga9420
ggaagaggaggaggaagaggtcggaaaagactggcgtgtgagacgcttttgttgtcgtgc9480
ttctgcttctccgtatttgtgcaggctgtaagaggtacttgtataatatgcaatctgatg9540
gcagccgaaagcggagactcgcagttcactgcttggtgacaaagtttccagcagggcgat9600
cggcgcggacgggagtaactttgcgtccagggcgggtgccagcagcagcagcaggtaccg9660
atggtgacacactgtcgacgccgggctccacaatgtcgcgatagtggtactttggccctc9720
gactcggactttgcttggggggggcaggcagcgatgactcttttgtttttgtgggctctc9780
ttgtctccttttttctttcttgcgttaagcttctttttgtgaatgctatttttttttctt9840
ctcctttattccgctttaatatattttccccttcagaaacagaaagaagctttccaatgt9900
ttcaaaataaaacgtaaattgtggaacacagtctggcaggctcttgtcgaagtcgggcgt9960
ggtgcgaatcgctcggatgaagcctcggtggtagggctggactcgttcgggcggatgtac10020
tacccagtactcgtgtggaggtacctgtaagacgggatcgcgccggagaggtacttgtgt10080
gcacaggtgggagcggtcgcaaggccgtagcgtttattgagttgctgacgtgcttatggg10140
ccaagattcgtacagtattagaagctggagcacgaataatacccaagcatggggtgcagc10200
agttggtttcagttgcttgtcttgc10225
<210>6
<211>1354
<212>prt
<213>artificialsequence
<400>6
metalaglyarghisproileglyglyhisglyglyproserthrthr
151015
aspaspleuleuleuaspleuaspasngluglnprovaltyrasnala
202530
glyglnargseralaleuasnaspaspaspleualaargalatyrglu
354045
hisasphisaspasnaspproglnserargproservalsertyrasp
505560
aspphevalglyalagluprosertyrproproalaglyargprogly
65707580
leualaglnalaalaglnproserglyglnserserglyprotyrhis
859095
alaglnglnpheserglnserseraspleuaspasnpheproargtyr
100105110
alaaspasppheaspaspaspaspmettyrtyrglnhisglyglyala
115120125
alaglyalaglyproalaseralaglyargaspasnalaargalaarg
130135140
asnservalleuserleuglyglyglyleupheglylysleulyshis
145150155160
argleuglymetglyglnglytyrserglumetaspleuproleuthr
165170175
gluproglyhisaspargglyglyproilealaglyserserglnpro
180185190
proaspglnglnproalaglylyslysalaglyasnphelysphegly
195200205
pheglyargglylysproaspproalaserleuglyproargileile
210215220
hisleuasnasnproproalaasnalaalaasnlystyrvalglyasn
225230235240
hisileserthralalystyrasnvalalathrpheleuprolysphe
245250255
leuphegluglnpheserlysvalalaasnilephepheleuphethr
260265270
alaalaleuglnglnileproglyleuserprothrasnlystyrthr
275280285
thrileglyproleualavalvalleuleuvalseralaglylysglu
290295300
leuvalgluasptyrargargargvalalaaspasnalaleuasnthr
305310315320
serlysalaargvalleuargglyserthrphethrgluthrlystrp
325330335
asnthrvalalavalglyaspvalvalargvalglusergluglupro
340345350
pheproalaaspleuvalleuleualasersergluprogluglyleu
355360365
cystyrilegluthralaasnleuaspglygluthrasnleulysile
370375380
lysglnalaleuprogluthrserthrleuvalserprosergluval
385390395400
serargleuglyglyargilelyssergluglnproasnserserleu
405410415
tyrthrtyrglualathrleuilemetglnalaglyglyglyglulys
420425430
gluleualaleuasnprogluglnleuleuleuargglyalathrleu
435440445
argasnthrprotrpilehisglyilevalvalphethrglyhisglu
450455460
thrlysleumetargasnalathralathrproilelysargthrlys
465470475480
valgluargglnleuasntrpleuvalleumetleuvalglymetleu
485490495
leuvalleuservalileserthrileglyaspleuvalmetarggly
500505510
alathrglyaspserleusertyrleutyrleuasplysileaspser
515520525
alaglyvalalaalaserthrphephelysaspmetvalthrtyrtrp
530535540
valleupheseralaleuvalproileserleuphevalthrvalglu
545550555560
leuvallystyrtrphisglyileleuileasnaspaspleuaspmet
565570575
tyrtyrasplysthraspthrproalathrcysargthrserserleu
580585590
valglugluleuglymetvalglutyrvalpheserasplysthrgly
595600605
thrleuthrcysasnmetmetgluphelysglncysserileglygly
610615620
ilemettyralaglugluvalprogluaspargargalaserglyala
625630635640
aspaspglugluthralailetyraspphelysalaleuglnalaasn
645650655
leuthrglnglyhisprothralaglymetileasphispheleuser
660665670
leuleualathrcyshisthrvalileproglumetaspglulysgly
675680685
glnilelystyrglnalaalaserproaspgluglyalaleuvalala
690695700
glyalavalthrmetglytyrlysphethralaarglysprolysser
705710715720
valileileglualaasnglyargglumetglutyrgluleuleuala
725730735
valcysglupheasnserthrarglysargmetseralailephearg
740745750
cysproaspglylysileargvaltyrcyslysglyalaaspthrval
755760765
ileleugluargleuasnaspglnasnprohisvalgluilethrleu
770775780
arghisleugluglutyralasergluglyleuargthrleucysleu
785790795800
alametarggluvalprogluglnglutyrargglutrpargglnile
805810815
pheaspthralaalathrthrvalglyglyasnargalaaspgluleu
820825830
asplysalaalagluileilegluhisaspphetyrleuleuglyala
835840845
thralailegluaspargleuglnaspglyvalprogluthrilehis
850855860
thrleuglnglnalaasnilelysvaltrpvalleuthrglyasparg
865870875880
glngluthralaileasnileglymetsercyslysleuleuserglu
885890895
aspmetmetleuleuilevalasnglugluserseralaalathrarg
900905910
aspasnileglnlyslysleuaspalaileargthrglnglyaspgly
915920925
thrileglumetgluserleualaleuvalileaspglylysserleu
930935940
thrtyralaleuglulysaspmetglulysleupheleuaspleuala
945950955960
ilemetcyslysalavalilecyscysargvalserproleuglnlys
965970975
alaleuvalvallysleuvallyslystyrglnlysglnserileleu
980985990
leualaileglyaspglyalaasnaspvalsermetileglnalaala
99510001005
hisileglyvalglyileserglyvalgluglyleuglnalaala
101010151020
argseralaaspvalalailealaglnpheargtyrleuarglys
102510301035
leuleuleuvalhisglyalatrpsertyrglnargvalserlys
104010451050
thrileleupheserphetyrlysasnilealaleutyrleuthr
105510601065
glnphetrptyrthrpheglnasnvalpheserglyglnvalile
107010751080
tyrglusertrpthrleuserphetyrasnvalphetyrthrval
108510901095
leuproproleualaileglyileleuaspglnpheileserala
110011051110
argleuleuaspargtyrproglnleutyrmetmetglyglngln
111511201125
asnseralaphelysleulysvalphealaglntrpilealaasn
113011351140
alailetyrhisserleuleuleutyrvalphealagluleuile
114511501155
trptyrglyaspvalileaspglyglnglyglnthraspglyhis
116011651170
trpvaltrpglythralaleutyrglyservalleuleuthrval
117511801185
leuglylysalaalaleuvalthrasnasntrpthrlystyrhis
119011951200
valmetalaileproglysermetvaliletrptrpvalpheile
120512101215
alavaltyrglythrvalalaprolysvallysileserproglu
122012251230
tyrpheglyvalileprolysleutyrserserprovalphetrp
123512401245
leuglnilephevalleualaleuleucysleuserargaspile
125012551260
alatrplystyralalysargmettyrtrpproglnthrtyrhis
126512701275
hisileglngluileglnlystyrasnileglnasptyrargpro
128012851290
argmetgluglnpheglnlysalailearglysvalargglnval
129513001305
glnargmetarglysglnargglytyralapheserglnalaasp
131013151320
gluserglnthrargvalleuglnalatyraspthrthrlyshis
132513301335
argglyargtyrglyglumetalaserserargproileaspgly
134013451350
ile
1.如下a-c中任一种物质在调控里氏木霉(trichodermareesei)胞外蛋白分泌量中的应用；
a、trdrs2蛋白；
b、编码所述trdrs2蛋白的核酸分子；
c、含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组细胞；
所述trdrs2蛋白为如下a1)-a4)中任一种：
a1)序列表中序列6所示的蛋白质；
a2)在a1)所述蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；
a3)将a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与里氏木霉胞外蛋白分泌量相关的蛋白质；
a4)与a1)具有98％以上同一性且与里氏木霉胞外蛋白分泌量相关的蛋白质。
2.b1)或b2)所示的物质在提高里氏木霉(trichodermareesei)胞外蛋白分泌量中的应用：
b1)使里氏木霉(trichodermareesei)中trdrs2蛋白活性丧失的物质；
b2)敲除里氏木霉(trichodermareesei)中编码trdrs2蛋白的核酸分子的物质；
所述trdrs2蛋白为如下a1)-a4)中任一种：
a1)序列表中序列6所示的蛋白质；
a2)在a1)所述蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；
a3)将a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与里氏木霉胞外蛋白分泌量相关的蛋白质；
a4)与a1)具有98％以上同一性且与里氏木霉胞外蛋白分泌量相关的蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述编码trdrs2蛋白的核酸分子为如下c1)-c3)中任一种：
c1)序列表中序列1或序列2所示的dna分子；
c2)与c1)具有95％以上同一性且编码所述蛋白质的dna分子；
c3)在严格条件下与c1)或c2)任一种限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白的dna分子。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述敲除里氏木霉(trichodermareesei)中编码trdrs2蛋白的核酸分子的物质为敲除里氏木霉(trichodermareesei)中编码trdrs2蛋白的核酸分子的dna片段或含有所述dna片段的重组载体或含有所述dna片段的重组细胞。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述敲除里氏木霉(trichodermareesei)中编码trdrs2蛋白的核酸分子的dna片段含有trdrs2基因上游同源臂和trdrs2基因下游同源臂，所述trdrs2基因上游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列3的第1-2000位，所述trdrs2基因下游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列3的6189-8188位。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述敲除里氏木霉(trichodermareesei)中编码trdrs2蛋白的核酸分子的dna片段为序列表中序列4所示的dna片段。
7.一种重组里氏木霉菌的构建方法，为如下m1)或m2)：
m1)包括如下步骤：使里氏木霉(trichodermareesei)中trdrs2蛋白活性丧失，得到所述重组里氏木霉菌；
m2)包括如下步骤：敲除里氏木霉(trichodermareesei)中编码trdrs2蛋白的核酸分子，得到所述重组里氏木霉菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述m2)中，所述敲除里氏木霉(trichodermareesei)中编码trdrs2蛋白的核酸分子的方法为同源重组、随机插入突变或rnai；
或，所述同源重组中采用的上游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列3的第1-2000位，所述同源重组中采用的下游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列3的第6189-8188位；
或，所述同源重组通过将序列表中序列4所示的dna片段导入所述里氏木霉(trichodermareesei)实现。
9.如下n1)-n6)任一所述的生物材料：
n1)由权利要求7或8所述方法得到的重组里氏木霉菌；
n2)权利要求2中所述的使里氏木霉(trichodermareesei)中trdrs2蛋白活性丧失的物质；
n3)权利要求2中所述的敲除里氏木霉(trichodermareesei)中编码trdrs2蛋白的核酸分子的物质；
n4)权利要求5中所述的敲除里氏木霉(trichodermareesei)中编码trdrs2蛋白的核酸分子的dna片段；
n5)含有n4)所述dna片段的重组载体；
n6)含有n4)所述dna片段的重组细胞。
10.权利要求7或8所述的方法或权利要求9所述的生物材料在制备或合成或表达胞外蛋白中的应用。
技术总结