技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一株高产耐碱脂肪酶的毕赤酵母工程菌及其所产的脂肪酶。
背景技术：
：：脂肪酶是能够将长链脂肪酸甘油酯水解为甘油和长链脂肪酸(或逆反应)的生物酶。脂肪酶可在水油界面或者非水溶剂系统中发生酯交换、水解、酯化等化学反应，具有底物专一性和位点选择性等特点。脂肪酶能够应用到油脂加工、食品加工、皮革加工以及饲料和生物能源等行业，具有比较广泛的应用价值。碱性脂肪酶是在碱性条件下水解脂肪中的酯键的酶，碱性脂肪酶是一种新型洗涤剂用酶，主要用途是作为洗涤剂的新酶种。它的特性能分解衣物油污成甘油二脂、甘油单脂及脂肪酸等较易溶于水的物质，从而显著提高洗衣粉的洗涤效果，尤其是去除黄斑的效果。我们常用各种含酶洗衣粉，其中的酶制剂主要有碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。碱性蛋白酶用于分解蛋白质类污物，如汗渍、血渍等。碱性脂肪酶则主要作用于脂肪酸及其酯类污物，也就是我们通常所指的油污类。脂肪酶主要来源于植物、动物、微生物，其微生物脂肪酶广泛存在于细菌、酵母和霉菌中，具有种类多、周期短、繁殖快、易发生遗传变异的特点，且有比动植物脂肪酶更广的作用温度、作用ph和底物特异性，其可以在不需要辅酶的条件下催化酯类化合物的水解、醇解、酸解、酯交换及合成等，催化条件温和、能耗低、副产物少，具有高效、高选择性、环境友好等特点，改变了传统的酯化或转酯化反应所需要的高温、强酸、强碱等相对苛刻的条件。尽管自然界中有多种脂肪酶可供选择，但这些天然酶往往不能满足生物催化的需求，包括底物选择的范围、ph、温度特性和稳定性(长时间反应的稳定性、有机溶剂耐受性)等。随着基因工程技术的不断发展，利用基因工程手段结合所需脂肪酶基因构建毕赤酵母工程菌，使其更好的表达，对满足工业生产的需求，降低生产成本具有重大意义。技术实现要素：：本发明的目的在于提供一种耐碱性提高的脂肪酶突变体及其毕赤酵母工程菌菌株。所述脂肪酶突变体具体为脂肪酶突变体b-2，来自一株经紫外诱变获得的根霉菌zf056，将脂肪酶突变体编码基因从zf056中克隆并构建重组质粒后，在毕赤酵母gs200中进行表达，从而获得毕赤酵母工程菌菌株。所述脂肪酶突变体b-2的酶学性质如下：(1)ph:ph10.0-11.5酶活稳定，最适作用ph10.5。(2)温度：45℃-60℃酶活稳定，最适作用温度为50℃。(3)耐碱性：该酶在ph11.5的条件下，9h后酶活力仍存留80％以上。在本发明中采用如下定义：1.氨基酸和dna核酸序列的命名法使用氨基酸残基的公认iupac命名法，用三字母代码形式。dna核酸序列采用公认iupac命名法。2.脂肪酶突变体的标识在本发明中，b-1表示野生型脂肪酶，b-2表示脂肪酶突变体，信息如下表。所述野生型脂肪酶b-1的氨基酸序列如序列表seqidno.2所示；所述野生型脂肪酶b-1编码基因的核苷酸序列为seqidno.1所示；所述脂肪酶突变体b-2的氨基酸序列如序列表seqidno.4所示；所述脂肪酶突变b-2编码基因的核苷酸序列为seqidno.3所示。本发明还提供包含所述突变体基因的表达载体或重组菌株；优选地，用于表达所述突变体的表达载体为ppic9，物宿主细胞为毕赤酵母gs200。优选地，所述重组菌株是将脂肪酶突变编码基因b-2连接表达载体ppic9，并在毕赤酵母gs200中表达所得。所述重组菌株的构建方法如下：1、将脂肪酶突变体的编码基因b-2进行酶切，连接至表达载体ppic9，得到重组载体；2、将重组载体转化入毕赤酵母gs200中，得到新型脂肪酶的生产菌株gs200/ppic9-b-2。本发明还提供所述重组菌株在发酵生产脂肪酶种的应用，特别是gs200/ppic9-b-2重组菌作为生产菌株发酵生产脂肪酶中的应用。具体地，采用所述重组菌发酵生产脂肪酶(50l发酵罐)的方法为：种子罐培养：培养温度30-31℃，转速200-800rpm，风量2m3/h-6m3/h，通风搅拌培养，ph5.0-5.5，溶氧20-30％，湿重增长至60-80g/l移种；发酵罐培养：接种量10-15％，培养温度30-31℃，转速200-800rpm，风量2m3/h-6m3/h，通风搅拌培养，ph5.0-5.5，周期0-20h，流加碳源40-50％葡萄糖，流加速度为600-800g/h，溶氧20-30％，培养20h至菌体湿重160-180g/l；停补碳源，溶氧反弹至80％以上，保持1小时；流加甲醇，流加速度为50-200g/h，控制溶氧20-30％，培养130h左右至发酵结束。种子罐培养基配方：4-5％甘油，1-2％磷酸二氢铵，0.5-1％磷酸二氢钾，0.5-1％硫酸镁，0.5-0.8％硫酸钾，0.05-0.1％硫酸钙，0.2-0.5％氢氧化钾，其余为水，ph5.0-5.5；发酵罐培养基配方：4-5％甘油，1-2％磷酸二氢铵，0.5-1％磷酸二氢钾，0.5-1％硫酸镁，0.5-0.8％硫酸钾，0.05-0.1％硫酸钙，0.2-0.5％氢氧化钾，其余为水，ph5.0-5.5。有益效果：1、本发明公布了一种全新的脂肪酶突变体，该突变体具有酶活高，耐碱性高的特点。该突变体发酵液酶活可达85000u/ml以上；2、本发明获得的脂肪酶在ph11.5的条件下，9h后酶活力仍存留80％以上，与野生型脂肪酶b-1相比，耐碱性显著提高。附图说明：图1菌落pcr鉴定电泳图；图2碱性脂肪酶最适ph曲线；图3碱性脂肪酶最适温度曲线；图4碱性脂肪酶耐碱性曲线。具体实施方式：通过具体实施例对本发明作出更详尽的说明，仅作为举例说明，而不作为对本发明实施范围的限定。对于本领域技术人员，在本发明原理基础上还可做出的改进，这些改进也应视为本发明保护的范围。本实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可参照《分子克隆实验指南》。以下通过具体实施方式对本发明作进一步地解释说明。实施例1脂肪酶突变体b-2编码基因的获得本公司保藏的一株产碱性脂肪酶的根霉菌ld037，经紫外诱变筛选得到一株具有耐碱脂肪酶活性的菌株zf056，根据来自根霉菌ld037的野生型脂肪酶b-1编码基因的核苷酸序列设计pcr引物，5'端加入酶切位点xhoi，3'端加入酶切位点noti，通过pcr得到突变基因b-2，经过测序得到其核苷酸序列为seqidno.3。在本发明中，通过野生型和突变体的核苷酸序列的比较，得到突变位点信息如下表。实施例2重组载体ppic9-b-2的构建分别对b-2编码基因和质粒ppic9进行xhoi和noti酶切，回收产物，将回收后的b-2编码基因和ppic9按比例混合，用t4连接酶在16℃条件下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，转化产物涂布在lb(含氨苄霉素)固体平板上，37℃倒置培养过夜，挑取单菌落至lb液体培养基，37℃培养，菌液进行菌落pcr，电泳鉴定结果如图1，测序结果显示序列正确，序列大小1.6kb。抽提重组质粒ppic9-b-2待用。实施例3重组质粒转化毕赤酵母1.毕赤酵母gs200感受态细胞的制备1)挑取毕赤酵母平板单菌落，接种于5ml的ypd培养基，30℃，220r/min振荡过夜；2)取0.5ml的过夜培养的菌液，接种于50ml新鲜配制的ypd培养基，30℃，220r/min振荡培养，使od600值达到1.3-1.5；3)取上述培养液于4℃，3000r/min，离心5min；4)弃去上清液，加入50ml冰上预冷的无菌水，振荡重悬菌体；5)4℃，3000r/min，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入25ml冰上预冷的无菌水，振荡重悬菌体；6)4℃，3000r/min，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入10ml冰上预冷的1mol/l的无菌山梨醇溶液，重悬菌体；7)4℃，3000r/min，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入1ml冰上预冷的1mol/l的无菌山梨醇溶液(预先加入甘油至终浓度15％)，振荡混匀。8)分装100μl/管至无菌ep罐，-70℃冰箱冰冻保藏(新鲜制备的感受态细胞效果更佳)。2.线性化质粒的转化抽提得到的重组质粒ppic9-b-2用sali进行单酶切，得到线性化质粒。取新鲜制备的(或-70℃冻存的)感受态细胞置于冰浴中，使其完全解冻。1)将100μl感受态细胞移出至一新的无菌ep管中，加入10μl线性化质粒，轻吹混匀，吸出转移到0.2cm型的电穿孔转化杯中；2)转化杯置于冰浴中5-10分钟，保持低温。3)电穿孔转化电击条件：1500v，200ω，25μf，放电时间5ms左右，一次电击。4)电击后，马上在电击转化杯中加入1ml4℃预冷的1mol/l的山梨醇溶液，用移液枪吹打均匀，置于冰浴中；5)在超净工作台上无菌操作涂布md培养基(1.34％ynb；4×10-5％生物素；2％葡萄糖平板)，100-200μl/板，涂好的平板30℃倒置培养3-4天；6)在md平板上筛选得到两株重组菌，经菌落pcr得到目的序列，测序比对显示为目的基因b-2的核苷酸序列，即所得菌株为含有ppic9-b-2的重组菌，分别命名为c-1，c-2。实施例4含有重组质粒ppic9-b-2的酵母菌的诱导表达bmgy培养基配方：1％酵母浸出物，2％蛋白胨，0.1mol/lph6.0磷酸盐缓冲液，1.34％ynb，4×10-5％生物素，1％甘油。bmmy培养基配方：1％酵母浸出物，2％蛋白胨，0.1mol/lph6.0磷酸盐缓冲液，1.34％ynb，4×10-5％生物素，0.5％甲醇。将重组菌c-1，c-2，以及用同样方法以野生型脂肪酶b-1编码基因构建的重组菌株yb-1分别接种于装有30mlbmgy培养基的三角瓶中，30℃，220r/min培养至od600为10左右，离心收集菌体，用35ml的bmmy诱导培养基重悬菌体，并在30℃，220r/min条件下继续培养48h，发酵液离心后测定上清中的脂肪酶酶活，结果如下表。菌株脂肪酶酶活/u·ml-1yb-15412c-112215c-212209实施例5重组菌c-2发酵性能验证种子罐培养：培养温度30℃，转速300rpm，风量2.5m3/h，通风搅拌培养，ph5.1，溶氧25％，湿重增长至75g/l移种；发酵罐培养：接种量12％，培养温度30℃，转速300rpm，风量2.5m3/h，通风搅拌培养，ph5.1，周期0-20h，流加碳源45％葡萄糖，流加速度为700g/h，溶氧25％，培养20h至菌体湿重170g/l；停补碳源，溶氧反弹至80％以上，保持1小时；流加甲醇，流加速度为150g/h，控制溶氧25％，培养130h左右至发酵结束。种子罐培养基配方：4.5％甘油，1.5％磷酸二氢铵，0.7％磷酸二氢钾，0.7％硫酸镁，0.6％硫酸钾，0.07％硫酸钙，0.3％氢氧化钾，ph5.1；发酵罐培养基配方：4.5％甘油，1.5％磷酸二氢铵，0.6％磷酸二氢钾，0.6％硫酸镁，0.6％硫酸钾，0.07％硫酸钙，0.3％氢氧化钾，ph5.1；采用以上发酵方法进行50l放大发酵罐验证实验，总发酵周期150h，其3批次的发酵产酶情况，平均产酶水平为85470u/ml，下表说明菌株不仅高产脂肪酶而且其发酵性能以及其所产的脂肪酶的酶活均具有一定的稳定性。3批次高产碱性脂肪酶菌株的发酵产酶情况批次发酵周期(h)发酵活力(u/ml)115085825215085560315085025实施例6酶活测定方法参考gb/t23535-2009方法，橄榄油与4％(w/v)聚乙烯醇(pva)以1:3(v/v)的比例混合，用高速匀浆机处理后得到乳白色的乳化液。以乳化后的橄榄油作为脂肪酶水解底物。每个反应体系包括4ml橄榄油乳化液、5ml50mmol/l缓冲液和1ml稀释的酶液。在40℃中反应15min后，该反应被15ml95％乙醇溶液终止。同时设置空白组，将预先灭活的酶液加入反应体系中作为空白。于实验组与空白组中分别加入2滴酚酞指示剂，采用0.1mol/lnaoh标准溶液进行滴定，直至液体呈微红色并保持30s内不褪色，计录消耗的0.1mol/lnaoh标准溶液的体积。取三次实验的平均值。单位脂肪酶活力的定义：一定反应条件下每分钟产生1μmol脂肪酸的酶量。计算酶活x＝(b-a)*c*100*n/0.1/15式中，x：样品的酶活力，u/ml；b：滴定样品所消耗的naoh的体积，ml；a：滴定空白样所消耗的naoh的体积；c：naoh标准液的浓度，mol/l；100：0.1mol/lnaoh标准溶液消耗1ml相当于产生100μmol的脂肪酸；n，样品稀释倍数；0.1：naoh标准液浓度换算系数；15：反应时间为15min。实施例7脂肪酶的酶学性质(1)最适作用ph以实施例5所得c-2发酵液上清液为样品，以测得的脂肪酶最高酶活为基准，在50℃的条件下，测定不同ph条件下的酶活力。由图2可知，该脂肪酶在ph范围10.0-11.5酶活稳定，最适作用ph10.5。(2)最适作用温度以实施例5所得c-2发酵液上清液为样品，以测得的脂肪酶最高酶活为基准，在ph10.5的条件下，测定不同温度条件下的酶活力，计算相对酶活，结果如图3所示，c-2所产脂肪酶45℃-60℃酶活稳定，最适作用温度为50℃。(3)耐碱性分别以实施例5所得yb-1和c-2发酵液上清液为样品，以不作处理的脂肪酶酶活为100％基准，样品分别在ph11.5的条件下进行50℃保温处理，每隔1h，测酶活，计算剩余酶活，从图4中可以看出，在9h后，c-2所产酶相对活性仍存留80％以上，与原始脂肪酶b-1编码基因构建的重组菌yb-1所产脂肪酶相比，耐碱性有很大提高，说明该重组菌c-2所产脂肪酶具有良好的耐碱性。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权力要求为准。sequencelisting<110>山东隆科特酶制剂有限公司<120>一种耐碱性脂肪酶<130>1<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>1578<212>dna<213>根霉菌ld037<400>1atgtcccggtggtccgcggcgactgccactgccaatggcggggcacctggtagcagagcc60ttcctgcattccgtcgcttccggagatccctggcccgacagcgtcgtcatctggacccgg120gtgacgccggtatctcaggccacgccgggttccggtgcgggggatccgacccgtgtgtac180tgggaggtgtccacagacgccagctttgacgtagccaccgcagctggggaaatgaccacc240gaagcggaccgcgaccacaccgtgaaaatcaatgtcacgggacttgccccgtccaccacc300tactattaccggttcacggtggtggacggtccgtccgcaggtgaggtatcccgcacgggt360cgaacgcggacgacgccggcggacgacgccgcaccggaccacctccgcttcggggtgtgt420tcgtgttcgaactacgaggcaggacacttccgtgcctaccgtgagcttgctgaccgcgac480gacgttgagttcgtcctgcatctcggcgactacacctatgaatacgagtccggggaatac540ggcgcggcctacggcacaacagtacggaccgtggaaccgcgcgaacgtacccgcacactc600gtcggttaccggatccgacaggggcactaccaccgagaccctgacctcgcagacctgcat660gccgctaagccgatgatctgcatctgggatgaccacgagtttttcgacaatgcgtggcgt720gacggtgccaccggggattccgactacggcggggcgcaggagtacgcggcggtgaggcag780gctgcgaccgaggcctactacgaatggatgccggttcgtgcgggagaggggttcggcacg840gacggtggacgtcatctctaccggcacctacgctacggtacgctcgcagagctcatcctc900cccgaccttcgcacttaccgcgacatgcagagctccccggccaccgctgccgcggacggc960cgcacgatgatgggacagaaccagttcgactggttcgcgggcgtcctgacgacctcgacg1020accacctggcaactggtcgggaactcggtgatgttcgctccgatgactttgcctcactca1080ctggatccacggttgcatgactggttggtcgacaagatcggcctgccgccggacggaatt1140gcactgaatacggaccagtgggacgggtacatggtggaacgccagcgcatcatcgacgtc1200atcatgaacagggggtccgggcctcacggtcgtggaatgaacgtggtcttcctcaccggt1260gacatccactcctcgtgggctgcagatatccccgcgcaggccggagagtatcggctgggc1320cgggacacgaccgtggcggccgcggagttcatcgtcccgtcggtgaccgctgcgagcgcc1380ttcgattcgattgttccgaccagtgccgcggcacctgcggtcagggaggctctgcggctg1440ggggaagggttgctcatggatgtggaccattggtacaagtacgtcgacctgagccgacac1500ggaatgatggtggtccccggggttcgtcctgccggacaagaactcgaccggtcccggacg1560gtctacaccccggcgtga1578<210>2<211>530<212>prt<213>根霉菌ld037<400>2metserargtrpseralaalathralathralaasnglyglyalapro151015glyserargalapheleuhisservalalaserglyaspprotrppro202530aspservalvaliletrpthrargvalthrprovalserglnalathr354045proglyserglyalaglyaspprothrargvaltyrtrpgluvalser505560thraspalaserpheaspvalalathralaalaglyglumetthrthr65707580glualaaspargasphisthrvallysileasnvalthrglyleuala859095proserthrthrtyrtyrtyrargphethrvalvalaspglyproser100105110alaglygluvalserargthrglyargthrargthrthrproalaasp115120125aspalaalaproasphisleuargpheglyvalcyssercysserasn130135140tyrglualaglyhispheargalatyrarggluleualaaspargasp145150155160aspvalgluphevalleuhisleuglyasptyrthrtyrglutyrglu165170175serglyglutyrglyalaalatyrglythrthrvalargthrvalglu180185190proarggluargthrargthrleuvalglytyrargileargglngly195200205histyrhisargaspproaspleualaaspleuhisalaalalyspro210215220metilecysiletrpaspasphisgluphepheaspasnalatrparg225230235240aspglyalathrglyaspserasptyrglyglyalaglnglutyrala245250255alavalargglnalaalathrglualatyrtyrglutrpmetproval260265270argalaglygluglypheglythraspglyglyarghisleutyrarg275280285hisleuargtyrglythrleualagluleuileleuproaspleuarg290295300thrtyrargaspmetglnserserproalathralaalaalaaspgly305310315320argthrmetmetglyglnasnglnpheasptrpphealaglyvalleu325330335thrthrserthrthrthrtrpglnleuvalglyasnservalmetphe340345350alaprometthrleuprohisserleuaspproargleuhisasptrp355360365leuvalasplysileglyleuproproaspglyilealaleuasnthr370375380aspglntrpaspglytyrmetvalgluargglnargileileaspval385390395400ilemetasnargglyserglyprohisglyargglymetasnvalval405410415pheleuthrglyaspilehissersertrpalaalaaspileproala420425430glnalaglyglutyrargleuglyargaspthrthrvalalaalaala435440445glupheilevalproservalthralaalaseralapheaspserile450455460valprothrseralaalaalaproalavalargglualaleuargleu465470475480glygluglyleuleumetaspvalasphistrptyrlystyrvalasp485490495leuserarghisglymetmetvalvalaspvalaspproserprogly500505510valargproalaglyglngluleuaspargserargthrvaltyrthr515520525proala530<210>3<211>1578<212>dna<213>根霉菌zf056<400>3atgtcccggtggtccgcggcgactgccactgccgatggcggggcacctggtagcagagcc60ttcctgcattccgtcgcttccggagatccctggcccgacagcgtcgtcatctggacccag120gtgacgccggtatctcaggccacgccgggttccggtgcgggggatccgacccgtgtgtac180tgggaggtgtccacagacgccagctttgacgtagccaccgcagctggggaaatgaccacc240gaagcggaccgcgaccacaccgtgaaaatcaatgtcacgggacttgccccgtccaccacc300tactattaccggttcacggtggtggacggtccgtccgcaggtgaggtatcccgcacgggt360cgaacgcggacgacgccggcggacgacgccgcaccggaccacctccgcttcggggtgtgt420tcgtgttcgaactacgaggcaggacacttccgtgcctaccgtgagcttgctgaccgc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技术特征：1.一种耐碱性脂肪酶，其特征在于，所述脂肪酶氨基酸序列如序列表seqidno.4所示。
2.权利要求1所述脂肪酶的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，如序列表seqidno.3所示。
4.权利要求1所述耐碱性脂肪酶的应用。
技术总结本发明属于生物技术领域，具体涉及一种耐碱性脂肪酶。本发明通过PCR获得来自根霉菌突变菌的耐碱脂肪酶突变基因B‑2，并将B‑2构建到pPIC9质粒上，得到重组质粒pPIC9‑B‑2，并转化到毕赤酵母GS200，筛选得到高表达碱性脂肪酶的重组菌C‑2，其碱性脂肪酶发酵酶活可达85000U/ml。C‑2所表达的碱性脂肪酶在pH 11.5的条件下处理9h，该酶相对活性仍剩余80％左右，具有较好的耐碱性。
技术研发人员：王兴吉;钱娟娟;曹世源;郭庆文;王金余;王克芬
受保护的技术使用者：山东隆科特酶制剂有限公司
技术研发日：2020.12.09
技术公布日：2021.03.12
