本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及一种天冬氨酸酶突变体及其编码基因、载体、重组菌与应用。
背景技术：
天冬氨酸酶(aspartase)，也叫天冬氨酸氨裂解酶。它主要催化延胡索酸(富马酸)向天冬氨酸这一可逆反应。天冬氨酸酶催化天冬氨酸脱氨形成延胡索酸和氨，是微生物氮源代谢调控的关键步骤。目前研究最多以及最广的是来自大肠杆菌的天冬氨酸酶aspa以及来自bacillussp.ym55-1的天冬氨酸酶aspb。研究表明aspb是一种由三个结构域组成的亚单位的同源四聚体，与被二价金属阳离子和l-天冬氨酸激活的大肠杆菌天冬氨酸酶aspa相比，它没有变构作用，但活性是大肠杆菌酶的四倍。天门冬氨酸酶与富马酸酶c、精氨酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、d-晶体蛋白和3-羧基-顺式、顺式粘酸乳糖化酶具有序列同源性，这些酶被归类为天冬氨酸酶富马酸酶超家族。许多研究涉及定点突变、化学修饰和基于机理的失活，以确定天冬氨酸酶的重要催化残基。v.puthanveetil等的研究描述了bsasp的晶体结构，并在bsasp、ecasp和ecfum的结构比较的基础上，研究了天冬氨酸酶和富马酸酶家族中底物识别、催化反应、热稳定性和变构激活机制。已有研究表明天冬氨酸酶aspb的318位丝氨酸是天冬氨酸脱氨形成延胡索酸的关键催化位点。由于底物与酶结合后，ss-loop环闭合，使得318位丝氨酸靠近天冬氨酸c3质子，由于ser的羟基被周围氨基酸脱质子化，就会在天冬氨酸c3位实现质子提取。这一过程使天冬氨酸脱质子重排形成一种更稳定的中间体形式，这更有利于分子进一步重排而脱氨形成延胡索酸。v.puthanveetil等将318位ser突变成ala，发现酶完全失活，更是验证这一观点
工业上有很多通过天冬氨酸酶转化富马酸和氨形成天冬氨酸，以及将天冬氨酸酶与天冬氨酸脱羧酶共表达来生产唯一天然存在的β型氨基酸，β-丙氨酸。但由于天冬氨酸酶催化的是可逆反应，使得整个过程仍然存在富马酸转化率不够高的问题。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明首次将来自bacillussp.ym55-1编码天冬氨酸酶的基因的318位ser突变成thr，并在大肠杆菌中进行过表达。结果发现突变酶催化天冬氨酸脱氨反应效率极大降低，以及催化富马酸胺化形成天冬氨酸的效率与野生型相差不大。
本发明的第一个目的是提供一种天冬氨酸酶突变体，所述的天冬氨酸酶突变体是将氨基酸序列如seqidno.1所示的亲本序列的318位丝氨酸突变成苏氨酸。
本发明的第二个目的是提供一种所述的天冬氨酸酶突变体的编码基因。
进一步地，所述的编码基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。
本发明的第三个目的是提供一种携带所述的编码基因的表达载体。
进一步地，所述的载体为细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺乳动物细胞病毒。
本发明的第四个目的是提供一种表达所述的天冬氨酸酶突变体的重组菌。
进一步地，所述的重组菌是是以细菌、真菌、植物、昆虫或动物细胞为宿主细胞。
本发明的第五个目的是提供所述的天冬氨酸酶在催化生产天冬氨酸或β-丙氨酸中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种包含所述的天冬氨酸酶的酶制剂。
进一步地，所述的酶制剂为固态酶制剂或液态酶制剂。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明通过对来自bacillussp.ym55-1的天冬氨酸酶进行突变，将318位ser突变成thr，能够使天冬氨酸脱氨反应效率极大降低，也使富马酸胺化反应变化不大，这可能解决工业上富马酸转化率低的问题。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
图1为aspb在bl21(de3)中的表达
泳道说明：m泳道为蛋白质分子量标准marker；1-2号泳道为bl21(de3)pet-28a；3-4号泳道为bl21(de3)pet-aspb；
图2为突变酶酶活。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
在本发明中，出发菌bl21(de3)是野生型大肠杆菌
底物与产物的定性与定量分析以及菌体生长情况的监测：菌液浓度测定：吸取样品菌液，用蒸馏水稀释一定倍数，以蒸馏水作为空白对照，采用分光光度计于1cm光程测定od600nm。延胡索酸在280nm处有吸光值，采用酶标仪测定吸光值，并参照标准曲线来测定其含量。天冬氨酸含量可以通过高效液相色谱仪测定。粗酶液根据pet-28a上的his标签，经亲和层析柱纯化。
实施例1：表达质粒pet-aspb的构建
来源于bacillussp.ym55-1天冬氨酸酶aspb由苏州金唯智生物科技有限公司合成,并对序列进行密码子优化,将其通过限制性酶切位点bamhi和sali连接在pet-28a质粒上。
实施例2：将质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)进行表达
重组表达质粒pet-aspb化转至bl21(de3)，37℃培养条件下经lb kan固体培养基培养筛选出重组表达菌株。将出发菌株与重组菌株接种至液体tb培养基，iptg诱导后收集菌体经超声波破碎后，将上清液和沉淀进行sds-page电泳，结果检测到一条分子量约50kda的特异性条带(图2)，与报道的目标蛋白大小一致，说明aspb可以在bl21(de3)中正确表达。
实施例3：将突变质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)，测突变后酶活和酶的动力学参数
设计引物将aspb318位氨基酸突变，如表1所示。以pec-aspb为模板通过点突变试剂盒进行突变。将获得的含有突变基因的质粒转化进入大肠杆菌bl21(de3)。将bl21pec-aspb318在lb10ml液体小瓶培养9-10h，然后取1ml转接进入tb培养基，37℃培养至od600在0.5～0.6之间，加入终浓度为0.1mmol/liptg，在16℃诱导表达24h。表达过后收集菌体，用pbs缓冲液洗涤两次，将菌体悬浮并控制在相同od600，然后用超声破碎仪破碎菌体，离心取上清获得粗酶液。
正反应酶活测定反应体系：1ml反应液里面包含了600μl0.1m磷酸缓冲液ph7.0，200μl100mmoll-1延胡索酸溶液(用氨水调至ph7.0)，200μl粗酶液，30℃反应5min。酶活测定反应体系：1ml反应液里面包含了600μl0.1m磷酸缓冲液ph7.0，200μl50mmoll-1天冬氨酸溶液(用2mol/lnaoh调至ph7.0)，200μl粗酶液，30℃反应5min。反应结束取上清读取吸光度值，测定延胡索酸含量；天冬氨酸通过高效液相色谱仪测定其产物含量。正反应酶活单位(u)定义为在上述反应条件下每分钟催化生成1nmol天冬氨酸所需的酶量；逆反应酶活单位(u)定义为在上述反应条件下每分钟催化生成1nmol富马酸所需的酶量，结果如图2所示。从图2中发现当318位氨基酸突变成thr，正向反应催化效率变化不大，逆向反应效率降低90％，然而突变成ala，酶完全失活，所以无法测得酶活。
表1pcr扩增所需引物序列
实施例4：将酶进行纯化，并测定其动力学参数
将上述突变酶表达获得的粗酶液用亲和层析柱纯化。分别配制质量浓度为1.6mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、5.0mg/ml、10.0mg/ml的天冬氨酸溶液(用2mol/lnaoh调至ph7.0)和100mmoll-1延胡索酸溶液(用氨水调至ph7.0)加入1mg纯化后的酶，100mmoll-1延胡索酸溶液(用氨水调至ph7.0)，根据lineweaver-burk双倒数法作图，可计算出以富马酸和天冬氨酸为底物时天冬氨酸酶的米氏常数(km)、最大反应速率(vmax)以及催化常数。结果发现突变318位氨基酸成thr可以有效降低天冬氨酸激酶催化天冬氨脱氨，还对富马酸胺化反应影响不大，如表2，表3所示。根据以上结果可知318位是天冬氨酸酶重要的催化位点，中间体的形成与羟基脱质子化以及在c3位进行质子提取有很大关系，所以有可能将其位点突变成其他含羟基或者可被脱质子化的氨基酸有可能对酶催化效率产生很大影响，这酶的研究以及工业生产上有很大影响。
表2天冬氨酸脱氨反应中天定氨酸酶的动力学参数
注:nd，未测定(灵敏度分析的保守估计表明,与野生型aspb相比，kcat/km减少至少106倍)
表3富马酸胺化反应中天冬氨酸酶的动力学参数
注:nd，未测定(灵敏度分析的保守估计表明,与野生型aspb相比，kcat/km减少至少106
以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>江南大学
<120>天冬氨酸酶突变体及其编码基因、载体、重组菌与应用
<160>6
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>468
<212>prt
<213>（人工序列）
<400>1
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151015
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alaglyarglys
465
<210>2
<211>1407
<212>dna
<213>（人工序列）
<400>2
atgaacaccgatgtgcgcatcgaaaaggatttcctgggcgaaaaggaaatcccaaaggat60
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gtgatcgaaggcaagtggaacgatcagttcatcgtcgatccaatccaaggcggcgccggc300
acctccatcaacatgaacgcaaacgaagtgatcgcaaaccgcgcactggaactgatgggc360
gaagaaaagggcaactactccaagatctccccaaactcccacgtgaacatgtctcagtcc420
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gtgatcaagatgggccgcacccacctgcaagatgcagtgccaatcctgctgggccaagaa600
ttcgaagcatacgcacgcgtgatcgcacgcgatatcgaacgcatcgcaaacacccgcaac660
aacctgtacgatatcaacatgggcgcaaccgcagtgggcaccggcctgaacgcagatcct720
gaatacatctccatcgtgaccgaacacctggcaaagttctccggccacccactgcgctcc780
gcacagcacctggtggatgcaactcagaacaccgattgctacaccgaagtgtcctccgca840
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ggcccacgcgccggcctgtccgaaatcgtgctgcctgcacgtcagcctggctccaccatc960
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atggaacctgtgctgttcttcaacctgattcagtccatctccatcatgaccaacgtgttc1140
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tacgtggaaaagtccatcggcatcatcaccgcaatcaacccacacgtgggctacgaaacc1260
gcagcaaagctggcacgcgaagcatacctgaccggcgaatccatccgcgaactgtgcatc1320
aagtacggcgtgctgaccgaagaacagctgaacgaaatcctgaacccatacgaaatgacc1380
caccctggcatcgccggccgcaagtaa1407
<210>3
<211>43
<212>dna
<213>（人工序列）
<400>3
ctggcacctccatcatgcctggcaaggtgaaccctgtgatgcc43
<210>4
<211>37
<212>dna
<213>（人工序列）
<400>4
catgatggaggtgccaggctgacgtgcaggcagcacg37
<210>5
<211>43
<212>dna
<213>（人工序列）
<400>5
ctggcgcatccatcatgcctggcaaggtgaaccctgtgatgcc43
<210>6
<211>37
<212>dna
<213>（人工序列）
<400>6
catgatggatgcgccaggctgacgtgcaggcagcacg37
1.一种天冬氨酸酶突变体，其特征在于，所述的天冬氨酸酶突变体是将氨基酸序列如seqidno.1所示的亲本序列的318位丝氨酸突变成苏氨酸。
2.一种权利要求1所述的天冬氨酸酶突变体的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。
4.一种携带权利要求3所述的编码基因的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述的载体为细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺乳动物细胞病毒。
6.一种表达权利要求1所述的天冬氨酸酶突变体的重组菌。
7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌是是以细菌、真菌、植物、昆虫或动物细胞为宿主细胞。
8.权利要求1所述的天冬氨酸酶在催化生产天冬氨酸或β-丙氨酸中的应用。
9.一种包含权利要求1所述的天冬氨酸酶的酶制剂。
10.根据权利要求9所述的酶制剂，其特征在于，所述的酶制剂为固态酶制剂或液态酶制剂。
技术总结