本发明涉及微生物遗传育种技术领域，尤其涉及用于生产二十二碳六烯酸的裂殖壶菌突变株，即一种高产dha裂殖壶菌突变菌株的诱变育种方法。
背景技术：
二十二碳六烯酸（docosahexaenoicacid，dha）是一种ω-3系列多不饱和脂肪酸，对维持人体的正常生理功能至关重要。dha是细胞膜磷脂的组成成分，参与脑细胞和视网膜的正常发育，具有预防心血管疾病、高血脂等疾病的功效。随着人们生活水平的不断提高与对dha生物医药价值的认识的不断深化，dha的需求量也不断上升。
裂殖壶菌（schizochytrium）是一种类真菌类的单细胞异养原生生物，具有生长速度快、细胞内dha和脂肪酸含量高等优势，可作为dha生产的替代来源。
使用传统的发酵优化策略已经很难再进一步提高dha的产量，因此培育dha高产微生物新菌株显得尤为重要。常压室温等离子体（artp）新型诱变仪具有突变快、突变多样性高、简单易行等诸多优势。
技术实现要素：
针对现有技术不足，本发明一种高产dha裂殖壶菌突变菌株的诱变育种方法，经过两轮artp诱变，以摇瓶培养测得的dha产量为依据，快速简便获取高产dha新菌株。
一种高产dha裂殖壶菌突变菌株的诱变育种方法中培养基（g/l）成分包括以下成分：
固体培养基：葡萄糖10，蛋白胨1.5，酵母膏0.1，琼脂粉20，海盐33，ph自然，1×105pa、115℃灭菌21min。发酵培养基：葡萄糖20，蛋白胨1.5，酵母膏1.0，kh2po40.25，海盐33，ph自然，1×105pa、115℃灭菌21min。
一种高产dha裂殖壶菌突变菌株的诱变育种方法，主要包括以下步骤：
（1）种子液制备：在无菌超净台中，使用接种环挑取新鲜固体培养基中的单菌落，接种在装有40ml液体培养基的锥形瓶内，在28℃、150rpm摇床中培养24-36h；
（2）菌悬液制备：取5%的上述种子液接种至发酵液体培养基中，在28℃、150rpm摇床中培养24-36h，取适量菌液稀释后，调整细胞od660值为0.3-0.4之间，用于artp诱变处理；
（3）artp两轮诱变处理：分别取上述菌悬液10μl均匀涂布在无菌载片上，将载片放于培养皿中并转移至artp诱变仪凹槽内，凹槽下方固定座固定相应的ep管，用于承接载片，ep管内含有1ml的无菌蒸馏水。artp诱变仪辐射时间为0、10、20、30、40、50、60s，功率设定为120w，气量设定为10slm。诱变结束后，取出含有载片的ep管，震荡1min，使载片上的菌体完全重悬在ep管内，吸取80μl重悬液涂布在m4固体平板上，放入28℃恒温箱中培养2-3d。统计生长出的单菌落个数，计算出artp诱变仪不同处理时间下的致死率，选择致死率在90%左右的处理时间进行后续诱变处理依据；
以诱变致死率在90%左右的处理时间作为诱变仪的工作时间，第一次诱变处理后的突变体涂布在平板上，培养2-3d，挑选出形态大可能高产的单菌落，以磷酸香草醛法筛选出油脂有明显提高的诱变菌株作为第二次诱变辐照的出发菌株，实验方法与第一次诱变相同；
（4）磷酸香草醛法获取高产油脂菌株：收集培养4d的发酵液5ml于离心管内，8000rpm离心10min，蒸馏水洗涤2次，定容至5ml，取100μl菌液（对照取蒸馏水）于10ml离心管内，加入18mol/l的h2so42ml，震荡混匀，沸水浴反应10min，常温水浴5min；加入5ml磷酸香草醛试剂，37℃保温15min，常温水浴10min，于530nm测其od值；
（5）生物量的测定：取10ml培养4d摇瓶发酵液到已称重的离心管中，8000rpm离心15min，弃去上清液，用蒸馏水洗涤沉淀菌体2次，将盛有菌体的离心管放于-80℃冷冻1h，再放入冷冻干燥机内干燥48h，取出称重；
（6）测得dha产量：取冻干的菌体加入4%硫酸甲醇溶液2ml、1.0g/l的十九烷酸内标溶液100μl，混合均匀；置于80℃恒温水浴锅中1h，取出冷却至室温，随后分别加入1ml正己烷和1ml超纯水，混匀离心取上层有机相，过0.22μm滤膜后测气相得dha含量。
一种高产dha裂殖壶菌突变菌株的诱变育种方法，采用artp诱变仪对裂殖壶菌进行诱变育种，操作简单，诱变成功率高，能快速获取大量目的突变体；经过两轮诱变处理，最终获得两株高产突变株，其中一株菌dha产量提高了61%，另外一株菌提高了56%，经济效果显著。
附图说明
图1为野生型裂殖壶菌（schizochytriumsp.pku#mn4）在artp诱变仪不同处理时间下的致死率；
图2为野生型裂殖壶菌（schizochytriumsp.pku#mn4）和突变体1的生物量和dha产量；
图3为野生型裂殖壶菌（schizochytriumsp.pku#mn4）和突变体2的生物量和dha产量。
具体实施方式
下面通过具体实例对本发明作进一步的说明，本发明的实例是为了使本领域的技术人员更好的理解本发明，并不对本发明作任何的限制。
实施案例1：获取裂殖壶菌（schizochytriumsp.pku#mn4）高产dha菌株及诱变致死率
（1）种子液制备：在无菌超净台中，使用接种环挑取新鲜固体培养基中的单菌落，接种在装有40ml液体培养基的锥形瓶内，在28℃、150rpm摇床中培养24-36h；
（2）菌悬液制备：取5%的上述种子液接种至发酵液体培养基中，在28℃、150rpm摇床中培养24-36h，取适量菌液稀释后，调整细胞od660值为0.3-0.4之间，用于artp诱变处理；
（3）artp两轮诱变处理：分别取上述菌悬液10μl均匀涂布在无菌载片上，将载片放于培养皿中并转移至artp诱变仪凹槽内，凹槽下方固定座固定相应的ep管，用于承接载片，ep管内含有1ml的无菌蒸馏水。artp诱变仪辐射时间为0、10、20、30、40、50、60s，功率设定为120w，气量设定为10slm。诱变结束后，取出含有载片的ep管，震荡1min，使载片上的菌体完全重悬在ep管内，吸取80μl重悬液涂布在m4固体平板上，放入28℃恒温箱中培养2-3d。统计生长出的单菌落个数，计算出artp诱变仪不同处理时间下的致死率，选择致死率在90%左右的处理时间进行后续诱变处理依据；
以诱变致死率在90%左右的处理时间40s作为诱变仪的工作时间，第一次诱变处理后的突变体涂布在平板上，培养2-3d，挑选出形态大可能高产的单菌落，以磷酸香草醛法筛选出油脂有明显提高的诱变菌株作为第二次诱变辐照的出发菌株，实验方法与第一次诱变相同；
（4）磷酸香草醛法获取高产油脂菌株：收集培养4d的发酵液5ml于离心管内，8000rpm离心10min，蒸馏水洗涤2次，定容至5ml，取100μl菌液（对照取蒸馏水）于10ml离心管内，加入18mol/l的h2so42ml，震荡混匀，沸水浴反应10min，常温水浴5min；加入5ml磷酸香草醛试剂，37℃保温15min，常温水浴10min，于530nm测其od值；
（5）生物量的测定：取10ml培养4d摇瓶发酵液到已称重的离心管中，8000rpm离心15min，弃去上清液，用蒸馏水洗涤沉淀菌体2次，将盛有菌体的离心管放于-80℃冷冻1h，再放入冷冻干燥机内干燥48h，取出称重；
（6）测得dha产量：取冻干的菌体加入4%硫酸甲醇溶液2ml、1.0g/l的十九烷酸内标溶液100μl，混合均匀；置于80℃恒温水浴锅中1h，取出冷却至室温，随后分别加入1ml正己烷和1ml超纯水，混匀离心取上层有机相，过0.22μm滤膜后测气相得dha含量。
artp诱变仪的致死率曲线如图1所示。经artp诱变仪两次诱变辐照和摇瓶发酵培养测定dha产量后获得一株高产突变株，其中干重为7.07g/l，dha产量为0.98g/l，dha产量比野生型裂殖壶菌提高了61%，如附图2。
实施案例2：获取裂殖壶菌（schizochytriumsp.pku#mn4）高产dha菌株
（1）种子液制备：在无菌超净台中，使用接种环挑取新鲜固体培养基中的单菌落，接种在装有40ml液体培养基的锥形瓶内，在28℃、150rpm摇床中培养24-36h；
（2）菌悬液制备：取5%的上述种子液接种至发酵液体培养基中，在28℃、150rpm摇床中培养24-36h，取适量菌液稀释后，调整细胞od660值为0.3-0.4之间，用于artp诱变处理；
（3）artp两轮诱变处理：分别取上述菌悬液10μl均匀涂布在无菌载片上，将载片放于培养皿中并转移至artp诱变仪凹槽内，凹槽下方固定座固定相应的ep管，用于承接载片，ep管内含有1ml的无菌蒸馏水。artp诱变仪辐射时间为0、10、20、30、40、50、60s，功率设定为120w，气量设定为10slm。诱变结束后，取出含有载片的ep管，震荡1min，使载片上的菌体完全重悬在ep管内，吸取80μl重悬液涂布在m4固体平板上，放入28℃恒温箱中培养2-3d。统计生长出的单菌落个数，计算出artp诱变仪不同处理时间下的致死率，选择致死率在90%左右的处理时间进行后续诱变处理依据；
以诱变致死率在90%左右的处理时间40s作为诱变仪的工作时间，第一次诱变处理后的突变体涂布在平板上，培养2-3d，挑选出形态大可能高产的单菌落，以磷酸香草醛法筛选出油脂有明显提高的诱变菌株作为第二次诱变辐照的出发菌株，实验方法与第一次诱变相同；
（4）磷酸香草醛法获取高产油脂菌株：收集培养4d的发酵液5ml于离心管内，8000rpm离心10min，蒸馏水洗涤2次，定容至5ml，取100μl菌液（对照取蒸馏水）于10ml离心管内，加入18mol/l的h2so42ml，震荡混匀，沸水浴反应10min，常温水浴5min；加入5ml磷酸香草醛试剂，37℃保温15min，常温水浴10min，于530nm测其od值；
（5）生物量的测定：取10ml培养4d摇瓶发酵液到已称重的离心管中，8000rpm离心15min，弃去上清液，用蒸馏水洗涤沉淀菌体2次，将盛有菌体的离心管放于-80℃冷冻1h，再放入冷冻干燥机内干燥48h，取出称重；
（6）测得dha产量：取冻干的菌体加入4%硫酸甲醇溶液2ml、1.0g/l的十九烷酸内标溶液100μl，混合均匀；置于80℃恒温水浴锅中1h，取出冷却至室温，随后分别加入1ml正己烷和1ml超纯水，混匀离心取上层有机相，过0.22μm滤膜后测气相得dha含量。
经artp诱变仪两次诱变辐照和摇瓶发酵培养测定dha产量后获得一株高产突变株，其中干重为6.71g/l，dha产量为0.95g/l，dha产量比野生型裂殖壶菌提高了56%，如附图3。
1.一种高产dha裂殖壶菌突变菌株的诱变育种方法，其特征在于：选取对数时期的裂殖壶菌，用无菌蒸馏水制成菌悬液，将菌悬液置于artp诱变仪内进行第一轮辐照处理，取辐照后的菌悬液适当稀释后均匀涂布在固体平板上，于培养箱中避光保存，将第一轮辐照后油脂含量高的菌株作为第二轮诱变辐照的出发菌株，通过摇瓶发酵培养测得的dha产量为依据，最终筛选出高产dha的裂殖壶菌菌株。
2.根据权利要求1所述的一种高产dha裂殖壶菌突变菌株的诱变育种方法，其特征在于：所述的裂殖壶菌菌悬液是在对数时期使用无菌蒸馏水配制而成的，其细胞浓度为od660值0.3-0.4之间。
3.根据权利要求1所述的一种高产dha裂殖壶菌突变菌株的诱变育种方法，其特征在于：所述artp诱变仪工作条件为：取菌悬液10μl均匀涂布在无菌载片上，将载片放于培养皿中并转移至artp诱变仪凹槽内，凹槽下方固定座固定相应的ep管，用于承接载片，artp诱变仪辐射时间为0、10、20、30、40、50、60s，功率设定为120w，气量设定为10slm，以此方法诱变辐照两轮。
4.根据权利要求1所述的一种高产dha裂殖壶菌突变菌株的诱变育种方法，其特征在于：所述油脂产量高的新菌株是以磷酸香草醛法获取，具体为：收集培养4d的发酵液5ml于离心管内，8000rpm离心10min，蒸馏水洗涤2次，定容至5ml，取100μl菌液于10ml离心管内，对照取蒸馏水，加入18mol/l的h2so42ml，震荡混匀，沸水浴反应10min，常温水浴5min；加入5ml磷酸香草醛试剂，37℃保温15min，常温水浴10min，于530nm测其od值。
5.根据权利要求1所述的一种高产dha裂殖壶菌突变菌株的诱变育种方法，其特征在于：选择致死率在90%左右的处理时间进行后续artp诱变处理依据。
技术总结