技术领域：
：本发明属于果葡糖浆生产
技术领域：
，具体涉及一种f42、f55果葡糖浆同线生产的技术工艺。
背景技术：
：：果葡糖浆是由玉米淀粉水解而制得，属淀粉糖类。淀粉糖工业符合农业产业化政策，在国家“三农”政策的影响下，在淀粉糖工业生产技术不断改进、规模不断扩大且随着果葡糖浆在食品中应用技术的不断提高，越来越多的食品企业也将会选择果葡糖浆，因而，食品工业中果葡糖浆大部分替代蔗糖将成必然。42果糖(f42)是果糖含量42-44％，ds为63％或71％(本项目中生产的以71％为例)，55果糖(f55)是果糖含量为55-57％，ds为77％；为两种不同规格的产品。现行工艺只能单独生产一种产品，更换产品时需要切换、清理系统，再生产另外一种产品，开发一种f42和f55同线生产工艺，可根据客户需求随时调节两种规格产品的生产是必然需要。技术实现要素：：为了解决上述技术问题，本发明将提供一种f42、f55果葡糖浆同线生产方法，具体如下：(1)液化：调节淀粉粉浆浓度beˊ17-25，添加耐高温淀粉酶，在ph5.0-7.0条件下进行液化，至de12-18，碘试为棕褐色；优选地，可采用二次喷射液化的方法；(2)糖化：在ph3.8-4.5，温度58-62℃下，在液化液中添加糖化酶进行糖化，至dx(果糖 葡萄糖)≥95％；进一步地，糖化时间30-40h；进一步地，糖化酶添加量为0.4-0.45kg/tds；(3)板框除渣：在62-65℃下，将糖化液经过板框过滤机，除渣糖化液中的蛋白，获得清澈糖液；(4)板框脱色：加入活性炭，对糖液进行脱色，脱色温度70-75℃；进一步地，活性炭添加量为0.8-1.1kg/tds；(5)阿玛过滤(二次脱色)：滤液中转罐加入活性炭，对糖液进行二次脱色，脱色温度65-70℃；进一步地，活性炭添加量为0.8-1.1kg/tds；(6)陶瓷膜：将脱色液经陶瓷膜过滤，去除糖液中部分大分子的蛋白和糊精，截留各种微生物；(7)f00离交：将52-56℃的糖液自下到上通过阳离子交换柱，从阳交换柱出料进入阴离子交换柱，使得出料ph4.0-6.5，电导≤20μs/cm；此步去除糖液中的阴阳离子，降低灰分，净化糖液，防止糖液中杂质对异构酶造成损害；(8)f00蒸发：通过蒸发器真空浓缩获得ds为50％的糖浆；(9)异构：闪蒸脱氧后，调节糖液的ph7.6-7.9，二氧化硫含量80-120ppm，镁离子30-80ppm，之后进入异构酶固定柱(进料流量为1-6m3/h)，在55-60℃条件下经过葡萄糖异构酶异构，获得由葡萄糖转化为含42-44％果糖的糖液f42；进一步地，所述固定柱中添加的异构酶为葡萄糖异构酶gim，氨基酸序列如seqidno：3所示；(10)f42离交/混床：将所得糖液依次经过阳离子交换柱和阴离子交换柱，再经过混床专用树脂，使得出料ph≥4.5，电导≤20μs/cm；此步除去糖中阴阳离子，降低灰分，净化糖液，防止糖液中杂质对色谱树脂造成危害，保证42果糖的成品质量；(11)f42蒸发：将经过f42离交/混床的一部分f42果糖进行蒸发浓缩，出料浓度控制在71.2％-71.4％，ph3.3-4.5，即f42成品糖浆，便于储存和运输；(12)色谱：将经过f42离交/混床的另一部分f42果糖经过色谱分离为果糖含量85％以上的糖浆ad，和残液bd(果糖含量≤10％)；(13)f55混配脱色：将糖浆ad与一部分经过f42离交/混床的f42果糖按一定比例混合成果糖含量为55％-57％的糖浆，然后在温度62-65℃下利用活性炭的多孔性和微孔性吸附糖液中的絮状析出物及色素等有机物质，获得色度<10的f55果糖；进一步地，活性炭添加量为1.0-1.5kg/tds；(14)f55脱味：将f55果糖自上而下通过脱味柱，去除糖中部分蛋白及有色有味的物质，如hmf≤40ppm，提高糖浆品质，延长储存时间。(16)f55混床：将糖液经过混床专用树脂，进料温度32-37℃，出料ph≥4.5，去除糖中阴阳离子，降低灰分，净化糖液，延长糖浆储存期限；(17)f55蒸发：对f55混床过来的糖液进行浓缩，使得出料ph3.3-4.5，浓度77.2％-77.4％，即f55成品糖浆，便于储存和运输。有益效果：(1)本发明提供一种f42、f55果葡糖浆同线生产工艺，可减少频繁的切换糖浆，提高生产效率，提高果糖的单日产量(480吨提高至520吨)；(2)采用了新型葡萄糖异构酶，酶活性的提高可以大大缩短异构时间，提高效率，降低工艺成本。附图说明：图1易错pcr电泳结果。图2pgapzαc-gim的酶切验证图。具体实施方式：为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。本发明将提供一种f42、f55果葡糖浆同线生产方法，包括以下工艺步骤：(1)液化：调节淀粉粉浆浓度beˊ17-25，添加耐高温淀粉酶，在ph5.0-7.0条件下进行液化，至de12-18，碘试为棕褐色；在本发明的一些实施例中，可以通过以下步骤实现：①调浆：调节淀粉粉浆浓度beˊ17-25；ph5.0-7.0；耐高温淀粉酶：0.08-0.11kg/tds(根据液化de值进行适当的调节，本发明实施例所使用的耐高温淀粉酶为诺维信nws10098；②采用两次喷射的方法进行液化：一次喷射：首先预热喷射器及层流罐至100℃，然后进行喷射液化，喷射器温度控制在102-110℃，经过真空一次闪蒸冷却，系统温度降到95-98℃进入层流罐维持60-90min；二次喷射：通过二次喷射器将料液加热至120-145℃，并通过管道维持3-5min后进入真空二次闪蒸冷却，系统温度降到95-98℃进入二次层流罐维持20-30min后，经过真空三次闪蒸冷却，系统温度降到78-72℃，再经过板式换热器将温度降至58-62℃进ph罐后调节ph进入糖化罐；(2)糖化：在ph3.8-4.5，温度58-62℃下，糖化时间30-40h，确保dx(果糖 葡萄糖)≥95％；在本发明的一些实施例中，糖化酶添加量为0.4-0.45kg/tds(本发明实施例所采用的糖化酶为南京百斯杰ultra3.0)；(3)板框除渣：在62-65℃下，将糖化液经过板框过滤机，除渣糖化液中的蛋白，获得清澈糖液；(4)板框脱色：加入活性炭，对糖液进行脱色，脱色温度70-75℃(活性炭添加量为0.8-1.1kg/tds)；(5)阿玛过滤(二次脱色)：滤液中转罐加入活性炭(活性炭添加量为0.8-1.1kg/tds)，对糖液进行二次脱色，脱色温度65-70℃；(6)陶瓷膜：将脱色液经陶瓷膜过滤，去除糖液中部分大分子的蛋白和糊精，截留各种微生物；(7)f00离交：将52-56℃的糖液自下到上通过阳离子交换柱(本发明实施例采用的阳树脂型号:争光d001fd)从阳交换柱出料进入阴离子交换柱(本发明实施例采用的阴树脂型号：d354fd)去除糖液中的阴阳离子，降低灰分，净化糖液，防止糖液中杂质对异构酶造成损害，出料ph4.0-6.5，电导≤20μs/cm；(8)f00蒸发：通过五效蒸发器真空浓缩(五效：真空度50-150mbar，温度35-45℃；四效：真空度100-250mbar，温度40-55℃；三效：真空度150-300mbar，温度45-60℃、二效：真空度200-350mbar，温度50-65℃，一效：真空度250-450mbar，温度60-75℃)获得ds＝50％的糖浆；(9)异构：闪蒸脱氧后，调节糖液的ph7.6-7.9，二氧化硫含量80-120ppm，镁离子30-80ppm，之后进入异构酶固定柱(进料流量为1-6m3/h)，在55-60℃条件下经过葡萄糖异构酶异构获使葡萄糖转化为含42％-44％果糖的糖液f42；在本发明的一些实施例中，所述固定柱中添加的异构酶为葡萄糖异构酶gim，氨基酸序列如seqidno：3所示；(10)f42离交/混床：将所得糖液依次经过阳离子交换柱(本发明实施例使用漂莱特阳树脂：ppc150s)和阴离交交换柱(本发明实施例使用漂莱特阴树脂：ppa103s)，再经过混床专用树脂(本发明实施例使用争光混床阳：d001mb，混床阴树脂：d202mb)，除去糖中阴阳离子，降低灰分，净化糖液，防止糖液中杂质对色谱树脂造成危害和保证42果糖的成品质量，出料ph≥4.5，电导≤20μs/cm；(11)f42蒸发：将经过f42离交/混床的一部分f42果糖进行浓缩，出料浓度控制在71.2％-71.4％，ph3.3-4.5，即f42成品糖浆，目的便于储存和运输；在本发明的一些实施例中，采用五效蒸发器真空浓缩：五效：真空度50-150mbar，温度35-45℃；四效：真空度100-250mbar，温度40-55℃；三效：真空度150-300mbar，温度50-60℃；二效：真空度200-350mbar，温度55-65℃，一效：真空度250-450mbar，温度60-75℃；(12)色谱：将经过f42离交/混床的另一部分f42果糖经过色谱分离为果糖含量85％以上的糖浆ad，和残液bd(果糖含量≤10％)；在本发明的一些实施例中，采用美国陶氏：99ca/310色谱分离树脂，58～65℃下进行分离；(13)f55混配脱色：将糖浆ad与经过f42离交/混床的一部分f42果糖按一定比例混合成果糖含量为55-57％的糖浆，然后在温度62-65℃下利用活性炭(活性炭添加量为1.0-1.5kg/tds)的多孔性和微孔性吸附糖液中的絮状析出物及色素等有机物质，获得色度10的f55果糖；(14)f55脱味：自上而下通过脱味柱去除糖中部分蛋白及有色有味的物质，如hmf≤40ppm，提高糖浆品质，延长储存时间；(15)f55混床：降糖液经过混床专用树脂，进料温度32-37℃，出料ph≥4.5，去除糖中阴阳离子，降低灰分，净化糖液，延长糖浆储存期限；(16)f55蒸发：对f55混床过来的糖液进行浓缩，出料ph3.3-4.5，浓度77.2％-77.4％，即f55成品糖浆，目的便于储存和运输；在本发明的一些实施例中，采用无效真空蒸发：五效：真空度50-150mbar，温度40-55℃；四效：真空度100-250mbar，温度50-60℃；三效：真空度150-300mbar，温度55-70℃；二效：真空度200-350mbar，温度60-75℃，一效：真空度250-450mbar，温度65-85℃。以下将通过具体实施方式对本发明做进一步的解释说明。实施例1一种葡萄糖异构酶(glucoseisomerase，gi)突变体本发明提供一种葡萄糖异构酶(glucoseisomerase，gi)突变体及其基因，本发明使用易错pcr技术，对来自锈棕色链霉菌(streptomycesrubiginosus)的葡萄糖异构酶编码基因(简称gi)进行随机突变，得到葡萄糖异构酶突变体基因(简称gim)，突变体的酶活较原始基因提高57％，将其在毕赤酵母中进行表达，得到高活力的葡萄糖异构酶。在本发明中采用如下定义：(1)氨基酸和dna核酸序列的命名法使用氨基酸残基的公认iupac命名法，用三字母代码形式。dna核酸序列采用公认iupac命名法。(2)葡萄糖异构酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示葡萄糖异构酶突变体中突变的氨基酸。如met88lys，表示位置88的氨基酸由原始葡萄糖异构酶的met替换成lys，位置的编号对应于seqidno：1中野生型葡萄糖异构酶的氨基酸序列编号。在本发明中，gi表示原始葡萄糖异构酶(氨基酸序列如seqidno：1所示)，gim表示突变后的葡萄糖异构酶(氨基酸序列如seqidno：3所示)；gi表示原始葡萄糖异构酶的编码基因(如seqidno：2所示)，gim表示突变后葡萄糖异构酶的编码基因(如seqidno：4所示)。用于表达所述的葡萄糖异构酶突变体的宿主细胞为毕赤酵母smd1168，表达载体为pgapzαc。1、野生型葡萄糖异构酶dna的获得使用ncbi数据库，查询锈棕色链霉菌野生型葡萄糖异构酶氨基酸序列(seqidno.1)，面向大肠杆菌(e.coli)进行密码子优化获得dna序列(seqidno.2)。全基因合成seqidno.2，连接在puc57载体，转入e.colidh5α中并制备成甘油菌，-80℃长期保存。取1支甘油菌，接种到含5mlamp抗性lb培养基的试管中，37℃过夜培养，使用roche公司的highpureplasmidisolationkit进行质粒小提，获得野生型葡萄糖异构酶dna片段，作为后续随机突变的模板。2、葡萄糖异构酶突变体基因的获得(1)随机突变使用takara公司的takarataqpcr扩增酶，基于易错pcr技术进行随机突变，获得高活力葡萄糖异构酶基因；设计引物如下：上游p1(seqidno.5)：5’-taagaaggagatataccatggatgaactaccagccgaccccgga-3’下游p2(seqidno.6)：5’-gtggtggtggtggtgctcgagttagccacgtgcgcccagca-3’其扩增的反应体系为：10×pcrbuffer5μldntps(2.5mmol/leach)5μl上游引物p1(10μmol/l)1.5μl下游引物p2(10μmol/l)1.5μl25mmol/lmgcl211μl5mmol/lmncl25μl模板20pmoltaqdna聚合酶1μlddh2o补至50μl扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性60s；61℃退火60s，72℃延伸180s，反应30个循环；72℃保温10min；4℃保存。pcr扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，可看到约1200bp的条带(图1)。pcr扩增产物不需处理，可以立即用于载体构建，也可-20℃长期保存。(2)表达载体线性化使用takara的常规限制性内切酶对pet-28a质粒进行线性化处理，体系如下：ncoi5μlxhoi5μl10*kbuffer10μl0.1％bsa10μlpet-28a5μgddh2o补至100μl线性化条件：37℃保温3h；65℃保温20min；4℃保存。线性化产物可以立即用于载体构建，也可-20℃长期保存。(3)载体构建使用vazyme公司的clonexpressii一步连接酶将易错pcr产物与线性化的pet-28a进行连接，构建gim突变体表达载体库。为保证足够的库容，同时进行5个连接反应，共计100μl连接体系。连接体系如下：5*ceiibuffer4μlpcr产物112ng线性化载体110ngexnaseii2μlddh2o补至20μl注意：冰浴中配制上述反应体系。反应条件：37℃保温30min；4℃保温5min。反应完成后，可4℃短期保存，或-20℃长期保存。(4)gim突变体表达菌株库构建将步骤(3)的突变体表达载体连接产物(20μl/个)，按如下方式转化表达菌株e.colibl21：从-80℃中取出e.colibl21感受态细胞(100μl/支)，置于冰上溶解，溶解后立即在无菌环境下将20μl连接产物加入100μl大肠杆菌感受态细胞bl21，冰上放置30min，42℃水浴热击90s，冰上冷却1.5min，加入900μllb培养基，于37℃，200r/min预培养30min。3000rpm离心2min，弃600μl上清液，将菌体沉淀和剩余上清液通过移液器吹吸混匀，每100μl浓缩菌液涂布于含kan抗性的lb平板，每组做4个平行，37℃恒温培养箱倒置培养过夜。最终获得20块gim突变体表达菌株库涂布平板，封口膜密封后，4℃短期存放。(5)野生型表达菌株构建直接使用普通pcr扩增野生型gi基因，参照本实施例中(2)/(3)/(4)步，构建野生型表达菌株，作为酶活筛选对照样品。(6)酶活筛选样品制备准备诱导培养基：组成：tryptone12.0g，yeastextract24.0g，α-乳糖2.0g，葡萄糖0.5g，studier盐17.05g，ph7.0±0.2。称取55.55g脱水培养基粉末，用1l去离子水加热溶解；煮沸1min；115℃灭菌20min。从20块gim突变体表达菌株库涂布平板上，挑选阳性转化子。挑取至少2000个阳性转化子(包含1株野生型表达菌株)，挑取的每一个阳性转化子先接种于一块新的卡纳抗性平板，用于菌种保存，同时接种于每孔含200μllb液体培养基(含50μg/ml的kan)的96孔浅孔板中。菌种保存平板经37℃过夜培养后，使用封口膜密封，4℃保存。接种到96孔浅孔板(每块板含1个野生型表达菌株作为对照)，37℃条件下400r/min培养12h。转接50μl过夜培养的菌液至96孔深孔板(1ml自动诱导培养基/孔，kan浓度为50μg/ml)，37℃400rpm培养4h后，于25℃诱导表达20h。4℃下4000r/min离心30min后收集菌体，-80℃放置2h，室温方式1h，重复以上操作2次。每孔加入70μl溶菌缓冲液(0.5mg/ml溶菌酶、0.7u/mldnasel、50mmol/lpbs，ph7.5)重悬菌体，并转移至新的96孔浅孔板，于37℃培养箱中放置90min，使菌体充分破碎。4000rpm，4℃离心30min，小心吸取10μl上清酶液至新的96孔elisa板中，准备测量突变体比活力。3、葡萄糖异构酶初筛酶活力测定采用半胱氨酸一咔唑法，elisa平板每个样品孔中含有10μl酶液，加入0.6mold-葡萄糖25μl，0.025mol三乙醇胺-盐酸(内含10mmolmgso4·7h2o)ph8的缓冲液20μl，在35℃反应15分钟。再加入50％三氯乙酸5μl终止反应。立即加入正在冰俗中冷却的70％硫酸300μl，2.4％半胱氨酸-盐酸盐10μl、0.12％乙醇一咔唑浴液10μl，混匀后在25℃反应30分钟，酶标仪中，使用波长为560nm检测各孔吸收值a。记录吸收值a大于野生型对照孔的菌株编号，从影印保存平板中，重新接种到新的影印平板(方便集中保存)和96孔浅孔板中，重复步骤2的第(6)步进行样品制备，再次进行酶活力复测，最终剩余28株突变体菌株进行下一轮筛选。4、葡萄糖异构酶突变体比活力检测28株突变体菌株和1株野生型菌株，接种含5mlkan抗性lb培养基的试管，37℃，160rpm过夜震荡培养。按1％接种量，接种含50mlkan抗性lb培养基的250ml摇瓶，37℃200rpm震荡培养至od600达到0.6，加入iptg(终浓度1mmol/l)，16℃下诱导16h，4℃下4000r/min离心15min后收集菌体，重悬于15ml预冷的ph为7.4的pbs缓冲液中，用低温超高压连续流动细胞破碎仪破碎细胞，破碎结束后，在4℃下12000r/min离心45min，收集上清液获得粗酶液，然后进行比活力检测。使用sds-page电泳法，估算葡萄糖异构酶浓度。酶活力测定采用半胱氨酸一咔唑法，0.6mold-葡萄糖250μl加入葡萄糖异构酶100μl(相当于0.2-0.8活力单位)，0.025mol三乙醇胺-盐酸(内含10mmolmgso4·7h2o)ph8的缓冲液200μl，在35℃反应15分钟。再加入50％三氯乙酸50μl终止反应。立即加入正在冰俗中冷却的70％硫酸3ml，2.4％半胱氨酸-盐酸盐100μl、0.12％乙醇一咔唑浴液100μl，混匀后在25℃反应30分钟，分光光度计上，使用波长为560nm、光程为1cm石英杯侧其吸收值a。在标准反应混合物中，每分钟产生1μg果糖所需的酶量，定义为1个活力单位((u)，用每毫克葡萄糖异构酶中的酶活力即u/mg表示比活力。编号比活编号比活编号比活编号比活野生型100281132889831593861479140993950112174710717080473116996108179413121798488114101514218351462221417258810631301977121226151822101124012924414886215613091032711268721231507140检测结果显示突变体862的比活力最高，较野生型酶活提高56％。将该突变体使用通用引物t7/t7ter测序，测序结果表明，该突变体为具有met88lys、ala131pro、ala136gly、gly248cys的高活力葡萄糖异构酶基因gim，核苷酸序列见seqidno.4，对应的氨基酸序列见seqidno.3。5、葡萄糖异构酶突变体游离表达毕赤酵母重组菌的构建构建毕赤酵母高活力葡萄糖异构酶游离表达重组菌。将高活力葡萄糖异构酶(gim)经密码子优化并添加终止密码子和ecori/xbai酶切位点(seqidno:7)进行全基因合成与毕赤酵母分泌表达载体pgapzαc连接，构建高活力葡萄糖异构酶毕赤酵母表达载体pgapzαc–gim(酶切验证如图2)，转化毕赤酵母。(1)线性化质粒dna的制备在转化毕赤酵母之前，要先将构建好的重组表达质粒pgapzαc-gim线性化，以提高质粒在毕赤酵母染色体上的整合效率。用bsphi限制性内切酶进行线性化酶切。(2)线性化质粒pgapzαc-gim电转化毕赤酵母、阳性转化子的鉴定及葡萄糖异构酶高产菌株的筛选①将80μl毕赤酵母smd1168感受态细胞和10μg经线性化的dna加入到1.5ml预冷的离心管中，混匀，将反应液转移到预先冰浴的转化杯中；②冰浴装有转化液的转化杯5min，根据电转装置推荐的参数，进行毕赤酵母电转化：③脉冲后，立即向转化杯中加入1ml预冷的1mol/l的山梨醇溶液，把转化液转移到一个新的1.5ml离心管中；④30℃静置培养1.5h，吸取毕赤酵母smd1168电转液200μl涂布在md培养基上；⑤30℃培养直至转化子出现；⑥挑取转化子单菌落溶解在10μl去离子水中，取2μl菌液，加入lyticase破壁酶，30℃反应l0min，反应液立即放入-80℃冰箱中冷冻l0min，使酵母细胞壁裂解，释放的基因组作为模板进行pcr。以转入空质粒的毕赤酵母smd1168/pgapzαc作为对照，确定阳性转化子。⑦在确定阳性转化子的基础上，先用含不同浓度遗传霉素的抗性平板筛选高遗传霉素抗性的转化子，然后分别测定这些高遗传霉素抗性的转化子的葡萄糖异构酶的酶活，以得到葡萄糖异构酶的生产菌株smd1168/pgapzαc-pulm。6、葡萄糖异构酶突变体在毕赤酵母游离表达重组菌中的表达及制备将毕赤酵母游离表达葡萄糖异构酶突变体重组菌smd1168/ppic9k-gim接种至ypd液体培养基中，30℃、250r/min培养24h。以1％的接种量转接到新鲜bmgy培养基中，30℃、250r/min培养24h，然后6000r/min离心5min得到菌体，转入bmmy培养基中。30℃、250r/min，培养120h后可得到葡萄糖异构酶的粗酶液，然后采用分级盐析法沉淀高活力葡萄糖异构酶，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得高活力葡萄糖异构酶纯酶酶粉。大约每升培养基获得葡萄糖异构酶突变体纯酶酶粉211mg。采用同样的方法，大约每升培养基获得野生型葡萄糖异构酶纯酶酶粉180mg。在采用步骤4的酶活测定方法，测定原始(野生型)葡萄糖异构酶gi和突变后葡萄糖异构酶gim的比酶活分别为110u/mg和173.14u/mg，突变后葡萄糖异构酶的比酶活比突变前提高了57％。本发明以下实施例中将采用实施例1获得的突变后葡萄糖异构酶gim作为异构酶生产f42、f55糖浆。实施例2一种f42、f55果葡糖浆同线生产方法一种f42、f55果葡糖浆同线生产方法，包括以下工艺步骤：(1)液化：调节淀粉粉浆浓度beˊ17，添加耐高温淀粉酶0.08kg/tds，在ph6.0条件下进行液化，至de12，碘试为棕褐色；采用两次喷施的方法进行液化一次喷射：首先预热喷射器及层流罐至100℃，然后进行喷射液化，喷射器温度控制在102℃，经过真空一次闪蒸冷却，系统温度降到95℃进入层流罐维持60min；二次喷射：通过二次喷射器将料液加热至120℃，并通过管道维持3min后进入真空二次闪蒸冷却，系统温度降到95℃进入二次层流罐维持20min后，经过真空三次闪蒸冷却，系统温度降到72℃，再经过板式换热器将温度降至58℃进ph罐后调节ph进入糖化罐；(2)糖化：在ph3.8，温度58℃下，添加糖化酶0.4kg/tds，糖化30h，至dx(果糖 葡萄糖)达到95.2％；(3)板框除渣：在62℃下，将糖化液经过板框过滤机，除渣糖化液中的蛋白，获得清澈糖液；(4)板框脱色：加入活性炭，对糖液进行脱色，脱色温度70℃(活性炭添加量为0.8kg/tds)；(5)阿玛过滤(二次脱色)：滤液中转罐加入活性炭(活性炭添加量为0.8kg/tds)，对糖液进行二次脱色，脱色温度65℃；(6)陶瓷膜：将脱色液经陶瓷膜过滤，去除糖液中部分大分子的蛋白和糊精，截留各种微生物；(7)f00离交：将52℃的糖液自下到上通过阳离子交换柱(阳树脂型号:争光d001fd)从阳交换柱出料进入阴离子交换柱(阴树脂型号：d354fd)去除糖液中的阴阳离子，降低灰分，净化糖液，防止糖液中杂质对异构酶造成损害，出料ph5.0，电导≤20μs/cm；(8)f00蒸发：通过五效蒸发器真空浓缩(五效：真空度50mbar，温度35℃；四效：真空度100mbar，温度40℃；三效：真空度150mbar，温度45℃；二效：真空度200mbar，温度50℃；一效：真空度250mbar，温度60℃)获得ds＝50％的糖浆；(9)异构：闪蒸脱氧后，需调节糖液的ph7.6，二氧化硫含量80ppm，镁离子30ppm，之后进入异构酶固定柱(进料流量为6m3/h)，在55℃条件下糖液经过葡萄糖异构酶60min异构获得含42％果糖的糖液f42；(10)f42离交/混床：将所得糖液依次经过阳离子交换柱(漂莱特阳树脂：ppc150s)和阴离交交换柱(漂莱特阴树脂：ppa103s)，再进过混床专用树脂(争光混床阳：d001mb，混床阴树脂：d202mb)，除去糖中阴阳离子，降低灰分，净化糖液，防止糖液中杂质对色谱树脂造成危害和保证42果糖的成品质量，出料ph5.0，电导≤20μs/cm；(11)f42蒸发：将经过f42离交/混床的一部分f42果糖进行浓缩，获得出料浓度71.2％，ph4.0的f42成品糖浆，便于储存和运输；采用五效蒸发器真空浓缩：五效：真空度50mbar，温度35℃；四效：真空度100mbar，温度40℃；三效：真空度150mbar，温度50℃；二效：真空度200mbar，温度55℃；一效：真空度250mbar，温度60℃；(12)色谱：将经过f42离交/混床的另一部分f42果糖经过美国陶氏：99ca/310色谱分离树脂，在58℃下色谱分离为果糖含量86％的糖浆ad，和果糖含量9.5％的残液bd；(13)f55混配脱色：将糖浆ad(果糖含量86％)与经过f42离交/混床的一部分f42果糖按0.42:1的比例混合成果糖含量为55％的糖浆，然后在温度62℃下利用活性炭(活性炭添加量为1.0kg/tds)的多孔性和微孔性吸附糖液中的絮状析出物及色素等有机物质，获得色度10的f55果糖；(14)f55脱味：自上而下通过脱味柱去除f55果糖中部分蛋白及有色有味的物质，使得hmf为30ppm，提高糖浆品质，延长储存时间；(15)f55混床：降糖液经过混床专用树脂，进料温度32℃，出料ph4.6，去除糖中阴阳离子，降低灰分，净化糖液，延长糖浆储存期限；(16)f55蒸发：对f55混床过来的糖液进行浓缩，出料ph4.0，浓度77.2％％，即f55成品糖浆，目的便于储存和运输；采用五效真空蒸发：五效：真空度50mbar，温度40℃；四效：真空度100mbar，温度50℃；三效：真空度150mbar，温度55℃；二效：真空度200mbar，温度60℃；一效：真空度250mbar，温度65℃。实施例3一种f42、f55果葡糖浆同线生产方法一种f42、f55果葡糖浆同线生产方法，包括以下工艺步骤：(1)液化：调节淀粉粉浆浓度beˊ20，添加耐高温淀粉酶0.1kg/tds，在ph6.5条件下进行液化，至de15，碘试为棕褐色；采用两次喷射的方法进行液化一次喷射：首先预热喷射器及层流罐至100℃，然后进行喷射液化，喷射器温度控制在105℃，经过真空一次闪蒸冷却，系统温度降到96℃进入层流罐维持70min；二次喷射：通过二次喷射器将料液加热至130℃，并通过管道维持4min后进入真空二次闪蒸冷却，系统温度降到96℃进入二次层流罐维持25min后，经过真空三次闪蒸冷却，系统温度75℃，再经过板式换热器将温度降至60℃进ph罐后调节ph进入糖化罐；(2)糖化：在ph4.2，温度60℃下，添加糖化酶0.42kg/tds，糖化35h，确保dx(果糖 葡萄糖)达到95.5％；(3)板框除渣：在64℃下，将糖化液经过板框过滤机，除渣糖化液中的蛋白，获得清澈糖液；(4)板框脱色：加入活性炭，对糖液进行脱色，脱色温度72℃(活性炭添加量为1.0kg/tds)；(5)阿玛过滤(二次脱色)：滤液中转罐加入活性炭(活性炭添加量为1.0kg/tds)，对糖液进行二次脱色，脱色温度68℃；(6)陶瓷膜：将脱色液经陶瓷膜过滤，去除糖液中部分大分子的蛋白和糊精，截留各种微生物；(7)f00离交：将55℃的糖液自下到上通过阳离子交换柱(阳树脂型号:争光d001fd)从阳交换柱出料进入阴离子交换柱(阴树脂型号：d354fd)去除糖液中的阴阳离子，降低灰分，净化糖液，防止糖液中杂质对异构酶造成损害，出料ph5.5，电导≤20μs/cm；(8)f00蒸发：通过五效蒸发器真空浓缩(五效：真空度100mbar，温度40℃；四效：真空度150mbar，温度50℃；三效：真空度200mbar，温度55℃；二效：真空度250mbar，温度60℃；一效：真空度300mbar，温度65℃)获得ds＝50％的糖浆；(9)异构：闪蒸脱氧后，调节糖液的ph7.8，二氧化硫含量100ppm，镁离子50ppm，之后进入异构酶固定柱(进料流量为5.5m3/h)，在58℃条件下经过葡萄糖异构酶65min异构获含43％果糖的糖液f42；(10)f42离交/混床：将所得糖液依次经过阳离子交换柱(漂莱特阳树脂：ppc150s)和阴离交交换柱(漂莱特阴树脂：ppa103s)，再进过混床专用树脂(争光混床阳：d001mb，混床阴树脂：d202mb)，除去糖中阴阳离子，降低灰分，净化糖液，防止糖液中杂质对色谱树脂造成危害和保证42果糖的成品质量，出料ph4.7，电导≤20μs/cm；(11)f42蒸发：将经过f42离交/混床的一部分f42果糖进行浓缩，出料浓度控制在71.3％，ph4.2，即f42成品糖浆，目的便于储存和运输；采用五效蒸发器真空浓缩：五效：真空度100mbar，温度40℃；四效：真空度150mbar，温度50℃；三效：真空度200mbar，温度55℃；二效：真空度250mbar，温度60℃；一效：真空度300mbar，温度65℃；(12)色谱：将经过f42离交/混床的另一部分f42果糖采用美国陶氏：99ca/310色谱分离树脂，62℃下进行色谱分离为果糖含量87％的糖浆ad，和果糖含量8.6％残液bd；(13)f55混配脱色：将糖浆ad与经过f42离交/混床的一部分f42果糖按2:5的比例混合成果糖含量为56％的糖浆，然后在温度63℃下利用活性炭(活性炭添加量为1.2kg/tds)的多孔性和微孔性吸附糖液中的絮状析出物及色素等有机物质，获得色度10的f55果糖；(14)f55脱味：自上而下通过脱味柱去除糖中部分蛋白及有色有味的物质，使得hmf达到30ppm，提高糖浆品质，延长储存时间；(15)f55混床：降糖液经过混床专用树脂，进料温度35℃，出料ph5.0，去除糖中阴阳离子，降低灰分，净化糖液，延长糖浆储存期限；(16)f55蒸发：对f55混床过来的糖液进行浓缩，使得出料ph4.2，浓度77.3％，即f55成品糖浆，目的便于储存和运输；采用五效真空蒸发：五效：真空度100mbar，温度45℃；四效：真空度150mbar，温度55℃；三效：真空度200mbar，温度60℃；二效：真空度250mbar，温度65℃；一效：真空度300mbar，温度70℃。实施例4一种f42、f55果葡糖浆同线生产方法一种f42、f55果葡糖浆同线生产方法，包括以下工艺步骤：(1)液化：调节淀粉粉浆浓度beˊ25，添加耐高温淀粉酶0.11kg/tds，在ph7.0条件下进行液化，至de18，碘试为棕褐色；采用两次喷射的方法进行液化：一次喷射：首先预热喷射器及层流罐至100℃，然后进行喷射液化，喷射器温度控制在110℃，经过真空一次闪蒸冷却，系统温度降到98℃进入层流罐维持90min；二次喷射：通过二次喷射器将料液加热至145℃，并通过管道维持5min后进入真空二次闪蒸冷却，系统温度98℃进入二次层流罐维持30min后，经过真空三次闪蒸冷却，系统温度降到78℃，再经过板式换热器将温度降至62℃进ph罐后调节ph进入糖化罐；(2)糖化：在ph4.5，温度62℃下，添加糖化酶0.45kg/tds，糖化40h，至dx(果糖 葡萄糖)达到96％；(3)板框除渣：在65℃下，将糖化液经过板框过滤机，除渣糖化液中的蛋白，获得清澈糖液；(4)板框脱色：加入活性炭，对糖液进行脱色，脱色温度75℃(活性炭添加量为1.1kg/tds)；(5)阿玛过滤(二次脱色)：滤液中转罐加入活性炭(活性炭添加量为1.1kg/tds)，对糖液进行二次脱色，脱色温度70℃；(6)陶瓷膜：将脱色液经陶瓷膜过滤，去除糖液中部分大分子的蛋白和糊精，截留各种微生物；(7)f00离交：将56℃的糖液自下到上通过阳离子交换柱(阳树脂型号:争光d001fd)从阳交换柱出料进入阴离子交换柱(阴树脂型号：d354fd)去除糖液中的阴阳离子，降低灰分，净化糖液，防止糖液中杂质对异构酶造成损害，出料ph6.5，电导≤20μs/cm；(8)f00蒸发：通过五效蒸发器真空浓缩(五效：真空度150mbar，温度45℃；四效：真空度250mbar，温度55℃；三效：真空度300mbar，温度60℃；二效：真空度350mbar，温度65℃；一效：真空度450mbar，温度75℃)获得ds＝50％的糖浆；(9)异构：闪蒸脱氧后，调节糖液的ph7.9，二氧化硫含量120ppm，镁离子80ppm，之后进入异构酶固定柱(进料流量为5m3/h)，在60℃条件下经过葡萄糖异构酶75min异构获含44％果糖的糖液f42；(10)f42离交/混床：将所得糖液依次经过阳离子交换柱(漂莱特阳树脂：ppc150s)和阴离交交换柱(漂莱特阴树脂：ppa103s)，再进过混床专用树脂(争光混床阳：d001mb，混床阴树脂：d202mb)，除去糖中阴阳离子，降低灰分，净化糖液，防止糖液中杂质对色谱树脂造成危害和保证42果糖的成品质量，出料ph5.0，电导≤20μs/cm；(11)f42蒸发：将经过f42离交/混床的一部分f42果糖进行浓缩，出料浓度控制在71.4％，ph4.5，即f42成品糖浆，目的便于储存和运输；采用五效蒸发器真空浓缩：五效：真空度150mbar，温度45℃；四效：真空度250mbar，温度55℃；三效：真空度300mbar，温度60℃；二效：真空度350mbar，温度65℃；一效：真空度450mbar，温度75℃；(12)色谱：将经过f42离交混床的另一部分f42果糖采用美国陶氏：99ca/310色谱分离树脂，65℃下色谱分离为果糖含量87％的糖浆ad，和果糖含量8％的残液bd；(13)f55混配脱色：将糖浆ad与经过f42离交/混床的一部分f42果糖按1:2的比例混合成果糖含量为57％的糖浆，然后在温度65℃下利用活性炭(活性炭添加量为1.5kg/tds)的多孔性和微孔性吸附糖液中的絮状析出物及色素等有机物质，获得色度10的f55果糖；(14)f55脱味：自上而下通过脱味柱去除糖中部分蛋白及有色有味的物质，使得hmf达到30ppm，提高糖浆品质，延长储存时间；(15)f55混床：降糖液经过混床专用树脂，进料温度37℃，出料ph5.3，去除糖中阴阳离子，降低灰分，净化糖液，延长糖浆储存期限；(16)f55蒸发：对f55混床过来的糖液进行浓缩，出料ph4.5，浓度77.4％，即f55成品糖浆，目的便于储存和运输；采用五效真空蒸发：五效：真空度150mbar，温度55℃；四效：真空度250mbar，温度60℃；三效：真空度300mbar，温度70℃；二效：真空度350mbar，温度75℃；一效：真空度450mbar，温度80℃。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。sequencelisting<110>河南飞天农业开发股份有限公司<120>一种f42、f55果葡糖浆同线生产方法<130>1<160>7<170>patentinversion3.5<210>1<211>388<212>prt<213>锈棕色链霉菌（streptomycesrubiginosus）<400>1metasntyrglnprothrprogluaspargphethrpheglyleutrp151015thrvalglytrpglnglyargasppropheglyaspalathrargarg202530alaleuaspprovalgluservalglnargleualagluleuglyala354045hisglyvalthrphehisaspaspaspleuilepropheglyserser505560aspsergluargglugluhisvallysargpheargglnalaleuasp65707580aspthrglymetlysvalprometalathrthrasnleuphethrhis859095provalphelysaspglyglyphethralaasnaspargaspvalarg100105110argtyralaleuarglysthrileargasnileaspleualavalglu115120125leuglyalagluthrtyrvalalatrpglyglyarggluglyalaglu130135140serglyglyalalysaspvalargaspalaleuaspargmetlysglu145150155160alapheaspleuleuglyglutyrvalthrserglnglytyraspile165170175argphealailegluprolysproasngluproargglyaspileleu180185190leuprothrvalglyhisalaleualapheilegluargleugluarg195200205progluleutyrglyvalasnprogluvalglyhisgluglnmetala210215220glyleuasnpheprohisglyilealaglnalaleutrpalaglylys225230235240leuphehisileaspleuasnglyglnasnglyilelystyraspgln245250255aspleuargpheglyalaglyaspleuargalaalaphetrpleuval260265270aspleuleugluseralaglytyrserglyproarghispheaspphe275280285lysproproargthrgluasppheaspglyvaltrpalaseralaala290295300glycysmetargasntyrleuileleulysgluargalaalaalaphe305310315320argalaaspprogluvalglnglualaleuargalaserargleuasp325330335gluleualaargprothralaalaaspglyleuglnalaleuleuasp340345350aspargseralaphegluglupheaspvalaspalaalaalaalaarg355360365glymetalaphegluargleuaspglnleualametasphisleuleu370375380glyalaarggly385<210>2<211>1164<212>dna<213>人工序列<400>2atgaactaccagccgaccccggaagatcgctttacttttggcctgtggactgtaggttgg60cagggtcgcgacccgttcggcgatgctactcgtcgtgccctggatccggttgaatctgtg120caacgcctggcggaactgggcgcacatggtgtaactttccacgacgatgatctgatcccg180tttggctccagcgactccgagcgcgaagaacacgtgaaacgctttcgtcaggcgctggac240gatactggcatgaaagtcccgatggcgacgaccaacctgttcacgcaccctgtgttcaag300gatggtggcttcacggctaacgatcgtgacgttcgtcgctacgccctgcgtaaaaccatt360cgcaacattgacctggcggttgaactgggcgctgagacctatgttgcttggggtggtcgt420gaaggtgcagaatccggtggtgcaaaagatgtgcgtgatgccctggatcgcatgaaagaa480gcgttcgacctgctgggtgaatatgtcacctctcagggttacgatatccgttttgctatt540gaaccgaaaccgaacgaaccacgtggtgacattctgctgccaaccgtaggtcacgctctg600gcgttcatcgagcgtctggaacgcccggaactgtacggtgtgaacccggaggtcggccat660gagcagatggcaggtctgaacttccctcacggcatcgctcaggcactgtgggctggtaaa720ctgttccacattgatctgaacggtcagaacggtatcaaatacgaccaggatctgcgtttc780ggcgctggtgatctgcgtgcagctttctggctggtggatctgctggaaagcgctggttac840agcggtccgcgtcacttcgacttcaaaccgccgcgtactgaagacttcgatggtgtatgg900gcgagcgctgcgggttgtatgcgcaattatctgatcctgaaggaacgtgctgctgctttt960cgcgcggacccggaagtacaggaagcactgcgtgcgtctcgtctggatgagctggcgcgc1020cctactgctgctgatggtctgcaggctctgctggatgaccgctccgcttttgaagaattc1080gacgtcgacgctgccgcagctcgtggtatggctttcgaacgtctggatcagctggcaatg1140gaccatctgctgggcgcacgtggc1164<210>3<211>388<212>prt<213>人工序列<400>3metasntyrglnprothrprogluaspargphethrpheglyleutrp151015thrvalglytrpglnglyargasppropheglyaspalathrargarg202530alaleuaspprovalgluservalglnargleualagluleuglyala354045hisglyvalthrphehisaspaspaspleuilepropheglyserser505560aspsergluargglugluhisvallysargpheargglnalaleuasp65707580aspthrglymetlysvalprolysalathrthrasnleuphethrhis859095provalphelysaspglyglyphethralaasnaspargaspvalarg100105110argtyralaleuarglysthrileargasnileaspleualavalglu115120125leuglyprogluthrtyrvalglytrpglyglyarggluglyalaglu130135140serglyglyalalysaspvalargaspalaleuaspargmetlysglu145150155160alapheaspleuleuglygl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技术特征：1.一种葡萄糖异构酶gim，其特征在于，氨基酸序列如序列表seqidno：3所示。
2.一种f42、f55果葡糖浆同线生产方法，其特征在于，采用权利要求1所述的葡萄糖异构酶进行异构，具体步骤如下：
(1)液化：调节淀粉粉浆浓度beˊ17-25，添加耐高温淀粉酶，在ph5.0-7.0条件下进行液化，至de12-18，碘试为棕褐色；
(2)糖化：在ph3.8-4.5，温度58-62℃下，在液化液中添加糖化酶进行糖化，至dx(果糖 葡萄糖)≥95％；
(3)经过除渣、脱色、过滤进行净化；
(4)f00离交：将52-56℃的糖液自下到上通过阳离子交换柱，从阳交换柱出料进入阴离子交换柱，使得出料ph4.0-6.5，电导≤20μs/cm；
(5)f00蒸发：通过蒸发器真空浓缩获得ds为50％的糖浆；
(6)异构：闪蒸脱氧后，调节糖液ph7.6-7.9，二氧化硫含量80-120ppm，镁离子30-80ppm，之后进入异构酶固定柱，在55-60℃条件下经过葡萄糖异构酶异构获得含42％-44％果糖的糖液f42；
(7)f42离交/混床：将所得糖液依次经过阳离子交换柱和阴离子交换柱，再经过混床专用树脂，使得出料ph≥4.5，电导≤20μs/cm；
(8)f42蒸发：将经过f42离交/混床的一部分f42果糖进行蒸发浓缩，出料浓度控制在71.2％-71.4％，ph3.3-4.5，即得f42成品糖浆；
(9)色谱：将经过f42离交/混床的另一部分f42果糖经过色谱分离为果糖含量85％以上的糖浆ad，和果糖含量≤10％的残液bd；
(10)f55混配脱色：将糖浆ad与一部分经过f42离交/混床的f42果糖按比例混合成果糖含量为55％-57％的糖浆，然后在温度62-65℃下利用活性炭吸附，获得f55果糖；
(11)f55脱味：将f55果糖自上而下通过脱味柱，去除糖中部分蛋白及有色有味的物质；
(12)f55混床：将糖液经过混床专用树脂，进料温度32-37℃，出料ph≥4.5，去除糖中阴阳离子，降低灰分，净化糖液，延长糖浆储存期限；
(13)f55蒸发：对f55混床过来的糖液进行浓缩，使得出料ph3.3-4.5，浓度77.2％-77.4％，即f55成品糖浆。
3.如权利要求2所述的一种f42、f55同线生产方法，其特征在于，采用两次喷射的方法进行液化：
一次喷射：首先预热喷射器及层流罐至100℃，然后进行喷射液化，喷射器温度控制在102-110℃，经过真空一次闪蒸冷却，系统温度降到95-98℃进入层流罐维持60-90min；
二次喷射：通过二次喷射器将料液加热至120-145℃，并通过管道维持3-5min后进入真空二次闪蒸冷却，系统温度降到95-98℃后进入二次层流罐维持20-30min后，经过真空三次闪蒸冷却，系统温度降到78-72℃，再经过板式换热器将温度降至58-62℃，进ph罐后调节ph进入糖化罐。
4.如权利要求2所述的一种f42、f55果葡糖浆同线生产方法，其特征在于，步骤(3)所述的除渣、脱色、过滤工艺具体如下：
板框除渣：在62-65℃下，将糖化液经过板框过滤机，除渣糖化液中的蛋白，获得清澈糖液；
板框脱色：加入活性炭，对糖液进行脱色，脱色温度70-75℃，活性炭添加量为0.8-1.1kg/tds；
阿玛过滤二次脱色：滤液中转罐加入活性炭，活性炭添加量为0.8-1.1kg/tds，对糖液进行二次脱色，脱色温度65-70℃；
陶瓷膜过滤：将脱色液经陶瓷膜过滤，去除糖液中部分大分子的蛋白和糊精，截留各种微生物。
5.如权利要求2所述的一种f42、f55果葡糖浆同线生产方法，其特征在于，蒸发采用的方法为五效蒸发器真空浓缩，具体如下：五效：真空度50-150mbar，温度35-45℃；四效：真空度100-250mbar，温度40-55℃；三效：真空度150-300mbar，温度45-60℃；二效：真空度200-350mbar，温度50-65℃；一效：真空度250-450mbar，温度60-75℃。
6.权利要求2-5任意一项方法制备的f42、f55果葡糖浆产品。
7.权利要求1所述葡萄糖异构酶gim的应用。
技术总结本发明属于果葡糖浆生产技术领域，具体涉及一种F42、F55果葡糖浆同线生产的技术工艺。该方法以淀粉为原料，经过液化、糖化、离交、蒸发、异构、色谱分离以及不同阶段产品的调配，同线生产获得F42和F55糖浆，可减少频繁的切换糖浆，提高生产效率，提高果糖的单日产量(480吨提高至520吨)。同时本发明采用新型葡萄糖异构酶，提高异构效率，降低工艺成本，具有较好的应用前景。
技术研发人员：李林海;董得平;黄继红;闫佳佳;董瑜琪;杨秋霞;侯银臣;廖爱美;冯军伟
受保护的技术使用者：河南飞天农业开发股份有限公司
技术研发日：2020.12.21
技术公布日：2021.03.12
