本发明涉及光遗传学和神经科学领域，特别是涉及一种利用光照抑制肿瘤细胞增殖的方法及实验装置。
背景技术：
近年来，虽然光遗传学技术取得了瞩目的成就，但是依然有一些需要我们关注的问题。
首先，有人认为光遗传学在神经科学领域取得的成就可以平移其理论到神经肿瘤领域中来，对神经环路引入这样外源的兴奋或抑制的刺激可使神经元应答超出生理范围，在这种情况下，神经环路会出现不自然的变化，最后导致不正确的生理学结论。
其次，光敏蛋白的表达和光照在神经元群体中并不均匀，结果是光遗传学操纵的量级和范围会出现异质性，例如发生光的散射时。
再次，大范围光刺激同时作用在神经元群体上，可能使环路出现非生理性的活动模式，例如靶向特化的某些细胞时产生的能量沉积等问题。
另外，我们知道刺激表达光遗传学蛋白的轴突是一个常用的策略，不过直接用光刺激轴突boutons，可能会引起非生理性的神经递质释放，容易使人过高估计突触连接的影响。
最后，有研究表明，不论是用病毒还是质粒电转，长期高水平表达光敏蛋白都会造成细胞形态异常，这就让人怀疑光敏蛋白是否还会对神经环路的功能产生一些潜在的影响。因此，在光遗传学用于治疗人类疾病之前，我们必须开发更好的病毒体系，仔细评估病毒递送系统的长期安全性和有效性。
由于神经细胞的轴突、树突互相交联，光敏蛋白的响应信号很容易就干扰到周边的神经细胞，因此需要开发一些仅表达在胞体上的光敏蛋白（如，光敏蛋白socochr）；另一方面，想要通过光遗传达到某一个细胞的精度很难实现（需要发展单细胞级的光遗传技术）。
技术实现要素：
1．要解决的技术问题
本发明目的针对现有技术中光敏蛋白的表达和光照在肿瘤细胞的问题，提供一种利用光照抑制肿瘤细胞生长的方法及实验装置。
2．技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
一种利用光照抑制肿瘤细胞生长的方法，该方法包含如下步骤：
s1：将稳定表达enphr3.0通道蛋白的肿瘤细胞，通过特定波长590nm的黄光照射后向细胞内泵入cl-，稳定地在肿瘤细胞的细胞膜表达上述通道蛋白；
s2：将上述稳定表达通道蛋白的肿瘤细胞放入培养装置中，并盖上培养装置盖；
s3：给与特定波长590nm的黄光进行光照，激活通道蛋白，向细胞内泵入cl-，使得细胞内cl-浓度增高；
s4：检测肿瘤细胞增殖活性，通过检测肿瘤细胞的增殖细胞周期、凋亡、分泌外泌体的量等指标得出细胞活性的受抑制的结论。
一种利用光照抑制肿瘤细胞生长的方法对应的实验装置，包括培养装置、至少一个遮光筒、光源和散热器；遮光筒位于培养装置上部；光源位于遮光筒上部；散热器位于光源上部；培养装置包括培养装置本体和培养装置盖；培养装置盖位于培养装置本体上部；培养装置为透光材料；培养装置内设有至少一个培养皿。
优选地，所述遮光筒的数量与培养皿的数量相匹配；遮光筒的直径不小于培养皿的直径；培养皿与遮光筒同心；遮光筒的高度为20mm。
优选地，所述光源包括线路板和多个led灯珠；多个led灯珠焊接在线路板内侧；每四个led灯珠为一组，每组led灯珠位于遮光筒范围内；每组的四个led灯珠排列呈圆形，每个led灯珠的中心位于同一个圆周上，且均匀的分布在所述圆周上。
优选地，每个led灯珠为黄光led灯珠；功率在1w-5w之间；工作电压在4.4v-5.2v之间；光的功率在xx-xxw/mm2之间；光的波长为590nm。
优选地，每个培养皿侧壁不透光，防止侧壁上外界的光线照射进来。
优选地，所述遮光筒为不透光材质。
优选地，所述散热器为铝材质的散热板；散热器为长方形，最大外形尺寸大于线路板的最大外形尺寸；散热器上部设有均匀分布的多个散热片，通过间隔的散热片将线路板产生的热量带走。
3.有益效果
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
一、一种利用光照抑制肿瘤细胞生长的方法对应的实验装置，通过在光源和培养装置中间增加遮光筒，将光源的光更加汇聚、集中，对每个培养皿内的培养细胞进行单独照射，有效地解决了现有技术中光线的散射问题。
二、一种利用光照抑制肿瘤细胞生长的方法对应的实验装置，每个遮光筒内对应的有四个led灯珠，可以通过控制面板来控制led灯珠，由此调整对培养皿内培养细胞的光照强度跟功率。
三、一种利用光照抑制肿瘤细胞生长的方法对应的实验装置，在电路板上方放置有铝材质散热板的散热器，减小光源在工作时散发的热量，有效地防止产生的热量对实验产生影响。
附图说明
图1本发明的结构示意图；
图2本发明的培养装置本体结构示意图；
图3本发明的光源结构示意图；
图4本发明的培养状态示意图；
图5本发明的状态示意图
图中，1、培养装置；11、培养装置本体，111、培养皿，12、培养装置盖；
2、遮光筒；
3、光源；31、线路板，32、led灯珠；
4、散热器；41、散热片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图；对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然；所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例；而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例；本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例；都属于本发明保护的范围。
光遗传学（optogenetics）是一项整合了光学、软件控制、基因操作技术、电生理等多学科交叉的技术。自2005年，斯坦福大学karldeisseroth实验室通过在神经元中表达光敏蛋白，响应不同波长的光刺激实现对神经元的调控，宣布人类正式拥有了精准操控神经元的工具。长久以来，我们对复杂的神经网络连接的理解仅停留在相关性上，有了光遗传学，我们终于有能力，微创、精准地探究特定的神经环路和脑功能之间的关系，这无疑是个跨越式的进步。
抑制型通道蛋白包括nphr，即为halorhodopsin，第一个有效抑制神经元活动的光遗传学工具，在黄绿激光照射下会将氯离子打进神经元内，而抑制神经元活动。当把nphr表达在神经元内时，会聚集在内质网上，而如果将内质网输出元件加在nphr基因序列后面，这样可以使得nphr在胞内高量表达，而且不会聚集在内质网上，这样修改过的nphr被称为enphr2.0。但是enphr2.0在细胞膜的聚集仍然不够，而将一个高尔基体输出元件和来自于钾离子通道kir2.1的上膜元件加在enphr2.0基因序列后面，这样就能实现在神经元细胞膜上的高量聚集，这样修改过的nphr被称为enphr3.0。
如图1-5所示，一种利用光照抑制肿瘤细胞生长的方法，该方法包含如下步骤：
s1：将稳定表达enphr3.0通道蛋白的肿瘤细胞，通过特定波长590nm的黄光照射后向细胞内泵入cl-，稳定地在肿瘤细胞的细胞膜表达上述通道蛋白。相对传统的研究方法，光遗传学有着无可比拟的优点，只需要向细胞内转入一个蛋白，实际操作性高。以光作为刺激媒介，可实现神经细胞的毫秒级操控，利用光遗传技术观察神经投射。光敏蛋白可分为激活型和抑制型两种，能够引起神经元兴奋或抑制。其光灵敏度和动力学之间存在负相关，激活或抑制能力强弱与时间的精准控制密切相关，所以，根据光敏感蛋白的不同特性寻找合适的光敏感蛋白。enphr3.0只是一种工具蛋白，不做任何表达，只是在细胞膜上可以形成一个通道，用来泵入培养基中的氯离子。利用转染、病毒注射或转基因动物等方法将编码光敏感蛋白的基因输入到肿瘤细胞中，其中，病毒注射是光遗传学研究的主导手段，主要采用慢病毒和腺相关病毒aav。
s2：将上述稳定表达通道蛋白的肿瘤细胞放入培养装置11中，并盖上培养装置盖12。
s3：给与特定波长590nm的黄光进行光照，激活通道蛋白enphr3.0开放，向细胞内泵入cl-，使得细胞内cl-浓度增高；通过特定波长590nm的黄光对通道蛋白enphr3.0进行照射，由于通道蛋白在不同波长的光照刺激下会分别对不同的离子产生选择性，使得细胞膜两边的膜电位发生变化。特定的波长、光强度和频率的光对培养细胞进行光照刺激，使光敏蛋白enphr3.0成为细胞中泵入特殊离子通道，而且，不同波长的光照刺激下会分别对不同的离子而产生选择性，本方案中的参数使培养液中的cl-进入细胞，使得细胞膜两边的膜电位发生变化，达到对肿瘤细胞进行抑制，使细胞呈现静止状态，影响它的增殖行为。
s4：检测肿瘤细胞增殖活性，通过检测肿瘤细胞的增殖细胞周期、凋亡、分泌外泌体的量等指标得出细胞活性的受抑制的结论。
在肿瘤细胞培养时会产生的外泌体，外泌体的直径约40-150nm，通过对肿瘤细胞培养时产生的外泌体数量减少，来确定培养细胞中肿瘤细胞的抑制状态
一种利用光照抑制肿瘤细胞生长的方法对应的实验装置，包括培养装置1、至少一个遮光筒2、光源3和散热器4。其中，培养装置1包括培养装置本体11和培养装置盖12，在培养装置本体11内设有多个培养皿111，遮光筒2放置在培养装置1上方，且每个培养皿111都位于遮光筒2的范围内。光源3位于遮光筒2上放，光源3包括电路板31和焊接在电路板31上的多个led灯珠32，led灯珠32位于电路板31的下方，且位于遮光筒2内。散热器4位于光源3的电路板31的上方，将电路板31上的热量通过散热器4带走。
具体地，培养装置1为透光材料，但是，培养装置11内培养皿111的侧壁要不透光，可以在培养皿111的侧壁上涂上一层遮光层。防止外界的其他光源对培养皿111内的培养细胞进行干涉，培养细胞只能在led灯珠32的照射下发生反应。
具体地，遮光筒2为不透光的材质制作的，遮光筒2的数量与培养皿111的数量相匹配，且遮光筒2的直径不小于培养皿111的直径，本方案中遮光筒2的直径约等于培养皿111的直径，使遮光筒2将培养皿111罩住，培养皿111与遮光筒2同心，遮光筒2位于培养皿111的上方，通过遮光筒2使led灯珠32的光线直射在培养皿111内，通过遮光筒2也可以防止外部的光线对培养皿111内的培养细胞进行干扰，只能接受单一光线的照射。遮光筒2的高度为20mm，使得光源3与培养皿111的照射距离固定，有效的控制光照的功率。
具体地，光源3包括线路板31和多个led灯珠32。多个led灯珠32焊接在线路板31内侧，每四个led灯珠32为一组，每组led灯珠32位于遮光筒2范围内。每组的四个led灯珠32的中心位于同一圆周上，且均匀的分布在此圆周上。每两个相邻的led灯珠32之间的距离为20mm，每个led灯珠32为黄光led灯珠，功率在1w-5w之间，工作电压在4.4v-5.2v之间，光的功率在xx-xxw/mm2之间，光的波长为590nm。
以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式；但本发明的保护范围并不局限于此；任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内；根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变；都应涵盖在本发明的保护范围内。
1.一种利用光照抑制肿瘤细胞生长的方法，其特征在于：该方法包含如下步骤：
s1：将稳定表达enphr3.0通道蛋白的肿瘤细胞，通过特定波长590nm的黄光照射后向细胞内泵入cl-，稳定地在肿瘤细胞的细胞膜表达上述通道蛋白；
s2：将上述稳定表达通道蛋白的肿瘤细胞放入培养装置（11）中，并盖上培养装置盖（12）；
s3：给与特定波长590nm的黄光进行光照，激活通道蛋白，向细胞内泵入cl-，使得细胞内cl-浓度增高；
s4：检测肿瘤细胞增殖活性，通过检测肿瘤细胞的增殖细胞周期、凋亡、分泌外泌体的量等指标得出细胞活性的受抑制的结论。
2.一种利用光照抑制肿瘤细胞生长的方法对应的实验装置，其特征在于：包括培养装置（1）、至少一个遮光筒（2）、光源（3）和散热器（4）；
遮光筒（2）位于培养装置（1）上部；
光源（3）位于遮光筒（2）上部；
散热器（4）位于光源（3）上部；
培养装置（1）包括培养装置本体（11）和培养装置盖（12）；
培养装置盖（12）位于培养装置本体（11）上部；
培养装置（1）为透光材料；
培养装置（11）内设有至少一个培养皿（111）。
3.根据权利要求2所述的一种利用光照抑制肿瘤细胞生长的方法及实验装置，其特征在于，所述遮光筒（2）的数量与培养皿（111）的数量相匹配；
遮光筒（2）的直径不小于培养皿（111）的直径；
培养皿（111）与遮光筒（2）同心；
遮光筒（2）的高度为20mm。
4.根据权利要求2所述的一种利用光照抑制肿瘤细胞生长的方法及实验装置，其特征在于，所述光源（3）包括线路板（31）和多个led灯珠（32）；
多个led灯珠（32）焊接在线路板（31）内侧；
每四个led灯珠（32）为一组，每组led灯珠（32）位于遮光筒（2）范围内；
每组的四个led灯珠（32）排列呈圆形，每个led灯珠（32）的中心位于同一个圆周上，且均匀的分布在所述圆周上。
5.根据权利要求4所述的一种利用光照抑制肿瘤细胞生长的方法及实验装置，其特征在于，每个led灯珠（32）为黄光led灯珠；
功率在1w-5w之间；
工作电压在4.4v-5.2v之间；
光的功率在xx-xxw/mm2之间；
光的波长为590nm。
6.根据权利要求2所述的一种利用光照抑制肿瘤细胞生长的方法及实验装置，其特征在于，每个培养皿（111）侧壁不透光。
7.根据权利要求2所述的一种利用光照抑制肿瘤细胞生长的方法及实验装置，其特征在于，所述遮光筒（2）为不透光材质。
8.根据权利要求2所述的一种利用光照抑制肿瘤细胞生长的方法及实验装置，其特征在于，所述散热器（4）为铝材质的散热板；
散热器（4）为长方形，最大外形尺寸大于线路板（31）的最大外形尺寸；
散热器（4）上部设有均匀分布的多个散热片（41）。
技术总结