本发明涉及蛋白质制备技术领域，尤其涉及蛋白质表达和纯化技术。
背景技术：
新型冠状病毒(sars-cov-2)感染引起的肺炎(covid-19)已发展为全球性的大流行病，且目前尚无特效的抗病毒药物和疫苗用于covid-19的治疗。
sars冠状病毒进入细胞后，核衣壳与病毒自身的正义链rna释放到细胞质中，遗传物质rna(开放阅读框orf1a和orf1b)首先被翻译表达出两个大的复制酶多聚蛋白(pp1a和pp1ab)。木瓜样蛋白酶(papain-likeprotease，plpro)参与病毒多聚蛋白n端部分的切割加工，介导病毒复制酶复合体的形成，在病毒基因组的复制和结构基因的转录和翻译中起到重要作用。sars冠状病毒plpro结构与功能研究是近几年冠状病毒分子生物学研究的热点之一。
在众多细胞因子中，干扰素(interferon，ifn)家族是公认的天然免疫反应的主要成员。泛素样分子干扰素刺激基因因子15(isg15)是干扰素与其受体结合，经过jak-stat信号转导途径而激活的1种干扰素诱导基因表达产物，其可以直接与病毒蛋白质相互作用，使其失去活性而起到抗病毒作用，并且在抗病毒天然免疫中具有重要调节作用。研究发现，plpro是也一种去泛素化酶，会破坏调节先天免疫反应的关键因子---泛素化和泛素样分子(isg15)，同时对干扰素分子有明显的抑制作用，这都不利于宿主抗病毒的天然免疫反应以及病毒的治疗。因此，plpro可作为抗sars冠状病毒药物设计的重要靶标。
由于sars-cov-2与sars冠状病毒具有高度同源性，其orf1ab中也有plpro蛋白序列，推测其也具有类似功能。若能获得大量纯度高、稳定性好的靶标蛋白酶，为plpro结构与功能研究及对泛素样分子作用机制提供研究基础，揭示其中作用机理，将为阐明sars-cov-2致病机理和开发抗病毒药物提供理论依据。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供新型冠状病毒sars-cov-2木瓜样蛋白酶表达和纯化方法，以解决现有技术中未能大量获得sars-cov-2木瓜样蛋白酶，缺少对该蛋白研究基础的问题。
为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
一种新型冠状病毒sars-cov-2木瓜样蛋白酶表达和纯化方法，
包括如下步骤：
(1)构建sars-cov-2木瓜样蛋白酶表达质粒；
(2)将sars-cov-2木瓜样蛋白酶表达质粒转化；
(3)诱导培养表达sars-cov-2木瓜样蛋白酶，操作包括：取菌液到含有50μg/mlkan 抗生素的lb液体培养基中，在摇床上培养过夜；将全部过夜菌液加到含有50μg/mlkan 抗生素的lb液体培养基中，在摇床上培养直至od600为0.6-0.8之间；加入iptg，18℃，200rpm，诱导培养16～18h；
(4)纯化sars-cov-2木瓜样蛋白酶，操作包括：过夜诱导后把菌液离心15min，收集沉淀物即菌体，称重为3～5g，以重悬缓冲液：菌重＝10ml:1g的比例重悬在含有100mmtrishclph7.5，300mmnacl，2mmdtt，10mmimidazole的重悬缓冲液中；高压破碎后离心，取上清，弃掉沉淀；选用镍柱进行蛋白纯化，镍柱使用前用50倍柱体积含有100mmtrishclph7.5，300mmnacl，10mmimidazole的平衡缓冲液对柱子进行平衡；再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用10倍柱体积含0mm、50mm、300mm的咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液；将含有plpro的洗脱液用阴离子交换柱进行进一步的纯化，阴离子交换柱的型号为：gehealthcarehitraptmqhp，阴离子交换柱的buffer为：100mmtrishclph7.0。
进一步地，所述步骤(3)的详细过程是：
取100μl菌液到100ml含有50μg/mlkan 抗生素的lb液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养过夜；将全部过夜菌液加到1000ml含有50μg/mlkan 抗生素的lb液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养直至od600为0.6-0.8之间。加入iptg，使终浓度为0.5mm，18℃，200rpm，诱导培养16～18h。
进一步地，所述步骤(4)的详细过程是：
过夜诱导后以6000rpm的转速把菌液离心15min，收集沉淀物即菌体，称重为3～5g，以重悬缓冲液：菌重＝10ml:1g的比例重悬在含有100mmtrishclph7.5，300mmnacl，2mmdtt，10mmimidazole的重悬缓冲液中；高压破碎后以11000rpm的转速离心35min，取上清，弃掉沉淀；选用镍柱(1～2ml)进行蛋白纯化，镍柱使用前用50倍柱体积含有100mmtrishclph7.5，300mmnacl，10mmimidazole的平衡缓冲液对柱子进行平衡；再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用10倍柱体积含0mm、50mm、300mm的咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液；将含有plpro含300mm咪唑的洗脱液用阴离子交换柱进行进一步的纯化，阴离子交换柱的型号为：gehealthcarehitraptmqhp，阴离子交换柱的buffer为：100mmtrishclph7.0，纯化的产物储存备用。
进一步地，所述步骤(1)是：将编码sars-cov-2木瓜样蛋白酶的基因克隆到pet-28a载体中，以构建表达质粒，制得plpro质粒冻干粉。
进一步地，所述步骤(2)的详细过程是：将5μgplpro质粒冻干粉在12000rpm离心5min,使粉末聚集在底部，加入30μl去离子水，振荡溶解，12000rpm离心10min。将上清液取2μl转化到escherichiacolibl21rosetta(de3)感受态菌株中,冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，加入500μl的lb液体培养基，37℃摇床，150rpm，培养1h，取30μl培养液涂布到含有50μg/mlkan 抗生素lb固体培养板上，在温度为37℃的培养箱中培养过夜；挑选出单一菌落，加入到含有50μg/mlkan 抗生素的液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养8小时。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
杆状病毒蛋白表达系统表达蛋白所需培养基昂贵，并且伴有复杂的生长条件和长时间的生长周期。与杆状病毒蛋白表达系统相比，本发明利用大肠杆菌蛋白表达系统获得大量plpro，并且周期短，耗费成本低，转化操作简单，可重复性高，可投入大量生产过程。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1是镍柱纯化蛋白后sds-page试验结果图；
图2是阴离子交换柱进一步纯化蛋白后sds-page试验结果图。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
1、plpro表达质粒的构建
将编码新冠病毒plpro的基因克隆到pet-28a载体中，以构建表达质粒，此项工作委托上海捷瑞生物工程有限公司完成，plpro大小为35kda，编码新冠病毒plpro的基因序列如seqidno.1所示。
seqidno.1：
ggatcc
ggatccagcctgcgcgaagttcgtaccattaaagtgtttaccaccgtggataatattaatctgcatacccaggtggttgatatgtcaatgacctatggccagcagtttggcccgacctatctggatggtgcagatgtgaccaaaattaaaccgcataattctcatgaaggtaaaaccttttatgtgctgccgaatgatgataccctgcgcgtggaagcatttgaatattatcataccaccgatccgagctttctgggtcgctatatgagtgcactgaatcataccaaaaaatggaaatatccgcaggttaatggtctgacctcaattaaatgggcagataataattgttatctggcaaccgcactgctgaccctgcaacagattgaactgaaatttaatccgccggcacttcaagatgcatattatcgcgcacgcgcaggcgaagcagcaaatttttgtgcactgattctggcatattgtaataaaaccgttggcgaactgggtgatgttcgcgaaaccatgagctatctgtttcaacacgcaaatctggatagttgtaagcgagtgctgaatgttgtgtgtaaaacctgtggccagcagcagaccaccctgaaaggcgtggaagcagtgatgtatatgggcacgctgtcttatgaacagtttaaaaaaggcgttcagattccgtgtacctgtggcaaacaggcaaccaaatatctggttcagcaggaaagtccgtttgttatgatgagcgcaccgccggcacagtatgaactgaaacatggaacatttacctgtgcaagcgaatatactgggaattatcagtgtggtcattataaacatattacctctaaagaaaccctgtattgtattgatggcgcactgctgaccaaatctagcgaatataaaggcccgattaccgatgtgttttataaagaaaatagctataccaccaccattaagcctgtgtaactcgagtaactcgag(下划线标示为酶切位点)
先构建好重组质粒，再将重组质粒转化到dh5α感受态细胞中，涂板于含有50μg/ml抗生素kan 的lb平板上培养，挑选菌落，质粒抽提并经酶切鉴定筛选阳性单克隆。验证成功后，构建表达质粒，并制得plpro质粒冻干粉。
2、plpro质粒的转化
将5μgplpro质粒冻干粉在12000rpm离心5min,使粉末聚集在底部，加入30μl去离子水，振荡溶解，12000rpm离心10min。将上清液取2μl转化到escherichiacolibl21rosetta(de3)感受态菌株中，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，加入500μl的lb液体培养基，37℃摇床，150rpm，培养1h，取30μl培养液涂布到含有50μg/mlkan 抗生素lb固体培养板上，在温度为37℃的培养箱中培养过夜；挑选出单一菌落，加入到含有50μg/mlkan 抗生素的液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养8小时。
3、plpro的诱导表达
取100μl菌液到100ml含有50μg/mlkan 抗生素的lb液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养过夜；将全部过夜菌液加到1000ml含有50μg/mlkan 抗生素的lb液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养直至od600为0.6-0.8之间。加入iptg，使终浓度为0.5mm，18℃，200rpm，诱导培养16～18h。
4、plpro的纯化
过夜诱导后以6000rpm的转速把菌液离心15min，收集沉淀物即菌体，称重为3～5g，以重悬缓冲液：菌重＝10ml:1g的比例重悬在含有100mmtrishclph7.5，300mmnacl，2mmdtt，10mmimidazole的重悬缓冲液中。高压破碎后以11000rpm的转速离心35min，取上清，弃掉沉淀。选用镍柱(1～2ml)进行蛋白纯化实验，经过数次实验，对蛋白纯化条件进行优化。镍柱使用前用50倍柱体积含有100mmtrishclph7.5，300mmnacl，10mmimidazole的平衡缓冲液对柱子进行平衡。再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用10倍柱体积含0mm、50mm、300mm的咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液。将含有plpro含300mm咪唑的洗脱液，进行sds-page试验，结果如图1所示。在此说明一下，洗脱液就是以平衡柱子所用的平衡缓冲液加入相应浓度的咪唑而得到的。将含有plpro的含300mm咪唑的洗脱液用阴离子交换柱进行进一步的纯化，阴离子交换柱的型号为：gehealthcarehitraptmqhp，阴离子交换柱的buffer为：100mmtrishclph7.0。收集洗出的蛋白，进行sds-page试验，结果如图2所示。
通过使用阴离子纯化柱，获得高纯度的plpro产物。离子交换根据带电荷的蛋白和层析填料上相反电荷之间的可逆相互作用进行分离蛋白。阴离子交换柱中交换剂的电荷基团带正电。plpro的等电点pi是8.1，在100mmtrishclph7.0buffer条件下，pl蛋白带正电。装柱平衡后，样品流穿阴离子交换柱，样品中负电基团(杂蛋白)可以与平衡离子结合进行可逆的置换，而结合到离子交换剂上；而正电基团(plpro)则不能与离子交换柱结合，随着buffer流出而被收集，进而得到高纯度plpro溶液。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
序列表
<110>深圳晶蛋生物医药科技有限公司
江西晶美瑞生物医药有限公司
<120>一种新型冠状病毒sars-cov-2木瓜样蛋白酶表达和纯化方法
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>990
<212>dna
<213>新型冠状病毒(sars-cov-2)(homosapiens)
<400>1
ggatccggatccagcctgcgcgaagttcgtaccattaaagtgtttaccaccgtggataat60
attaatctgcatacccaggtggttgatatgtcaatgacctatggccagcagtttggcccg120
acctatctggatggtgcagatgtgaccaaaattaaaccgcataattctcatgaaggtaaa180
accttttatgtgctgccgaatgatgataccctgcgcgtggaagcatttgaatattatcat240
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aaacatattacctctaaagaaaccctgtattgtattgatggcgcactgctgaccaaatct900
agcgaatataaaggcccgattaccgatgtgttttataaagaaaatagctataccaccacc960
attaagcctgtgtaactcgagtaactcgag990
1.一种新型冠状病毒sars-cov-2木瓜样蛋白酶表达和纯化方法，其特征在于：
包括如下步骤：
(1)构建sars-cov-2木瓜样蛋白酶表达质粒；
(2)将sars-cov-2木瓜样蛋白酶表达质粒转化；
(3)诱导培养表达sars-cov-2木瓜样蛋白酶，操作包括：取菌液到含有50μg/mlkan 抗生素的lb液体培养基中，在摇床上培养过夜；将全部过夜菌液加到含有50μg/mlkan 抗生素的lb液体培养基中，在摇床上培养直至od600为0.6-0.8之间；加入iptg，18℃，200rpm，诱导培养16～18h；
(4)纯化sars-cov-2木瓜样蛋白酶，操作包括：过夜诱导后把菌液离心15min，收集沉淀物即菌体，称重为3～5g，以重悬缓冲液：菌重＝10ml:1g的比例重悬在含有100mmtrishclph7.5，300mmnacl，2mmdtt，10mmimidazole的重悬缓冲液中；高压破碎后离心，取上清，弃掉沉淀；选用镍柱进行蛋白纯化，镍柱使用前用50倍柱体积含有100mmtrishclph7.5，300mmnacl，10mmimidazole的平衡缓冲液对柱子进行平衡；再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用10倍柱体积含0mm、50mm、300mm的咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液；将含有plpro的洗脱液用阴离子交换柱进行进一步的纯化，阴离子交换柱的型号为：gehealthcarehitraptmqhp，阴离子交换柱的buffer为：100mmtrishclph7.0。
2.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒sars-cov-2木瓜样蛋白酶表达和纯化方法，其特征在于：
所述步骤(3)的详细过程是：
取100μl菌液到100ml含有50μg/mlkan 抗生素的lb液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养过夜；将全部过夜菌液加到1000ml含有50μg/mlkan 抗生素的lb液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养直至od600为0.6-0.8之间。加入iptg，使终浓度为0.5mm，18℃，200rpm，诱导培养16～18h。
3.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒sars-cov-2木瓜样蛋白酶表达和纯化方法，其特征在于：
所述步骤(4)的详细过程是：
过夜诱导后以6000rpm的转速把菌液离心15min，收集沉淀物即菌体，称重为3～5g，以重悬缓冲液：菌重＝10ml:1g的比例重悬在含有100mmtrishclph7.5，300mmnacl，2mmdtt，10mmimidazole的重悬缓冲液中；高压破碎后以11000rpm的转速离心35min，取上清，弃掉沉淀；选用镍柱(1～2ml)进行蛋白纯化，镍柱使用前用50倍柱体积含有100mmtrishclph7.5，300mmnacl，10mmimidazole的平衡缓冲液对柱子进行平衡；再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用10倍柱体积含0mm、50mm、300mm的咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液；将含有plpro含300mm咪唑的洗脱液用阴离子交换柱进行进一步的纯化，阴离子交换柱的型号为：gehealthcarehitraptmqhp，阴离子交换柱的buffer为：100mmtrishclph7.0，纯化的产物储存备用。
4.根据权利要求1-3任一所述的一种新型冠状病毒sars-cov-2木瓜样蛋白酶表达和纯化方法，其特征在于：
所述步骤(1)是：将编码sars-cov-2木瓜样蛋白酶的基因克隆到pet-28a载体中，以构建表达质粒，制得plpro质粒冻干粉。
5.根据权利要求1-3任一所述的一种新型冠状病毒sars-cov-2木瓜样蛋白酶表达和纯化方法，其特征在于：
所述步骤(2)的详细过程是：将5μgplpro质粒冻干粉在12000rpm离心5min,使粉末聚集在底部，加入30μl去离子水，振荡溶解，12000rpm离心10min。将上清液取2μl转化到escherichiacolibl21rosetta(de3)感受态菌株中,冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，加入500μl的lb液体培养基，37℃摇床，150rpm，培养1h，取30μl培养液涂布到含有50μg/mlkan 抗生素lb固体培养板上，在温度为37℃的培养箱中培养过夜；挑选出单一菌落，加入到含有50μg/mlkan 抗生素的液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养8小时。
技术总结