本发明属于酶工程领域，具体涉及木聚糖酶的突变，及其在利用农业废弃物生产木寡糖中的应用。
背景技术：
农业废弃物是农业生产、农产品加工、畜禽养殖业和农村居民生活排放的废弃物的总称。我国是一个农业大国，伴随着农产品的生产和加工，每年会产生大量的农业废弃物，这些农业废弃物是很好的可再生资源，但未得到有效的开发及利用，造成我国农业发展面临着农业废弃物排放量大、环境污染严重等突出问题。“以绿色发展引领乡村振兴”理念要求充分开发利用农业废弃物，通过技术进步实现其资源化，可以缓解资源及环境危机，实现环境效益与经济效益相统一，因此农业废弃物资源化综合利用成为近十几年各国科学家竞相研究的热点课题之一(孙潇,黄映晖.农业废弃物综合利用研究评述与展望[j].农业展望,2020,16(01):106-110)。农业废弃物含有丰富的纤维素和半纤维素，其中半纤维素占到20-30％，禾本科和阔叶木半纤维素的主要成分是木聚糖，与纤维素和木质素通过共价或者非共价交联。玉米芯、麦麸等富含的木聚糖，由于种种原因难以得到有效的利用。如造纸制浆过程中，富含木聚糖的工业废料直接排入水中，导致水体富营养化，严重破坏生态环境。充分利用和开发大量低值农业废弃物中木聚糖生产高附加值低聚木糖，不仅能够提高农业废弃物利用价值，还能在一定程度上解决环境、生态和能源等面临的问题(范光森.樟绒枝霉耐热木聚糖酶的纯化、性质和应用研究[d].中国农业大学,2014)。
由于木聚糖结构的复杂性，它的完全降解需要多种水解酶，包括β-1,4-内切木聚糖酶、α-l-阿拉伯呋喃糖基水解酶、α-d-葡萄糖醛酸基水解酶、乙酰木聚糖酯酶、β-d-木糖苷水解酶等，这些酶共同组成了木聚糖水解酶系统(安娇.糖苷水解酶与酯水解酶稳定性和底物选择性调控的结构基础[d].吉林大学,2015)。其中，β-1,4-内切木聚糖酶(ec3.2.1.8)以内切方式随机作用于木聚糖主链，产生木寡糖和少量的木糖(collinst,gerdayc,fellerg.xylanases,xylanasefamiliesandextremophilicxylanases[j].femsmicrobiolrev,2005,29(1):3-23)。虽然木聚糖的完全降解需要多种酶的协同作用，但是在木聚糖的降解过程中，β-1,4-内切木聚糖酶发挥的作用是最主要和最重要的，也是利用农业废弃物酶法制备低聚木糖最关键的酶，因此是木聚糖降解相关酶中研究最多和最有应用价值的一类酶。
目前，木聚糖酶主要应用于造纸、食品及饲料等工业生产中，为了更好的适用于复杂多样的生产环境，木聚糖酶的特性得到广泛研究，如耐热性、耐酸/碱性、底物特异性等，但酶催化底物生成特异性水解产物-低聚木糖(主要是木二糖和木三糖)相关研究较少，且水解特异性机制不清楚，而gh11木聚糖酶利用低附加值的农业废弃物生产高附加值的低聚木糖，关键在于其水解特异性机制的研究。有研究表明，n端对gh11木聚糖酶水解特异性存在一定影响。如，为探究gh11木聚糖酶n末端区域的结构-功能关系，将来自neocallimastixpatriciarum(np-xyn)的gh11木聚糖酶的17个n末端氨基酸嫁接到来自木霉嗜热芽孢杆菌(thermobacillusxylanilyticus)(tx-xyn)的非典型短gh11木聚糖酶的n末端，获得杂合酶ntfus，以小麦阿拉伯木聚糖为底物，其催化效率比亲本酶高17％，以碾磨的小麦秸秆作为底物，ntfus释放更多寡糖产物，表明杂合酶ntfus具有更宽范围的底物选择性，提出n末端延伸对底物结合位点有修饰(songl,dumonc,siguierb,etal.impactofann-terminalextensiononthestabilityandactivityofthegh11xylanasefromthermobacillusxylanilyticus[j].journalofbiotechnology,2014,174(1):64-72)；li等(liq,sunb,xiongk,etal.improvingspecialhydrolysischaracterizationintotalaromycesthermophilusf1208xylanasebyengineeringofn-terminalextensionandsite-directedmutagenesisinc-terminal[j].internationaljournalofbiologicalmacromolecules,2017,96:451-458)采用2c1f的n端序列前8个氨基酸替换t-xyn的前16个氨基酸及第1个lys被ala代替的策略，获得突变酶t-xynf，其以木三糖为底物时，木四糖生成量比木糖高20.71％，该结果说明较强的转化率增加了糖苷分子的浓度从而增强了转糖苷活性(mahoneyrr.galactosyl-oligosaccharideformationduringlactosehydrolysis:areview[j].foodchemistry,1998,63(2):147-154)，有助于低聚木糖生产；li等(qinl,sunb,jiah,etal.engineeringaxylanasefromstreptomycerochei,l10904bymutationtoimproveitscatalyticcharacteristics[j].internationaljournalofbiologicalmacromolecules,2017,101:366-372)报道来自streptomycerocheil10904的木聚糖酶(srxyn)利用定点诱变实现n-末端区域置换，以改善其催化特性，三种突变体srxynf、srxynm和srxynfm比srxyn具有更高的底物亲和力和催化效率且水解特性获得改善，最值得注意的是以木聚糖为底物时，产生木二糖(x2)和木三糖(x3)的能力增强。
技术实现要素：
本发明人进一步研究streptomycerocheil2001gh11重组木聚糖酶xyna的n端的突变，经过研究发现在其n端序列进行突变的某些突变体表现出优异的效果，因而完成本发明。
本发明提供一种木聚糖酶xyna的突变体，其特征在于，在相应于以seqidno：2所示的氨基酸序列所示木聚糖酶xyna而言，其第33位发生突变，或者其第11至16位发生突变。
优选地，其第33位发生突变为s33p，或者第11至16位同时发生如下突变：t11y、d12h、n13d、f15y和y16f。更具体的，所述突变体具有如seqidno：5，或者seqidno：7所示的氨基酸序列。
本发明进一步提供编码所述的突变体的基因，更优选地，其具有如seqidno：4，或者seqidno：6所示的核苷酸序列。
本发明进一步提供含有所述的基因的表达载体、或重组细胞系，或重组菌。优选地，其是诱导表达载体；所述重组菌是链霉菌，更优选为streptomycerochei。
本发明更进一步提供所述的突变体在水解木聚糖中的应用。在一些实施方式中，所述水解底物为桦木木聚糖、榉木木聚糖或燕麦木聚糖之一或其组合。优选地，在进行水解时温度控制在50-75℃。
在另一些具体实施方式中，所述水解底物为含有木聚糖的农业废弃物或工业废弃物。
本发明设计了4个位于n端部位(n端序列替换，r2区域替换，t30e，s33p)的突变策略，利用重叠延伸pcr技术获得突变酶，水解榉木木聚糖预试验表明，n端突变酶xynan、xynar、xynas水解产物发生显著变化。其中，与xyna相比，xynas和xynar最适温度分别提高了10℃和15℃，分别达70℃和75℃，xynar在80℃下保温30min残余酶活仍达到90％以上，xynas在60℃下半衰期提高了2.5倍，达到210.0min，两者温度稳定性均显著提高，更具有应用价值。
附图说明
图1streptomycesrameusl2001木聚糖酶xyna的三维结构模拟及评估。
注：黄色为催化活性位点(87、177)。其中，a为模拟xyna的三维结构，b为拉式图，c为氨基酸打分图。
图2streptomycesrameusl2001木聚糖酶xyna和木六糖分子对接。其中，a为将处理后的xyna和木六糖利用cdocker进行分子对接，b为对接后对亚位点划分及与木六糖有相互作用力的氨基酸进行分析，分别为-3至 3亚位点。
图3xynar的1％的琼脂糖电泳图。其中，道1-8：xynar的下片段；道9-12：xynar的上片段；道13-16：xynar(576bp)。
图4xyna及3个突变体水解榉木木聚糖的产物测定。
图5xyna和3个突变体的sds-page电泳图。其中，泳道1：xyna(分子量约20.8kda)，泳道2：纯化xyna，泳道3：xynar(分子量约21.0kda)，泳道4：纯化xynar，泳道5：xynas(分子量约20.8kda)，泳道6：纯化xynas，泳道7：xynan(分子量约21.0kda)，泳道8：纯化xynan。
图6xyna及突变酶最适ph(a)及ph稳定性(b)的测定。其中，a为酶的最适ph测定结果，b为酶的ph稳定性测定结果。
图7xyna(c)及突变酶最适温度的测定。
图8xyna(c)及突变酶(a,b)温度稳定性的测定。
图9xynan(a)、xynar(b)、xynas(c)和xyna(d)半衰期测定。
图10xyna水解不同底物的产物测定和tlc图。其中，a和b分别为xyna水解桦木木聚糖的产物测定和tlc图、c和d为水解榉木木聚糖的产物测定和tlc图、e和f为水解燕麦木聚糖产物测定及tlc图。
图11xynar水解不同底物的产物测定和tlc图。其中，a和b分别为水解桦木木聚糖的产物测定和tlc图、c和d为水解榉木木聚糖的产物测定和tlc图、e和f为水解燕麦木聚糖产物测定及tlc图。
图12xynas水解不同底物的产物测定和tlc图。其中，a和b分别为水解桦木木聚糖的产物测定和tlc图、c和d为水解榉木木聚糖的产物测定和tlc图、e和f为水解燕麦木聚糖产物测定及tlc图。
图13xynan水解不同底物的产物测定和tlc图。a和b分别为水解桦木木聚糖的产物测定和tlc图、c和d为水解榉木木聚糖的产物测定和tlc图、e和f为水解燕麦木聚糖产物测定及tlc图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方式或实施例对本发明作进一步的阐述，以便更好的理解本发明。
1、实验材料
(1)菌株、基因、质粒和感受态细胞
streptomyce.rocheil2001为北京食品营养与人类健康高精尖创新中心保藏；源于streptomycerocheil2001g11重组木聚糖酶xyna(已切除信号肽序列的目的基因)保存于北京食品营养与人类健康高精尖创新中心；克隆载体pmd18-t来自takara公司；质粒pet-28a( )购自novagen公司；感受态细胞大肠杆菌e.colidh-5α和e.colibl21(de3)购自天根生化科技有限公司。
(2)酶及化学试剂
限制性内切酶ncoi和xhoi、
(3)仪器
tu-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；waterse2695alliancehplc-2414检测器，waters公司；eps301琼脂糖凝胶电泳仪，美国ge公司；yxq-ls-50sii立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；hr60-iia2生物安全柜，青岛海尔特种电器有限公司；恒温培养箱，上海stik公司；t100-thermalcyclerpcr仪，美国bio-rad公司；xo-650超声波细胞破碎仪，南京先欧仪器制造有限公司；microfuge20r台式微量离心机，德国beckman公司；imagequant300凝胶成像仪，美国ge公司。
2、木聚糖酶xynan端突变体的构建策略
(1)木聚糖酶xyna三维模型构建及n端木聚糖酶突变体策略
利用discoverystudio2018软件，以xlnb2(id:5ej3)和嗜热gh11xylanase(id:3zse)为模板，模拟木聚糖酶xyna三维结构,通过拉式图和氨基酸打分对模型评估。模拟xyna的三维结构(图1中a)，通过拉式图(图1中b)和氨基酸打分(图1中c)分析所建模型可靠，可以此模型做后续研究。
如图2所示，(a)将处理后的xyna和木六糖利用cdocker进行分子对接，(b)对接后对亚位点划分及与木六糖有相互作用力的氨基酸进行分析，分别为-3至 3亚位点。有文献报道，木聚糖酶的底物结合位点可以分为一系列亚位点，标记为-n和 n。负数表示糖链非还原端底物识别部位，正数表示糖链的还原端产物释放部位[3]。初步认为木聚糖酶与底物结合时需结合位点与木聚糖底物形成连接力来维持酶与底物的催化过渡形态，然后将结合的木聚糖置于催化位点上，在双置换催化反应机制下，生成不同水解产物。
(2)n端木聚糖酶突变体策略
(a)xynan：基于突变酶ntfus释放更多寡糖产物且具有更宽范围的底物选择性和t-xynf[9]表现出较强底物转化率增加了糖苷分子的浓度从而增强了转糖苷活性的研究。本文将xyna与2cif进行序列比对，用“aftvgngq”替换“atvvtt”,采用重叠延伸pcr方法进行目的基因扩增，带有酶切位点的引物设计如下：
s11nf1(ncoi)5’-3’:
catgccatggccttcaccgttggtaacggtcagaaccagaccggcaccgacaac
1s11r1(xhoi)5’-3’:
ccgctcgagcgacgacaccgtgatattggagttg
(b)xynar：通过比对耐热木聚糖酶tfxa与xyna序列，拟替换关键区域(region2)的五个氨基酸，研究其提升xyna的耐热性的同时，探究其对木聚糖酶水解特性的影响，将“tdngfy”变为“yhdgyf”，即t11y、d12h、n13d、f15y、y16f形成了突变体xynar。采用重叠延伸pcr技术进行目的基因扩增，带有酶切位点的引物设计为：
xynarf5’-3’:gaccggctaccacgacggctacttcta
xynarr5’-3’:agaacgagtagaagtagccgtcgtggtagc
(c)xynat及xynas：通过比对耐热木聚糖酶tfxa与xyna序列，得到两酶在r4区相关基因的差别，即30位和33位有所不同，故对这两个位点进行突变t30e、s33p，获得两个突变体xynat及xynas。采用重叠延伸pcr方法进行目的基因扩增，带有酶切位点的引物设计为：
s11tf15’-3’:gcacggtctcgatggagctgg
s11tr15’-3’:ccaccggagcccagctccatc
s11sf15’-3’:gatgaccctgggccccggtg
s11sr15’-3’:gctctagttgccaccggggcc。
(注：xynat在水解预实验效果表现不明显，所以对其不再进行后续性质研究)。
(3)木聚糖酶xyna及各突变体基因的获得
根据前述生物信息学分析的结果，拟定以上突变策略并设计引物。提取e.colidh-5α中含有xyna目的片段的质粒，将其作为pcr反应中的模板，采用重叠延伸pcr技术进行突变。其中带酶切位点的全长引物为：
1s11f2:catgccatggccacggtcgtcaccacgaac
1s11r1:ccgctcgagcgacgacaccgtgatattggagttg。
全长扩增的pcr反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次，72℃再延伸10min。
表1pcr反应体系(50μl)
对n端各突变酶设计的引物利用重叠延伸pcr技术进行pcr扩增，得到的各dna片段，以xynar为例，如图3。
(2)表达载体pet-28a与目的基因xyna及各突变体双酶切和连接
将带有酶切位点ncoi和xhoi的目的基因及表达载体pet-28a进行双酶切，双酶切的反应体系如表2所示，反应条件为37℃保温3-4h。将酶切产物进行1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳检测，并采用胶回收试剂盒纯化，获得带有粘性末端的目的基因及线性化的表达载体pet-28a。
表2目的基因与表达载体pet-28a双酶切体系
采用限制性内切酶ncoi和xhoi将如上得到的dna片段以及表达载体pet-28a分别进行双酶切并胶回收，回收后目的基因以及pet-28a使用t4dna连接酶进行连接，获得带有目的基因的重组质粒pet-28a-xyna、pet-28a-xynar、pet-28a-xynan、pet-28a-xynas、pet-28a-xynat。
3、重组质粒pet-28a-xyn的转化与验证
用上述表达载体转化感受态细胞e.colide3后，在筛选平板中随机挑取lb抗性筛选平板中的克隆子进行菌落pcr验证，在无菌条件下，挑取部分菌落于已配制好的pcr体系中吸打混匀作为扩增模板。选择目的基因全长引物作为pcr扩增的上下游引物。pcr反应条件为：预变性94℃5min，变性94℃30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次，72℃再延伸10min。将菌落pcr产物进行1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳检测后送至测序公司测序。测序结果与目的基因序列一致，将测序正确的样品进行甘油管的保存。
4、重组酶xyna及n端突变酶的诱导表达
(1)种子液的活化：将测序结果正确的甘油管保存的菌液接种于含有40μg/mlkan 的5mllb液体培养基，37℃200r/min培养12h进行活化，作为种子液。
(2)扩大培养：以1％的接种量，将活化后菌液转接至含40μg/mlkan 的100mllb液体培养基中，37℃2000r/min培养至od600值达0.6-0.8。
(3)诱导产酶：在无菌条件下，在扩大培养菌液中添加iptg至终浓度为0.5mmol/l，20℃200r/min振荡培养14-16h对重组木聚糖酶进行诱导表达。
(4)粗酶液的获得：将上述培养的菌液进行离心，10000rpm4℃离心5min收集菌体，弃去上清收集菌体沉淀。采用10ml0.05mol/lph6.0的柠檬酸钠缓冲液重悬菌体，超声破壁15min后10000rpm4℃离心5min，所得上清液即为粗酶液。
5、重组酶xyna及n端突变酶水解预实验
为了表征木聚糖酶的水解，将含有500μl反应混合物，包括50mmph6.0的柠檬酸缓冲液配置的10mg/ml榉木木聚糖底物和5u/ml木聚糖酶粗酶液，30℃下孵育8h，然后煮沸10min并在冰水浴中冷却并离心。
将样品离心并用0.22μm膜滤器过滤，采用waters系列hplc对样品进行分析，色谱柱为ks-802，配有waters2695示差检测器(ri)。色谱条件为：柱温65℃，流动相为高纯水，流速为0.6ml/min，进样20min，进样量10μl。x1，x2，x3，x4，x5用作标准。结果如图4所示，与原酶相比，水解榉木木聚糖4h，xynar水解产物中木二糖产量增加85％，木三糖产量增加80％；xynas水解产物中木二糖产量增加了32％，木三糖产量增加了33％，木四糖产量增加了53％；xynan水解产物中木二糖产量增加了56％，木三糖产量增加了20％。根据水解榉木木聚糖的结果，n端突变酶xynan、xynar、xynas水解产物发生了显著变化，以此三个突变酶作后续研究。
6、重组酶xyna及n端突变酶的纯化
采用ni柱(nisepharosehpcolumn，1×10cm)及
结果如表3所示，较原酶，xynar和xynas比酶活提高，xynan比酶活降低。取重组木聚糖酶纯酶液10μg经过sds-page电泳检测，如图5所示，各酶都成功表达，且蛋白目的条带单一，成功获得了电泳纯的酶液，可以用于酶学性质的研究。
表3原酶及突变酶纯酶液的比酶活
7、酶活力测定
重组木聚糖酶的酶活力测定参照dns法。木聚糖酶酶活测定反应体系包括0.9ml相应缓冲液配制的1％(w/v)榉木木聚糖底物保温5min，加入0.1ml适当稀释的酶液，55℃反应10min。加入1mldns溶液终止反应，沸水浴15min，冷却并离心，加入1ml40％(w/v)四水合酒石酸钾钠溶液，540nm条件下测定吸光度值，采用木糖绘制标准曲线计算还原糖(以木糖计)的量。1个木聚糖酶活力单位(u)定义为：在上述实验条件下，每分钟水解木聚糖生成1μmol木糖所需要的酶量。
8、最适反应ph和ph稳定性的测定
(1)测定ph对酶活力的影响，选择ph3.0-9.0(50mm)的缓冲液：柠檬酸盐缓冲液ph3.0-6.5、巴比妥钠缓冲液ph7.0-9.0，在37℃条件下测定酶活。最高的木聚糖酶活性定义为100％，计算在不同ph下的相对酶活力，绘制相对酶活力随ph值的变化曲线。
酶最适ph测定结果如图6中a所示，原酶xyna最适反应ph为6.0，突变酶xynar最适ph与原酶一致为6.0，而xynan的最适ph值降低，达到4.5，更偏酸性，xynas的最适ph值也稍降低为5.0。
(2)测定酶的ph稳定性，将酶置于上述测定的不同ph缓冲液中保温，即37℃保温30min，冰水浴30min后，于37℃、最适ph条件下测定残余酶活。以未经保温处理的酶测定的酶活定义为100％，计算残余酶活力，绘制残余酶活力随ph值的变化曲线。
测得结果如图6中b所示，在ph3.0-5.0时，突变酶xynar和xynas残余酶活均可达到60％以上，而xynan随着ph的升高，稳定性呈上升的趋势，在ph4.0时，残余酶活可达到80％以上，但原酶在ph3.0-4.5残余酶活力不及20％。在ph5.0-9.0的条件下，重组木聚糖酶的残余酶活力变化趋势基本一致，均能保持80％以上。与原酶相比，n端突变酶ph稳定性范围均变广，主要体现为在酸性条件下ph耐受性增强，更加耐酸，表明n端序列突变对酶ph的影响较大，较易改变酶ph稳定性。
9、最适反应温度和温度稳定性的测定
(1)最适反应温度测定
测定温度对酶活力的影响，选择20-90℃，每5℃为一个温度梯度，在各自最适ph下进行测定。最高的木聚糖酶活性定义为100％，计算在不同温度下的相对酶活力，绘制相对酶活力随温度的变化曲线。
最适温度测定结果如图7所示，重组原酶xyna的最适反应温度为60℃，较原酶，n端突变酶xynar最适温度提高了15℃，为75℃；xynas最适温度提高了10℃，为70℃；xynan最适温度降低了20℃，为40℃。
(2)温度稳定性测定
测定酶的温度稳定性，将酶分别置于20-80℃条件下保温30min(最适ph下)，然后冰水浴30min，在最适温度、最适ph下测定残余酶活。以未经保温处理的酶测定的酶活定义为100％，绘制残余酶活力随孵育温度的变化曲线。
由图8可知，65℃保温30min，原酶xyna残余酶活不足20％，xynas残余酶活仍可达到60％以上，xynar残余酶活仍为100％左右，而80℃保温30min后，残余酶活仍保持在60％以上，xynas和xynar耐热性均显著提高；而xynan在45℃下保温30min，其残余酶活迅速降低，不足60％，在60℃时残余酶活不到5％，耐热性显著降低。
由此可知，位于n端的3个突变酶温度均发生较大变化，其中xynar和xynas温度稳定性显著提高，而xynan温度稳定性显著降低。
10、半衰期
为了排除蛋白浓度对重组木聚糖酶热稳定性的影响，将纯酶液的蛋白浓度均稀释至0.5mg/ml，分别取重组酶xynan、xynas和xyna的纯酶液在60℃下保温不同时间后迅速冷却；xynar的纯酶液在80℃下保温不同时间后迅速冷却。预实验结果显示xynan的热稳定性较差，因此保温时间选择：0、10s、20s、30s、40s、50s、60s。xyna热稳定性较强，保温时间：0、15min、30min、60min、90min、120min和180min。xynas保温时间：0、30min、60min、90min、120min、180min和360min。xynar保温时间：0、30min、60min、90min、120min、180min、240min、300min和360min。绘制酶活力随时间变化曲线y＝a*e-kt(a为初始酶活力，t为时间，k为衰变常数)，即半衰期t1/2＝ln2/k。根据此公式分别计算突变前后重组木聚糖酶在60℃或80℃下的半衰期。
结果如图9所示，xyna、xynan和xynas在60℃下半衰期分别为84.5min、21.9s、210.0min，xynar在60℃下保温12h，其残余酶活仍在90％以上，因此，xynar于80℃下保温不同时间，计算半衰期为154.0min。
由表4可知，与xyna相比，xynan半衰期降低了231.5倍，酶的热稳定性显著降低，与前期温度稳定性的测定结果一致，n端是酶解折叠的起始端，n端序列“aftvgngq”替换“atvvtt”，不利于酶的稳定性。xynar和xynas半衰期明显增加，与温度稳定性实验得到的结果一致，r2区域的五个位点和33位点同样位于n端，但通过对此区域的突变，提高了酶的热稳定性。
表4xyna及突变酶半衰期的测定
11、底物特异性
测定酶的底物特异性，分别以1％榉木木聚糖、桦木木聚糖酶和燕麦木聚糖为底物，重组木聚糖酶于最适反应ph值、最适反应温度下，采用上述dns方法进行酶活力测定。
从表5可知，n端突变体底物特异性未发生变化，与原酶一致，表现出对榉木木聚糖活性最大，桦木木聚糖次之，燕麦木聚糖最低。以榉木木聚糖为底物时，xynas和xynar的比酶活分别为1983.0、2589.5u/mg，较原酶分别提高了46％、91％，而xynan比酶活为327.0u/mg，较原酶，降低了76％。以桦木木聚糖为底物时，与原酶相比，xynas和xynar比酶活分别提高了22％、108％，xynan比酶活降低了84％。以燕麦木聚糖为底物时，与原酶相比，仅xynar比酶活提高了80％，其他突变酶比酶活均降低，其中xynan比酶活只有25.8u/mg。
表5xyna及突变酶底物特异性的测定
12、酶促动力学
配置六个不同浓度的榉木木聚糖底物溶液，选择重组木聚糖酶最适反应ph值、最适反应温度下测定重组木聚糖酶的酶活力，通过graphpadprism5软件计算重组木聚糖酶的酶促反应动力学参数km、vmax及kcat。
酶促动力学常数测定结果如表6所示，与原酶相比，xynan和xynas对底物亲和力增大，xynas催化效率提高，而xynan催化效率降低；xynar对底物亲和力减小，但xynar催化效率提高。催化效率变化可能是与突变位点及活性中心氨基酸距离有关，从而导致xynas、xynar比酶活提高，xynan比酶活降低。由此可知木聚糖酶底物的结合需要n端r2区的五个氨基酸，而n端延伸的序列、s33p有利于木聚糖酶底物的结合。s33p、r2区的突变，有利于提高酶的催化能力。
表6xyna及突变酶酶促动力学参数的测定
13、水解特性研究
分别以木聚糖(榉木木聚糖、桦木木聚糖、燕麦木聚糖)和低聚木糖(x2-x5)为底物进行水解反应，由于各酶在30℃下残余酶活可达到90％以上，故选择30℃作为水解温度。
木聚糖：为了表征木聚糖酶的水解，将含有500μl反应混合物，包括50mmph6.0的柠檬酸缓冲液配置的10mg/ml木聚糖底物和5u/ml木聚糖酶，30℃下150rpm孵育0、15min、30min、1h、2h、4h、8h，然后煮沸10分钟并在冰水浴中冷却并离心。
低聚木糖：包括150μl反应体系中含有0.1mg·ml-1底物、5u/ml木聚糖酶，30℃下150rpm孵育0、15min、30min、1h、2h、4h、8h，然后煮沸10分钟并在冰水浴中冷却并离心。
hplc：参照前述实施例，所有实验一式三份进行。
薄层色谱(tlc)分析：将样品点在硅胶板(merck)上，并在丁醇-乙酸-水(2:1:1，v/v/v)溶剂中展开两次，然后将板用甲醇和硫酸混合物(95:5，v/v)的溶液喷雾几秒钟，然后在105℃下加热几秒钟。x1，x2，x3，x4和x5用作标准。
(1)xyna水解木聚糖
由图10中可知，xyna水解桦木木聚糖和榉木木聚糖，主要产生了木二糖、木三糖和木四糖，水解8h时，占比分别为47.8％、45.3％、6.9％及46.4％、44.9％、8.7％。随着水解时间延长，木二糖呈现增加的趋势，木四糖呈现减少的趋势，木三糖呈现先增加后减少，最后保持稳定，产生少量木糖。xyna水解桦木木聚糖和榉木木聚糖所产低聚木糖(x2 x3 x4 x5)总量随着时间延长增加，水解8h时分别达到2.10mg/ml和2.72mg/ml。xyna水解桦木木聚糖和榉木木聚糖产物及规律相同，可能原因是两者结构相似。
与水解桦木木聚糖和榉木木聚糖不同，xyna水解燕麦木聚糖，主要产生了木二糖、木三糖、木四糖和木五糖，水解8h时，其占比分别为32.0％、30.2％、9.4％、28.3％。随着水解时间延长，木二糖呈现增加的趋势，木四糖变化不大，木三糖呈现先增加后减少的趋势，木五糖呈现增加的趋势，产生少量木糖且呈现增加的趋势。低聚木糖(x2 x3 x4 x5)总量随着时间延长增加，水解8h达到3.81mg/ml。由此可见，xyna水解燕麦木聚糖与水解桦木木聚糖和榉木木聚糖主要产物不同，考虑原因是木聚糖结构及dp不同。
(2)xynar水解木聚糖
从图11可知，xynar水解桦木木聚糖和榉木木聚糖，主要产生了x2、x3、x4，水解8h时，各自占比分别为45.9％、48.7％、5.4％及46.4％、48.1％、5.5％，较原酶，其产物组成比例发生变化，x3占比升高，x4占比降低，xynar水解两种木聚糖的水解产物及规律相似。xynar水解桦木木聚糖至8h，x2(1.44mg/ml)较原酶(0.97mg/ml)增加了48％，x3(1.53mg/ml)较原酶(0.92mg/ml)增加了66％；xynar水解榉木木聚糖至8h，x2(1.69mg/ml)较原酶(1.22mg/ml)增加了49％；x3(1.75mg/ml)较原酶(1.18mg/ml)增加了60％。产物均含少量x1和x5，较原酶，x1生成时间提前。xynar水解桦木和榉木木聚糖2h均达到最高低聚木糖(x2 x3 x4 x5)总量分别为3.35mg/ml和3.70mg/ml，分别比原酶(2.10mg/ml和2.72mg/ml)增加了60％和36％。xynar水解效率较原酶明显提高。
xynar水解燕麦木聚糖，主要产生了x2、x3、x4、x5，水解8h，占比分别为38.9％、32.3％、0％、28.9％，较原酶，其产物组成比例发生变化，x4占比减少；与其水解桦木和榉木木聚糖相比，主要产物及比例差别显著，可能的原因是燕麦木聚糖结构不同于山毛榉木和桦木木聚糖。水解8h，含少量x1(0.41mg/ml)，较原酶(0.25mg/ml)增加了64％；x2(2.41mg/ml)较原酶(1.22mg/ml)增加了98％；x3(2.00mg/ml)较原酶(1.15mg/ml)增加了74％；x5(1.79mg/ml)较原酶(1.08mg/ml)增加了66％。低聚木糖(x2 x3 x4 x5)总量随着时间的延长增加，水解8h时达到6.21mg/ml，比原酶(3.81mg/ml)增加了63％。xynar水解15min(5.39mg/ml)比原酶水解8h(3.81mg/ml)低聚木糖(x2 x3 x4 x5)总量增加了41％，xynar对含有较大阿拉伯糖残基的木聚糖，水解产率更高。li等[20]在酸性木聚糖酶pjxyn(ph4.0)n端27和39位引入二硫键得到突变酶pjxyns(27)s(39)，其最适温度提高2℃，以榉木木聚糖为底物，pjxyns(27)s(39)的产物中木糖增加(87.62％)，木二糖增加(56.65％)，改善了水解特性。
综上可得，xynar水解效率较原酶明显提高，不仅体现在时间缩短，还有产量提高，产生木二糖、木三糖的能力明显增强，表明r区的五个位点是影响其水解木聚糖生成木二糖、木三糖关键非功能区域。
(3)xynas水解木聚糖
从图12可知，xynas水解桦木木聚糖和榉木木聚糖，主要产生了x2、x3、x4，水解8h时，其占比为44.8％、45.9％、9.3％及42.3％、47.8％、9.9％，较原酶，其产物组成比例发生变化，主要体现在x2比例下降，x4比例上升，产物均含少量的x1和x5，xynas水解两种木聚糖的水解产物及规律相似。xynas水解桦木木聚糖至8h，x1(0.047mg/ml)比原酶(0.060mg/ml)减少了21.7％，x2(0.87mg/ml)比原酶(0.97mg/ml)降低了10％，x4(0.18mg/ml)比原酶(0.14mg/ml)增加了28.6％，x5(0.12mg/ml)比原酶(0.07mg/ml)增加了71.4％，水解2h，低聚木糖(x2 x3 x4 x5)总量达到最高为2.42mg/ml，比原酶(2.02mg/ml)增加了19.8％，水解效率提高。
xynas水解榉木木聚糖水解8h，x1(0.03mg/ml)比原酶(0.06mg/ml)减少了50％，x4(0.27mg/ml)比原酶(0.23mg/ml)增加了17％，x5(0.06mg/ml)比原酶(0.09mg/ml)减少了33％，水解2h，x3达到最高1.36mg/ml，较原酶(1.17mg/ml)增加了16％，xynas水解30min，低聚木糖(x2 x3 x4 x5)总量(2.51mg/ml)相当于原酶水解2h(2.48mg/ml)，因此xynas水解效率提高。
xynas水解燕麦木聚糖，主要产生了x2、x3、x4、x5，水解8h时，其占比为33.2％、30.8％、9.6％、26.5％，与其水解桦木和榉木木聚糖相比，主要产物及比例差别显著。水解8h，x3(1.51mg/ml)较原酶(1.15mg/ml)增加了31％，x4(0.47mg/ml)较原酶(0.36mg/ml)增加了31％，x5(1.30mg/ml)较原酶(1.08mg/ml)增加了20％，低聚木糖(x2 x3 x4 x5)总量(4.91mg/ml)较原酶(3.81mg/ml)增加了29％。xynas水解1h(4.20mg/ml)比原酶水解8h(3.81mg/ml)的低聚木糖(x2 x3 x4 x5)总量高，其水解效率提高。
综上可得，较原酶，xynas水解效率提高，不仅体现在时间缩短，还有产量提高，产生木四糖的能力增强，表明33位可能是影响其水解木聚糖生成木四糖关键非功能区域。
(4)xynan水解木聚糖
从图13可知，xynan水解桦木和榉木木聚糖，主要产生了x2、x3、x4，产物均产生少量的x1和x5，水解8h时，其占比为51.0％、40.9％、8.2％及50.8％、43.3％、6.0％，较原酶，其产物组成比例发生变化，主要体现在x2、x4(桦木木聚糖)的比例增加，x3的比例减少。水解桦木木聚糖至8h，x1(0.073mg/ml)比原酶(0.060mg/ml)增加了21.7％，x2达到1.06mg/ml，x3达到0.85mg/ml，x4(0.17mg/ml)比原酶(0.14mg/ml)增加了21.4％，低聚木糖(x2 x3 x4 x5)总量达到2.16mg/ml。xynan水解15min，低聚木糖(x2 x3 x4 x5)产量(1.71mg/ml)比原酶水解1h(1.57mg/ml)高，xynan水解效率提高。
xynan水解榉木木聚糖至8h，x2达到1.28mg/ml，x3达到1.09mg/ml，x4(0.15mg/ml)比原酶(0.23mg/ml)减少了35％，x5(0.065mg/ml)比原酶(0.087mg/ml)减少了25％，低聚木糖(x2 x3 x4 x5)总量达到2.58mg/ml。xynan水解两种木聚糖水解产物相同，但水解规律有差别。由于xynan对两种木聚糖之间的细微差异敏感，因此可能会导致两种底物的水解产物之间产生差异。
xynan水解燕麦木聚糖，主要产生了x2、x3、x4、x5，水解8h时，其占比为38.9％、24.9％、6.1％、30.0％，与其水解桦木和榉木木聚糖相比，主要产物及比例差别显著，与原酶相比，水解产物比例不同，x2、x5比例升高，x3、x4比例降低。水解8h，x2(1.53mg/ml)较原酶(1.22mg/ml)增加了25％，x4(0.24mg/ml)较原酶(0.36mg/ml)降低了33％，x3(0.98mg/ml)较原酶(1.15mg/ml)降低了15％，x5达到1.18mg/ml，低聚木糖(x2 x3 x4 x5)总量达到3.93mg/ml。
由上可知，xynan水解榉木和燕麦木聚糖，水解产物比例虽有改变，但水解效率并未提高。对n端序列替换，并不一定会得到正向效应，但较易改变酶的特性。
序列表
<110>北京工商大学
<120>木聚糖酶xyna的突变体及其应用
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1.一种木聚糖酶xyna的突变体，其特征在于，在相应于以seqidno：2所示的氨基酸序列所示木聚糖酶xyna而言，其第33位发生突变，或者其第11至16位发生突变。
2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，其第33位发生突变为s33p，或者第11至16位同时发生如下突变：t11y、d12h、n13d、f15y、y16f。
3.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，其具有如seqidno：5，或者seqidno：7所示的氨基酸序列。
4.编码如权利要求1至3任一项所述的突变体的基因，更优选地，其具有如seqidno：4，或者seqidno：6所示的核苷酸序列。
5.含有如权利要求4所述的基因的表达载体、或重组细胞系，或重组菌；优选地，所述表达载体是诱导表达载体；所述重组菌是链霉菌，更优选为streptomycerochei。
6.如权利要求1至3任一项所述的突变体在水解木聚糖中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述水解底物为桦木木聚糖、榉木木聚糖或燕麦木聚糖之一或其组合。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述水解底物为含有木聚糖的农业废弃物或工业废弃物。
9.如权利要求6至8任一项所述的应用，其特征在于，在进行水解时温度控制在50-75℃。
技术总结