本发明属于质粒的提取方法领域，具体涉及一种大规模提取用于转染哺乳动物细胞的无内毒素质粒的方法。
背景技术：
质粒是一种小型的环状双链dna分子，它游离于基因组dna之外，携带遗传信息，可自主复制。质粒已经成为遗传学，微生物学，生物化学，分子生物学等学科中不可或缺的工具。近几年来，生物药在肿瘤等疾病的治疗中起越来越重要的作用，然而生物药的开发无一不依赖于携带有外源基因的重组质粒在宿主细胞内的复制和表达。所以，在生命科学领域中，质粒的制备成为许多研究的关键一步。
内毒素，是革兰氏阴性细菌细胞壁的成分之一，菌体裂解后会释放出来。人体对内毒素反应极为敏感，极微量的内毒素进入人体内就会引起免疫反应，引起体温升高，所以内毒素也被称为“热源”因此，用于转染哺乳动物细胞的质粒必须达到高质量，高纯度，质粒超螺旋，内毒素含量要低于1eu/ml。
现有的高质量质粒制备方法有苯酚-氯仿抽提法、氯化铯超速离心法和商用试剂盒抽提法，其中苯酚-氯仿抽提法得到的质粒的纯度尚可，但苯酚有毒性，氯仿巨毒，对人体危害极大，不适合用于生产；氯化铯超速离心法能得到很高质量的质粒，但是购买超速离心机成本很高，质粒制备时间很长(一般超过10小时)，且受离心机的限制，无法进行大规模的质粒制备；商用试剂盒则成本过高，不适用于大规模的质粒制备。现有的柱层析提取质粒的方法则需要在清洗杂质前后加入特定的试剂以去除内毒素，如聚乙二醇辛基苯基醚类试剂，该类试剂会影响提取到的质粒的质量，并且该试剂不易清洗干净，残留在质粒中并转染至哺乳动物细胞中会严重影响哺乳动物细胞的生长。
中国专利cn107502606a公开了一种大规模提取去除内毒素的质粒的方法，包括先通过传统碱裂解法获得粗分离的质粒dna，然后依次加入异丙醇、nh4ac溶液、rnasea、nacl，再加入peg6000和nacl的混合溶液并在冰上放置20-40min以去除内毒素，最后用乙醇洗涤沉淀再用te溶液溶解，获得了目的质粒。然而该方法在去除内毒素过程中需先加入5mol/lnacl，再加入peg6000和nacl的混合溶液，然后置冰上放置20-40min，操作过程相对繁琐且耗时，并且最终获得的质粒中内毒素含量仅低于5eu/μg，该内毒素含量仍然偏高，无法用于转染哺乳动物细胞。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种大规模提取用于转染哺乳动物细胞的的无内毒素质粒的方法，该提取方法安全、简单快速、节约成本，并且提取得到的质粒纯度高、超螺旋并且内毒素含量很低，可用于转染哺乳动物细胞。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种大规模提取用于转染哺乳动物细胞的无内毒素质粒的方法，由以下步骤组成：
s1.对含目标质粒的细菌进行培养，离心得到菌体后进行重悬；
s2.向细菌悬液中分别加入p2裂解液和p3缓冲液，其中所述p2裂解液为naoh和sds的混合溶液，其中naoh用于裂解细菌细胞膜，释放细胞内的物质，sds(十二烷基硫酸钠)则是与细胞内的蛋白质结合形成sds-蛋白质复合物，所述p3缓冲液为乙酸钾溶液，用于中和所述p2裂解液中的naoh避免dna结构被破坏，同时可与sds反应，使sds-蛋白质复合物沉淀下来。
s3.将上述混合液离心，其中沉淀为细胞体内蛋白质等杂质，上清液为粗分离的质粒，取上清液加入到层析柱中并离心，质粒可结合到层析柱上；
s4.向层析柱中加入缓冲液w后离心，丢弃废液，所述缓冲液w(ph8.0)为50mmol/ltris-hcl和500～1000mmol/l的中性氯化盐的混合溶液，用于清洗结合在层析柱上的质粒并除去质粒中混杂的内毒素；
s5.向层析柱中加入缓冲液e后离心，收集洗脱液，所述缓冲液e(ph8.0)为50mmol/ltris-hcl和大于1000mmol/l的中性氯化盐的混合溶液，用于洗脱结合在层析柱上的质粒；
s6.向所述洗脱液中加入有机溶剂用于沉淀质粒，将所述有机溶剂与洗脱液混匀后离心，弃上清，得到质粒沉淀；
s7.向所述质粒沉淀中加入te缓冲液溶解质粒。
优选地，步骤s4和s5中所述中性氯化盐为nacl、kcl中的一种。
优选地，所述中性氯化盐为nacl。
优选地，步骤s4中，所述缓冲液w(ph8.0)为50mmol/ltris-hcl和1000mmol/l中性氯化盐的混合溶液。缓冲液w的作用是去除内毒素，其原理是：在ph＞2时，内毒素带负电荷，可与带负电的质粒一同结合在层析柱上，并可用高盐溶液将其洗脱下来，内毒素的带电荷量低于质粒的带电荷量，经过反复试验创造性发现，当中性氯化盐溶液的浓度为500～1000mmol/l时恰好可将内毒素洗脱下来而不会将质粒从层析柱上洗脱下来，且当中性氯化盐溶液的浓度为1000mmol/l时，内毒素的去除效果最好，从而可除去质粒中的内毒素。
优选地，步骤s5中，缓冲液e(ph8.0)为50mmol/ltris-hcl和1200mmol/l中性氯化盐的混合溶液。缓冲液e的作用是将层析柱上结合的质粒洗脱下来
优选地，步骤s1具体包括：将含目标质粒的细菌接种至lb液体培养基中培养过夜，高速离心得到菌体，然后用p1缓冲液(ph8.0)对菌体重悬，所述p1缓冲液的成分为：50mmol/ltris-hcl，10mmol/ledta和100mg/lrnasea。tris-hcl是缓冲溶液，可保证反应体系的ph恒定，edta是金属离子螯合剂，可与微生物体内的金属离子相互结合，从而抑制dna酶的活性，rnasea是rna酶a，用于降解rna，由于rna酶a的稳定性较差，因此所述p1缓冲液需放置于4℃条件下保持。
优选地，步骤s2中，所述p2裂解液的成分为：200mmol/lnaoh，1％(w/v)sds；所述p3缓冲液的成分为：ph为4.0的2mol/l乙酸钾溶液。
优选地，步骤s3中，层析柱使用前需用缓冲液e平衡。
优选地，步骤s6中，有机溶剂为乙醇或异丙醇中的一种或一种以上的混合溶剂。
优选地，s3、s4、s5和s6步骤中的离心条件为：4℃，12000g离心10min。
优选地，步骤s3中，所述上清液若还存在絮状物，可重复离心或用滤纸过滤，获得澄清的上清液，即多次离心或过滤以除去质粒粗提液中的蛋白质等杂质；将所述上清液反复加入到所述层析柱中，多次离心，目的是使所述层析柱达到最大结合量。步骤s7中，te缓冲液(ph8.0)的成分为：10mmol/ltris-hcl，1mmol/ledta。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)利用质粒和内毒素的带电荷量不同，用不同浓度的中性氯化盐分别对其进行洗脱，不需要加入特定的内毒素去除试剂就可达到去除内毒素的目的，避免了内毒素去除试剂残留对转染细胞的影响。
(2)只需利用常规冷冻离心机就可完成提取过程，不需要使用超速离心机或购买商业试剂盒，节约了生产成本。
(3)提取过程快速简单，只需3小时就可提取目的质粒，大大提高了生产效率，并且可进行线性放大，可在较短时间内完成克级及以上的高质量质粒的提取。
(4)所使用的试剂均为常规试剂，不需要使用氯仿等有毒试剂以及核酸染料等致癌试剂，操作过程更加安全。
附图说明
图1为本发明实施例1中5个不同质粒样品的质粒电泳图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供了一种采用柱层析法大规模提取用于哺乳动物细胞转染的高纯度，低内毒素含量的质粒的方法。对5个不同的质粒样品分别采用本实施的方法进行质粒提取。
其中各缓冲液、裂解液的配方为：
p1缓冲液(ph8.0)：50mmol/ltris-hcl，10mmol/ledta和100mg/lrnasea(p1缓冲液需保存在4℃冰箱中)；
p2裂解液：200mmol/lnaoh，1％(w/v)sds(十二烷基硫酸钠)；
p3缓冲液：2mol/l乙酸钾溶液，调节ph至4.0；
缓冲液w(ph8.0)：50mmol/ltris-hcl，1000mmol/lnacl；
缓冲液e(ph8.0)：50mmol/ltris-hcl，1200mmol/lnacl；
te缓冲液(ph8.0)：10mmol/ltris-hcl，1mmol/ledta。
具体提取步骤如下：
s1.含有目的质粒的大肠杆菌的菌液按体积比1:100的比例接种到100mllb液体培养基中，摇床转速220r/min，37℃培养过夜；然后8000g离心3min，丢弃培养基上清，得到菌体沉淀；向菌体沉淀中加入8ml的p1缓冲液，震荡使菌体重悬均匀；
s2.向离心管内加入8ml的p2裂解液，轻轻混匀后静置至溶液变透明，然后加入8mlp3缓冲液，充分混匀至絮状沉淀出现；
s3.向层析柱中加入10ml缓冲液e，将层析柱平衡，离心弃掉废液，然后将s2中的混合液在4℃，12000g离心10min，缓慢吸取上清液并重复离心一次，将最终得到的上清液加入到平衡好的层析柱中,4℃，12000g离心10min,并将收集到的废液再次加入到所述层析柱中，重复离心一次，以使层析柱达到最大结合量；
s4.向层析柱中加入10ml缓冲液w，4℃，12000g离心10min，弃掉废液；
s5.向层析柱中加入10ml缓冲液e，4℃，12000g离心10min，并用无菌，无内毒素污染的离心管收集洗脱液，
s6.向收集的洗脱液中加入7ml异丙醇，混合均匀，然后4℃，12000g离心10min，弃上清，得到质粒沉淀；
s7.向质粒沉淀中加入1ml的te缓冲液溶解质粒，得到了目的质粒。
将得到的目的质粒进行跑胶检测，电泳图如图1所示，图中均显示只有一条超螺旋质粒条带，而没有开环和线性化的质粒，说明得到了高质量、超螺旋的质粒样品。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于：缓冲液w(ph8.0)的成分为：50mmol/ltris-hcl，500mmol/lnacl；s6步骤中用乙醇代替异丙醇。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于：缓冲液w(ph8.0)的成分为：50mmol/ltris-hcl，800mmol/lkcl。
对比例1
本对比例与实施例1的不同之处在于：缓冲液w(ph8.0)的成分为：50mmol/ltris-hcl，1500mmol/lnacl。
对比例2
本对比例与实施例1的不同之处在于：缓冲液w(ph8.0)的成分为：50mmol/ltris-hcl，300mmol/lnacl。
应用例
分别测定各实施例和对比例中提取到的质粒溶液中质粒的含量以及每毫升溶液中内毒素的含量。其中质粒含量用nanodrop2000进行测定，内毒素含量用商业化内毒素检测试剂盒进行检测。结果如表1-5所示。
表1.实施例1中各样品的质粒含量和内毒素含量
表2.实施例2中各样品的质粒含量和内毒素含量
表3.实施例3中各样品的质粒含量和内毒素含量
表4.对比例1中各样品的质粒含量和内毒素含量
表5.对比例2中各样品的质粒含量和内毒素含量
根据上述结果可发现，当缓冲液w中的中性氯化盐浓度低于500mmol/ml时，如表5所示，虽然得到的质粒含量较高，但内毒素含量也偏高，高于1eu/ml，因此无法用于转染哺乳动物细胞；当缓冲液w中的中性氯化盐浓度高于1000mmol/ml时，如表4所示，虽然其内毒素含量低，但得到的质粒含量也很低，内毒素与质粒的含量比均高于0.7，即质粒的提取效果较差。而当缓冲液w中的中性氯化盐浓度为500～1000mmol/ml时，如表1-3所示，得到的质粒中内毒素含量均低于1eu/ml，可用于转染哺乳动物细胞，且内毒素与质粒的含量比均低于0.7，即质粒的提取效果较好，并且当中性氯化盐为nacl且nacl的浓度为1000mmol/ml时，内毒素与质粒的含量比最低，即得到的质粒的质量和纯度最高，每mg质粒中所含的内毒素含量最低，效果最优。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
1.一种大规模提取用于转染哺乳动物细胞的无内毒素质粒的方法，其特征在于，由以下步骤组成：
s1.对含目标质粒的细菌进行培养，离心得到菌体后进行重悬；
s2.向细菌悬液中分别加入p2裂解液和p3缓冲液，其中所述p2裂解液为naoh和sds的混合溶液，所述p3缓冲液为乙酸钾溶液；
s3.将上述混合液离心，取上清液加入到层析柱中，离心；
s4.向层析柱中加入缓冲液w后离心，丢弃废液，所述缓冲液w(ph8.0)为50mmol/ltris-hcl和500～1000mmol/l的中性氯化盐的混合溶液；
s5.向层析柱中加入缓冲液e后离心，收集洗脱液，所述缓冲液e(ph8.0)为50mmol/ltris-hcl和大于1000mmol/l的中性氯化盐的混合溶液；
s6.向所述洗脱液中加入有机溶剂沉淀质粒，混匀后离心，弃上清，得到质粒沉淀；
s7.向所述质粒沉淀中加入te缓冲液溶解质粒。
2.根据权利要求1所述的一种大规模提取用于转染哺乳动物细胞的无内毒素质粒的方法，其特征在于，步骤s4和s5中所述中性氯化盐为nacl、kcl中的一种。
3.根据权利要求2所述的一种大规模提取用于转染哺乳动物细胞的无内毒素质粒的方法，其特征在于，所述中性氯化盐为nacl。
4.根据权利要求1所述的一种大规模提取用于转染哺乳动物细胞的无内毒素质粒的方法，其特征在于，步骤s4中，所述缓冲液w(ph8.0)为50mmol/ltris-hcl和1000mmol/l中性氯化盐的混合溶液。
5.根据权利要求1所述的一种大规模提取用于转染哺乳动物细胞的无内毒素质粒的方法，其特征在于，步骤s5中，缓冲液e(ph8.0)为50mmol/ltris-hcl和1200mmol/l中性氯化盐的混合溶液。
6.根据权利要求1所述的一种大规模提取用于转染哺乳动物细胞的无内毒素质粒的方法，其特征在于，步骤s1具体包括：将含目标质粒的细菌接种至lb液体培养基中培养过夜，高速离心得到菌体，然后用p1缓冲液(ph8.0)对菌体重悬，所述p1缓冲液的成分为：50mmol/ltris-hcl，10mmol/ledta和100mg/lrnasea。
7.根据权利要求1所述的一种大规模提取用于转染哺乳动物细胞的无内毒素质粒的方法，其特征在于，步骤s2中，所述p2裂解液为：200mmol/lnaoh，1％(w/v)sds；所述p3缓冲液为：ph为4.0的2mol/l乙酸钾溶液。
8.根据权利要求1所述的一种大规模提取用于转染哺乳动物细胞的无内毒素质粒的方法，其特征在于，步骤s3中，层析柱使用前需用缓冲液e平衡。
9.根据权利要求1所述的一种大规模提取用于转染哺乳动物细胞的无内毒素质粒的方法，其特征在于，步骤s6中，有机溶剂为乙醇或异丙醇中的一种或一种以上的混合溶剂。
10.根据权利要求1所述的一种大规模提取用于转染哺乳动物细胞的无内毒素质粒的方法，其特征在于，s3、s4、s5和s6步骤中的离心条件为：4℃，12000g离心10min。
技术总结