本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种重组蛋白inp-aidh及其制备方法和应用。
背景技术：
细胞表面是细胞内外之间的功能界面。在生物技术中，可以通过将异种蛋白转移到细胞表面的机制加以利用。细菌表面展示是目前三种主要的微生物细胞表面展示的一种。
细菌的表面展示是指将目的蛋白的基因与表达在细菌表面的靶蛋白的基因连接，再导入细菌体内进行诱导表达，诱导后的目的蛋白随着靶蛋白表达而存在于细菌表面。利用细菌表面展示外源蛋白，虽然往往会破坏细菌外膜蛋白而导致表面显示效率降低，但是对于外源蛋白而言能更好促使外源蛋白正确折叠和防止蛋白酶消化外源蛋白等，且供选择的宿主细胞和载体种类繁多，目前已在免疫学、生化药学、微生物学和分子生物学等领域广泛应用。大肠杆菌是最常用的表面展示细菌宿主，同时也是很好的原核表达系统，各种大肠杆菌展示系统已被描述。
aidh是一种来自ochrobactrumsp.的α/β水解酶，是一种新型的n-乙酰高丝氨酸内脂酶，具有水解酰基高丝氨酸内酯内酯环酯键的作用，在破坏群体感应效益、预防和治疗感染方面具有很大的前景。aidh与现有的ahl酶同源性很低，与之前发现的ahl酶不同，aidh是一种非金属依赖的酶，它不包含保守的hxhxdh金属结合基序，即zn2 对aidh的活性是非必需的。但由于密码子的偏好性以及表达系统的不同，外源蛋白在大肠杆菌表达系统中的表达情况往往不理想，同样aidh在大肠杆菌表达系统中表达效果也不理想，因此需要对aidh进行改造或重组，使其易于表达及进行包括固定化等后续应用。目前的方法如添加信号肽或添加磁蛋白magr标签等重组办法存在难以固定化应用或固定化方法复杂等情况。
技术实现要素：
本发明的目的在于以inp为载体蛋白与aidh连接构成细菌表面展示载体获得重组蛋白inp-aidh，克服aidh在大肠杆菌表达系统中表达不佳的情况。该重组蛋白inp-aidh以冰核蛋白(inp)作为细菌表面展示载体对aidh进行表面展示，既提高表达效率且保持aidh的活性需要，又使其易于固定化。
本发明的技术方案为：
一种重组蛋白inp-aidh的制备方法，包括以下步骤：
(a)设计引物扩增aidh片段，引入bamhi和xhoi酶切位点，得到扩增后的aidh片段；
(b)用bamhi和xhoi分别对载体和步骤(a)所得扩增后的aidh片段进行双酶切，再通过消化、纯化后，分别得到载体产物和aidh片段产物；将载体产物和aidh片段产物连接，构建得到重组质粒pet-28a-inp-aidh；
(c)含重组质粒pet-28a-inp-aidh的工程菌经iptg诱导表达后提取、洗涤获得含重组蛋白inp-aidh的细胞膜碎片蛋白液。
按上述方案，步骤(a)具体为：以质粒pet-28a-aidh为模版，aidhbamhif1和aidhxhoir1为引物pcr扩增，得到扩增后的aidh片段；其中，所述引物aidhbamhif1为5’-gttaaaggatccatgaccatcaactaccacgaac-3’，aidhxhoir1为5’-gtggtgctcgaggccacctccgccttcgagctgggtgcagtc-3’。
按上述方案，步骤(a)所述扩增条件为：第一阶段：95℃预变性5分钟；第二阶段：95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸3分钟，10个循环；第三阶段：95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸3分钟，10个循环；第四阶段：72℃延伸3分钟。
按上述方案，步骤(b)所述载体为质粒pet-28a-inp-magr，双酶切体系为：31μlddh2o加2μl酶加5μlbuffer与10μl底物37℃孵育4h，底物分别为载体或步骤(a)所得扩增后的aidh片段。
按上述方案，步骤(b)消化过程分别为：向双酶切后的载体体系加入8μlfastapbuffer与2μlfastap；向双酶切后的aidh片段体系加入1μldpnibuffer与1μldpni，37℃消化1h；纯化过程按pcr产物纯化消化试剂盒进行。
按上述方案，步骤(b)中所述连接过程为：将纯化后载体与aidh片段按摩尔比1：3进行混合后添加t4连接酶，于16℃下连接16h，获得重组质粒pet-28a-inp-aidh。
按上述方案，步骤(c)中所述具体过程为：将重组质粒pet-28a( )-inp-aidh转化入大肠杆菌bl21(de3)，挑选阳性菌落的接种于3mllb培养基过夜培养，过夜菌液按1：50接种于lb培养基扩大培养至od600约为后0.5加入iptg终浓度为0.2mmol/l，于37℃培养6h或20℃培养16h，后5000g，4℃离心10min，所得菌沉淀加入10ml/g裂解液(25mmtris，200mmnacl，ph＝8)高压破碎细胞，细胞破碎液5000g4℃下离心10min分离上清液；所述上清液120000g4℃下离心1h收集沉淀，该沉淀经pbs洗涤，即获得位于细胞膜碎片上的重组蛋白inp-aidh。
本发明的另一目的在于提供一种按照上述方法制备得到的重组蛋白inp-aidh的抗群感效应的应用，应用过程具体如下：将所述重组蛋白inp-aidh与c6-hsl或铜绿假单胞菌混合孵育可有效降解c6-hsl或抑制生物膜的形成。其中，15μl0.05mg/ml的inp-aidh重组蛋白液与2mmc6-hsl30℃共孵育1h可有效降解c6-hsl；10μl0.25mg/ml的inp-aidh重组蛋白液与铜绿假单胞菌共培养，可阻止约60％的生物膜形成。
本发明的第三个目的在于提供一种以inp为标签的固定化重组蛋白inp-aidh的应用，应用过程具体如下：采用细胞膜色谱的办法，0.075mpa-0.1mpa下将重组蛋白inp-aidh与经乙醇和去离子水洗涤过的硅胶颗粒振荡混匀2min，其比例为1mg重组蛋白/40-80μg硅胶颗粒，4℃静置吸附24-48h，后洗涤干燥，获得吸附有重组蛋白inp-aidh的硅胶颗粒。所获得的硅胶颗粒具有抗群感效应的活性。
本发明的基本原理：本发明所述inp-aidh重组蛋白由于inp的存在，将整个重组蛋白锚定于细胞膜中，在高压破碎细胞后得到含有inp-aidh重组蛋白的细胞膜碎片，通过细胞膜色谱法将细胞膜碎片固定到硅胶表面，即可将inp-aidh蛋白固定于硅胶表面，获得具有抑菌效果的材料。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下几个方面：
首先，本发明以inp为载体蛋白与aidh连接构成大肠杆菌表面展示载体，经诱导表达后的到inp-aidh重组蛋白，既增加了aidh在大肠杆菌快速生长过程中表达时折叠的正确性，又可以有效防止内源蛋白酶对aidh的降解。
第二，本发明所述蛋白inp-aidh基于其inp的细菌表面展示而存在与细胞膜上，因而利用细胞膜色谱的方法可以实现简单快速的固定化操作，且具有抗群感效应的活性，同时由于其具有inp标签的特性，便于固定化，可获得具有抗群感效应的材料。
第三，本发明所述重组蛋白inp-aidh的构建方法简便，分离提取办法简单。
附图说明
图1是本发明的重组质粒pet-28a-inp-aidh的示意图(a)及inp-aidh片段(b)与提取重组蛋白inp-aidh过程的电泳图(c)。
图2是实施例制得的重组蛋白inp-aidh的降解c6-hsl活性测定结果图。
图3是实施例制得的重组蛋白inp-aidh抑制铜绿假单胞菌生物膜形成功效测定结果图。
图4是实施例制得的重组蛋白inp-aidh固定化后sem与eds检测图及降解c6-hsl活性定性测定结果图。
具体实施方式
为使本领域普通技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，以下结合具体实施例进行进一步说明。
下述实施例中，质粒pet-28a-aidh和载体pet-28a-inp-magr中目的序列为委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，依次为序列表中的序列1和序列2。
本发明方法所制备的pet-28a-inp-aidh的目的序列为序列表中的序列3。
实施例
(1)重组质粒pet-28a-inp-aidh的构建
按常规分子生物学操作，以质粒pet-28a-aidh为模版，aidhbamhif1和aidhxhoir1为引物pcr扩增aidh片段，反应体系如下表：
表1质粒pcr体系
pcr反应条件为：第一阶段：95℃预变性5分钟；第二阶段：95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸3分钟，10个循环；第三阶段：95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸3分钟，10个循环；第四阶段：72℃延伸3分钟。
按表2体系将载体pet-28a-inp-magr与pcr扩增的aidh片段进行bamhi、xhoi双酶切，于37℃恒温培养箱中酶切4小时，按表3将酶切产物消化模版，于37℃恒温培养箱消化1小时，并纯化回收载体产物和aidh片段产物。
表2pcr扩增片段与载体双酶切体系
表3pcr扩增片段与载体消化体系
将纯化后载体与aidh片段按摩尔比1：3混合后添加t4连接酶，于16℃下连接16h，获得重组质粒pet-28a-inp-aidh。目的片段inp-aidh为1644bp。
(2)重组蛋白inp-aidh的提取
将重组质粒pet-28a( )-inp-aidh转化入大肠杆菌bl21(de3)，挑选阳性菌落的接种于3mllb培养基过夜培养，过夜菌液按1：50接种于lb培养基扩大培养至od600约为0.5后加入iptg终浓度为0.2mmol/l，于37℃培养6h或20℃培养16h，后5000g4℃离心10min，菌沉淀加入10ml/g裂解液(25mmtris，200mmnacl，ph＝8)高压破碎细胞，细胞破碎液5000g4℃下离心10min分离上清，上清120000g4℃下离心1h收集沉淀，沉淀经pbs洗涤三次即获得较纯的位于细胞膜碎片上的重组蛋白inp-aidh。
在本实施例中，图1中a对应(1)获得的重组质粒pet-28a( )-inp-aidh；b对应(1)获得的inp-aidh片段大小对比，具体目的序列见序列3；c中红色箭头所示11-13泳道对应(2)中所提取含重组蛋白inp-aidh的细胞膜碎片蛋白液。
(3)重组蛋白inp-aidh的降解c6-hsl活性测定
a.利用产生紫色色素而自身不分泌ahl，只有在遇到外源ahl才显示紫色的缺陷型紫罗兰色杆菌cv026(chromobacteriumviolaceumcv026；biovectorntcc503714)作为指示菌，以c6-hsl为外源ahl，对重组蛋白进行活性测定。将6μl的0.05、0.1、0.2mg/ml的去细胞蛋白液与6μlc6-hsl(2mm)混匀，用pbs补至30μl体系于30℃水浴1小时，将反应液混匀后20μl加入5ml液体lb培养基中，再以1:50接种cv026，于30℃摇床培养20小时，5000g离心10min后获得菌沉淀以1mldmso溶解，5000g离心10min获得上清测定a570。
b.将6μl的0.1mg/ml的去细胞液与6μlc6-hsl(2mm)混匀，用pbs补至30μl的反应体系于30℃分别水浴0、30、60、90分钟，95℃热激5分钟使反应停止。将反应液混匀后20μl加入5mllb培养基中，再以1:50接种cv026，于30℃摇床培养20-24小时5000g离心10min后获得菌沉淀以1mldmso溶解，5000g离心10min获得上清测定a570。
c.将0.05mg/ml的去细胞液10、12、15、18、20μl与6μlc6-hsl(2mm)混匀，以不加去细胞液为对照，用pbs补至30μl的反应体系于30℃水浴1小时，而后95℃热激5分钟以使反应停止。将反应液混匀后分别点样2μl于含有cv026菌种的24孔板中，于30℃培养20-24小时。
在本实施例中，图2中(a)对应(3)中的a，6μl0.1mg/ml的去细胞蛋白液在30℃下处理1h可以有效降解2mmc6-hsl；图2中(b)对应(3)中的b，6μl0.1mg/ml的去细胞蛋白液在30℃下处理约0.5h可以有效降解2mmc6-hsl；图2中(c)对应(3)中的c，15μl0.05mg/ml的去细胞蛋白液在30℃下处理约1h可以有效降解2mmc6-hsl；图2说明本实施例提取的重组蛋白inp-aidh具有良好的活性。
(4)重组蛋白inp-aidh抑制生物膜形成功效测定
将浓度为0.25mg/ml的去细胞液分别取0、5、10、25、50μl，以pbs补至50μl体系，分别加入24孔板中950μlod600＝0.05的含1％麦芽糖的pseudomonasaeruginosapa01菌液中，混匀后于37摄氏度静止培养24小时。培养后吸附于24孔板底部的生物膜以pbs清洗3次，甲醇固定15分钟，室温晾干后0.1％结晶紫染色10分钟，再用pbs洗涤3次，晾干后以1ml30％乙酸溶解生物膜，测定a590。
在本实施例中，图3中左图为经乙酸溶解后溶液颜色图；右图为对应的a590；10μl0.25mg/ml的重组蛋白与铜绿假单胞菌混合可有效抑制其在生长过程中的生物膜形成。图3说明本实施例中提取的重组蛋白inp-aidh具有良好的抑制铜绿假单胞菌生物膜功效。
(5)重组蛋白inp-aidh的固定化
采用细胞膜色谱的办法，低压下将重组蛋白inp-aidh与经乙醇和去离子水洗涤过的硅胶颗粒振荡混匀2min，其比例为1mg蛋白/40-80μg硅胶颗粒。4℃静置吸附24-48h，后洗涤干燥，获得吸附有重组蛋白inp-aidh的硅胶颗粒。取适量干燥硅胶颗粒与50μl2mmc6-hsl混合进行定性检测，同时利用sem以及eds对处理后的硅胶颗粒进行扫描，检测其上n元素的含量以对其吸附效果进行验证，获得具有抗群感效应活性的硅胶颗粒。
在本实施例中，图4为对照组与实验组进行的sem与eds，实验组硅胶颗粒中含n量明显高于对照组，且与c6-hsl孵育处理后实验组表现出明显的降解活性。图4说明本实施例中重组蛋白inp-aidh的固定化成功且保持着良好活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。
＜110＞武汉理工大学
＜120＞一种重组蛋白inp-aidh及其制备方法和应用
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1.一种重组蛋白inp-aidh的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（a）设计引物扩增aidh片段，引入bamhi和xhoi酶切位点，得到扩增后的aidh片段；
（b）用bamhi和xhoi分别对载体和步骤（a）所得扩增后的aidh片段进行双酶切，再通过消化、纯化后，分别得到载体产物和aidh片段产物；将载体产物和aidh片段产物连接，构建得到重组质粒pet-28a-inp-aidh；
（c）含重组质粒pet-28a-inp-aidh的工程菌经iptg诱导表达后提取、洗涤获得存在于细胞膜碎片上的重组蛋白inp-aidh。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（a）具体为：以质粒pet-28a-aidh为模版，aidhbamhif1和aidhxhoir1为引物pcr扩增，得到扩增后的aidh片段；其中，所述引物aidhbamhif1为5’-gttaaaggatccatgaccatcaactaccacgaac-3’，aidhxhoir1为5’-gtggtgctcgaggccacctccgccttcgagctgggtgcagtc-3’。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述扩增条件为：第一阶段：95℃预变性5分钟；第二阶段：95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸3分钟，10个循环；第三阶段：95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸3分钟，10个循环；第四阶段：72℃延伸3分钟。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（b）所述载体为质粒pet-28a-inp-magr，双酶切体系为：31μlddh2o加2μl酶加5μlbuffer与10μl底物37℃孵育4h，底物分别为载体或步骤（a）所得扩增后的aidh片段。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（b）消化过程分别为：向双酶切后的载体体系加入8μlfastapbuffer与2μlfastap；向双酶切后的aidh片段体系加入1μldpnibuffer与1μldpni，37℃消化1h。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（b）中所述连接过程为：将纯化后载体与aidh片段按摩尔比1：3进行混合后添加t4连接酶，于16℃下连接16h，获得重组质粒pet-28a-inp-aidh。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（c）中所述具体过程为：将重组质粒pet-28a( )-inp-aidh转化入大肠杆菌工程菌，挑选阳性菌落的接种于3mllb培养基过夜培养，过夜菌液按1：50接种于lb培养基扩大培养至od600约为0.5后加入iptg终浓度为0.2mmol/l，于37℃培养6h或20℃培养16h，后5000g，4℃离心10min，所得菌沉淀加入10ml/g裂解液高压破碎细胞，细胞破碎液5000g4℃下离心10min分离上清液；所述上清液120000g4℃下离心1h收集沉淀，该沉淀经pbs洗涤，即获得位于细胞膜碎片上的重组蛋白inp-aidh。
8.权利要求1-7任一项方法制得的重组蛋白inp-aidh抗群感效应的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，应用过程具体如下：将权利要求1-7任一项方法制得的重组蛋白inp-aidh与c6-hsl混合孵育以降解c6-hsl；权利要求1-7任一项方法制得的重组蛋白inp-aidh与铜绿假单胞菌混合孵育，抑制生物膜的形成；将权利要求1-7任一项方法制得的重组蛋白inp-aidh与多孔硅胶颗粒按细胞膜色谱的制备方法进行固定化，获得具有抗群感效应的硅胶颗粒。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，降解c6-hsl时，孵育条件为：15μl0.05mg/ml的重组蛋白inp-aidh液与2mmc6-hsl30℃共孵育1h；抑制生物膜的形成时，孵育条件为：10μl0.25mg/ml的重组蛋白inp-aidh液与铜绿假单胞菌共培养；具有抗群感效应的硅胶颗粒时，将重组蛋白inp-aidh与硅胶颗粒0.075mpa-0.1mpa振荡2min混匀，其比例为1mg重组蛋白/40-80μg硅胶颗粒，4℃静置吸附24-48h，后洗涤干燥，获得吸附有重组蛋白inp-aidh的具有抗群感效应的硅胶颗粒。
技术总结