一种GH16家族耐热葡聚糖酶突变体及其构建方法与应用与流程

专利2022-07-08 101

本发明涉及基因工程和遗传工程领域，具体地涉及一种gh16家族耐热葡聚糖酶突变体及其构建方法与应用。

背景技术：

纤维素、半纤维素和木质素等是植物细胞壁的主要组成成分。纤维素大约占细胞干重的40～45％，是由葡萄糖通过β-1,4-和β-1,3-糖苷键连接而成的线状结构分子。木质素是一种复杂酚类聚合物，约占细胞干重的15～25％。半纤维素约占细胞干重的30～35％，是继纤维素之后最丰富的可再生生物资源，它由杂聚多糖组成，按主链组成占多数的糖来命名，称之为葡聚糖、甘露聚糖、和葡甘露聚糖等(schulzee1891.berdtschchemges24,2277-2287.)。其中β-葡聚糖是单子叶禾本科植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，主要存在于糊粉层和胚乳细胞中，如大麦和燕麦胚乳细胞壁含有约70～75％的葡聚糖(philippesetal.2006.planta224(2),449-461.)。

β-葡聚糖酶是能分解β-糖苷键链成的葡萄糖聚合物的一类酶的总称。按作用方式不同可分为内切型和外切型两类。其中内切β-1,3-1,4-葡聚糖酶(e.c.3.2.1.73)可以专一作用于与β-1,3键相连的β-1,4糖苷键，使其降解为低分子量片段，失去亲水性和粘性，降低单胃动物肠道内容物黏度，提高内源性消化酶活性，改善肠道微生物环境，提高生长性能和饲料的转化率(mathlouthinetal.2002.aminres51,395-406.)。在食品酿造方面应用广发，尤其在啤酒酿造过程中，麦芽中的葡聚糖造成啤酒过滤困难、堵塞过滤膜，增加了啤酒的生产成本和品质，采用酸性葡聚糖酶和葡聚糖酶协同作用，可以解决以上问题。因此，酸性葡聚糖酶的产生、纯化、热稳定性、催化效率以及酸性特征的结构基础及其在饲料加工、酿酒工业、果汁加工、以及能源等领域的应用正在不断深入。

由于不同工业对葡聚糖酶性质需求不同，因此，改良有应用潜力的葡聚糖酶研究仍具有重大意义。

技术实现要素：

针对现有技术问题，本发明提供了一种gh16家族耐热葡聚糖酶突变体及其构建方法与应用，该类突变体是对葡聚糖酶酶野生型的氨基酸进行点突变后得到酸性的葡聚糖酶突变体，该类突变体能够耐受65℃以上的高温处理，在酸性及中性ph下均具有非常高的半纤维素酶活力，尤其是在饲料、啤酒酿造以及食品等工业领域中具有很好的应用潜力。

一种gh16家族耐热葡聚糖酶突变体，以葡聚糖酶野生型的序列seqidno.4为基础，进行点突变得葡聚糖酶突变体e36r、d127k或e36r/d127k；当葡聚糖酶突变体为e36r时，其氨基酸序列如seqidno.1所示；当葡聚糖酶突变体为d127k时，其氨基酸序列如seqidno.2所示；当葡聚糖酶突变体为e36r/d127k时，其氨基酸序列如seqidno.3所示。

seqidno.1:

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seqidno.2:

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seqidno.3:

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编码葡聚糖酶突变体e36r的核苷酸序列如seqidno.5；编码葡聚糖酶突变体d127k的核苷酸序列如seqidno.6；编码葡聚糖酶突变体e36r/d127k的核苷酸序列如seqidno.7所示。

seqidno.5：

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seqidno.6：

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seqidno.7：

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一种重组载体，含有上述编码gh16家族耐热葡聚糖酶突变体的核苷酸序列的载体；

当所含序列为seqidno.5时，重组载体为ppic9r-e36r；

当所含序列为seqidno.6时，重组载体为ppic9r-d127k；

当所含序列为seqidno.7时，重组载体为ppic9r-e36r/d127k。

一种重组菌株，表达上述重组载体的菌株；

当重组载体为ppic9r-e36r时，重组菌株为gs115/e36r；

当重组载体为ppic9r-d127k时，重组菌株为gs115/d127k；

当重组载体为ppic9r-e36r/d127k时，重组菌株为gs115/e36r/d127k。

上述gh16家族耐热葡聚糖酶突变体的构建方法，包括以下步骤：

1)采用over-lappcr的方法扩增高温葡聚糖酶突变体的序列片段；

2)将葡聚糖酶突变体序列片段克隆到表达载体ppic9r的ecori和noti限制性酶切位点之间，得重组载体；

3)将突变体重组载体转化毕赤酵母gs115，诱导表达，获得突变菌株；

4)培养重组菌株，诱导重组葡聚糖酶表达；

5)回收并纯化所表达的耐热葡聚糖酶突变体。

本发明提供的葡聚糖酶突变体热稳定性优良，突变体e36r、d127k和e36r/d127k的最适温度较野生型分别提高5℃、10℃和5℃；65℃下的半衰期(t1/2)较野生型分别延长5.7倍、1.5倍和1.1；tm值较野生型分别提高9.6℃、7.1℃和3.3℃。在催化效率方面较野生型分别提高55％、31％和1.2％；酶促反应最适ph均往碱性环境偏移0.5个单位。

上述gh16家族耐热葡聚糖酶突变体在降解半纤维素上的应用。

有益效果：

与现有技术相比，本发明一种gh16家族耐热葡聚糖酶突变体及其制备方法与应用，具有如下优势：

本发明提供一种性质优良的、适合于在半纤维素降解中应用的葡聚糖酶突变体，该葡聚糖酶突变体最适温度较野生型提高5-10℃；65℃下的半衰期(t1/2)较野生型延长1.1-5.7倍；tm值较野生型提高3.3-9.6℃。热稳定性提高的同时催化效率不但没有损失，反而有1.2％-55％的提高。

相对于盲目筛菌或人工(自然)诱变等手段，酶分子改良缩短了酶学性质改造时间，这样一种在酸性ph环境和中低温范围内保持稳定，并具有高酶活的葡聚糖酶突变体经过麸皮降解实验显示，其对麸皮的水解效果显著，符合多种工业需要，可应用于半纤维素降解产还原糖具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为耐热葡聚糖酶突变体与野生型的最适ph要求情况；

图2为耐热葡聚糖酶突变体与野生型的ph稳定性情况；

图3为耐热葡聚糖酶突变体与野生型的最适温度要求情况；

图4为耐热葡聚糖酶突变体与野生型在65℃下的热稳定性；

图5为耐热葡聚糖酶突变体与野生型在70℃下的热稳定性。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。

1、菌株及载体：表达宿主pichiapastorisgs115，表达质粒载体ppic9r从invitrogen公司购买；

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自fermentas公司，连接酶购自promaga公司，大麦葡聚糖购自sigma公司；其它都为国产分析纯试剂(均从国药集团购买)；

3、培养基：

(1)lb培养基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％nacl，ph7.0；

(2)ypd培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；

(3)md固体培养基：2％葡萄糖，1.5％琼脂糖，1.34％ynb，0.00004％biotin；

(4)mm固体培养基：1.5％琼脂糖，1.34％ynb，0.00004％biotin，0.5％甲醇；

(5)bmgy培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％甘油(v/v)，1.34％ynb，0.00004％biotin；

(6)bmmy培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％ynb，0.00004％

biotin，0.5％甲醇(v/v)

实施例1耐热葡聚糖酶突变体编码基因的克隆

以来源于bisporasp.mey-1的gh16家族bisglu16_δc为母本，采用over-lappcr的方法分别扩增耐热葡聚糖酶突变体编码基因seqidno.5(e36r，1188bp)，seqidno.6(d127k，1188bp)和seqidno.7(e36r/d127k，1188bp)，突变方法以及克隆方法参考文献(you，etal.,2018)。

所用引物序列如表1所示：

表1引物合成清单

实施例2耐热葡聚糖酶突变体的制备

对表达载体ppic9r进行双酶切(ecori noti)，同时将编码耐热葡聚糖酶突变体的基因双酶切(ecori noti)，切好的编码成熟耐热葡聚糖酶突变体的基因片段(去除信号肽片段)与表达载体ppic9r连接，获得含有耐热葡聚糖酶突变体基因的重组质粒，并转化毕赤酵母gs115，获得重组酵母菌株gs115/e36r、gs115/d127k和gs115/e36r/d127k。

取三种含有重组质粒的gs115菌株，分别接种于300mlbmgy培养基的1l三角瓶中，置于30℃，220rpm摇床培养48h；后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用100ml含有0.5％甲醇的bmmy培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5ml甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％，同时取上清用于酶活性检测。

重组耐热葡聚糖酶突变体最适ph均为4.0，热稳定性大幅度提高且催化效率比野生型提高1.2％-55％。重组葡聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。所表达的葡聚糖酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的98％以上。

实施例3重组耐热葡聚糖酶突变体和野生型的活性分析

一、dns法：具体方法如下：在ph3.5、55℃条件下，1ml的反应体系包括100μl稀释酶液，900μl底物，反应10min，加入1.5mldns终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定od值。1个酶活单位(u)定义为在给定的条件下，每分钟分解葡聚糖生成1μmol还原糖所需的酶量。

二、重组耐热葡聚糖酶突变体和野生型的性质测定

1、重组耐热葡聚糖酶突变体和野生型的最适ph测定方法如下:

将实施例2纯化的重组耐热葡聚糖酶突变体和野生型在不同的ph下进行酶促反应以测定其最适ph。底物葡聚糖用不同ph的0.1mol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中55℃下进行葡聚糖酶活力测定。结果如图1表明，重组耐热葡聚糖酶突变体较野生型的最适反应ph向碱性环境偏移0.5个单位均为ph4.0。

2、重组耐热葡聚糖酶突变体和野生型的最适温度测定方法如下：

重组耐热葡聚糖酶突变体和野生型的最适温度的测定为在0.1mol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(ph4.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果如图2表明,重组耐热葡聚糖酶突变体较野生型(55℃)的最适温度有5-10℃的提高，且突变体在高温下的相对酶活较野生酶明显提高。

3、重组耐热葡聚糖酶突变体和野生型在65℃和70℃的热稳定性测定如下：

检测方法参考文献(you，etal.,2019)，所有突变型的热稳定性均优于野生型，65℃下处理30min后，三个突变体的剩余酶活分别是野生型的4.2倍、3.1倍和2.6倍(如图4)；70℃下处理10min后，三个突变体的剩余酶活分别是野生型的28.5倍、25倍和21倍(如图5)，详细数据见表1。

表1耐热葡聚糖酶突变体与野生型的热稳定性参数比较表

4、重组耐热葡聚糖酶突变体和野生型的动力学参数测定方法如下:

检测方法参照文献(you，etal.,2019)，测定反应的一级反应时间。确定测定km及vmax的反应时间为5min。用不同浓度的葡聚糖(1.25，1.0，0.8，0.4，0.2，0.15和0.1％)为底物，在最适条件(温度、ph)下测定酶活性，计算出相应的反应速度，利用grafit7软件计算km值及vmax。

以葡聚糖为底物时，重组耐热葡聚糖酶突变体野生型和突变体在最适条件下的km值分别为5.4mg/ml、4.5mg/ml、4.6mg/ml和3.8mg/ml、催化效率(kcat/km)分别为21000ml/s·mg、32600ml/s·mg、27600ml/s·mg和23500ml/s·mg(表2)。

表2耐热葡聚糖酶突变体与野生型的比活及动力学参数比较表

该类突变体是对葡聚糖酶酶野生型的氨基酸进行点突变后得到酸性的葡聚糖酶突变体，该类突变体能够耐受65℃以上的高温处理，在酸性及中性ph下均具有非常高的半纤维素酶活力，尤其是在饲料、啤酒酿造以及食品等工业领域中具有很好的应用潜力。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110>江苏科技大学

<120>一种gh16家族耐热葡聚糖酶突变体及其构建方法与应用

<141>2020-12-09

<160>13

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>322

<212>prt

<213>氨基酸序列(aminoacidsequence)

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