本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及样本微生物分子生物学分子检测样本的前处理，具体涉及宿主的肺泡灌洗液、脑脊液、胸腹水、全血等样本的去宿主dna、富集微生物的方法。
背景技术：
宏基因组测序对微生物病原的检测，和传统的培养鉴定方法相比，具有鉴定周期短、覆盖广、操作简易等优势。面对临床很多不明原因的微生物感染鉴定，宏基因组测序覆盖全面的优势也越来越明显。很多病人的感染并不是单一微生物引起的，宏基因组测序得到的微生物之间的相对丰度的信息，为临床医生做出正确的诊疗方案，提供了宝贵的数据支持。
目前高通量测序是宏基因组测序的主力军，包括二代测序和三代测序，但是这两种测序平台都会面临相同的问题，那就是临床样本含有大量的宿主dna，不同类型样本所含宿主dna背景有着较大的差别，以人的临床样本为例，人脑脊液中的人源细胞约为3×104/ml，全血中约有7×106/ml的人源细胞，而胸腹水中约有7×107/ml的人源细胞，假设相同拷贝数的病原菌，出现在以上不同人源背景的溶液中，那对于高通量测序而言，在相同的检测数据量的前提下，将会有几个数量级的检测灵敏度的差异。在高人源dna的背景下，检出低丰度病原菌序列非常困难，更不必说，通过宏基因组测序来做病原微生物的分型和耐药基因等更深入的分析。如何能够高效去除人源dna背景，且最大限度的保留样本溶液中微生物的含量，提高病原微生物的阳性检出率，成为宏基因组测序必须要解决的问题。
目前的去宿主dna方法中，英国的grady教授基于纳米孔测序技术建立了一套去宿主dna的技术路线。该方法，先离心样本溶液得到pbs悬浮液，再通过破坏宿主细胞膜游离宿主dna，然后通过hl-san酶降解宿主dna，再离心收集细菌为主的微生物菌体。整个流程操作繁琐，中间又需要多次离心样本，没法实现自动化流程，多次的离心和pbs清洗难免会对原有的微生物稳态有所破坏，只能收集细菌为主的微生物，对某些微生物的副作用明显，如肺炎链球菌、病毒类等。而目前市场上其他的去宿主dna产品，同样也存在富集微生物不全面、难以实现自动化的问题。目前去宿主方法繁琐，是因为没有一种有效消化宿主dna的方法，裂解细胞后宿主dna的溶液环境复杂，dna很难完全游离在溶液中，不易被dna酶消化。
可见，目前去宿主dna的技术领域亟需一种高效、快速且微生物覆盖全面的，可实现全自动化的去宿主方法。有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明为了克服目前去宿主技术上操作复杂、成本高、费时费力、富集微生物不全面、微生物富集效果不理想、无法实现去宿主流程自动化等缺点，提供一种高效、简易、低成本的快速去宿主dna的试剂盒及方法。
本发明第一个目的是提供一种用于去宿主dna并富集微生物的试剂盒，所述试剂盒包括细胞裂解液、dna酶、消化缓冲液和edta溶液；所述细胞裂解液包括洋地黄皂苷、tween20、tritonx-100、sds和chaps；所述dna酶为turbodnase或benzonase；所述消化缓冲液包括mgcl2、tris，mnso4、bsa、nacl、kcl，mg3(po4)2、cacl2、nh4so4和dtt。
进一步地，所述洋地黄皂苷溶液的质量百分比浓度10％。
进一步地，所述消化缓冲液ph值为6～9。
本发明第二个目的是提供一种一步法去宿主dna并富集微生物的方法，其特征在于，所述方法如下：在待检测样本中同时加入细胞裂解液、dna酶和消化缓冲液；所述细胞裂解液为洋地黄皂苷溶液；所述dna酶为turbodnase或benzonase；所述消化缓冲液包括mgcl2、tris，mnso4、bsa、nacl、kcl，mg3(po4)2、cacl2、nh4so4和dtt；37℃孵育5～30min后加edta溶液灭活；所述方法无需离心和pbs清洗。
宿主细胞结构破坏后，宿主dna始终没有完全游离溶液中，也就难以被dna酶消化降解。目前公开发表的皂苷(saponin)裂解宿主细胞的方法，对微生物的破坏作用较大，只能富集以细菌为主的微生物菌体，而衣原体、支原体、病毒等微生物菌体，因为菌体结构脆弱或是病毒颗粒太小，始终没法得到有效富集。且saponin裂解宿主细胞的方法，不能有效富集某些细菌，如肺炎链球菌。
本发明在去宿主过程使用了洋地黄皂苷(digitonin)溶液进行真核细胞的细胞膜打洞，相比此前公开发表的皂苷，对链球菌的破坏作用更小，有更好的选择性，实际测试能大幅提升链球菌的检出。本发明的一管式消化宿主dna反应体系，大大减小对微生物菌体的破坏，实际检测中能大幅提升肺炎链球菌的检出率，同时能有效富集衣原体、支原体、病毒等微生物菌体。
本发明通过调整缓冲液的配方，使得洋地黄皂苷溶液的细胞膜打洞过程和核酸酶的反应体系在一步内完成，中间过程没有任何离心和清洗的步骤，且操作简单，在20分钟即可完成样本的去宿主dna，提升了效率，并能满足自动化处理的要求。本发明去宿主dna过程中的酶同时使用了turbodnase和benzonase两种不同的核酸酶，对dna的降解效果彻底，同时benzonase具有rna酶活性，能够同时降低宿主的rna，在使用宏基因组测序技术进行rna病原体检测时也能提升rna病毒体的检出灵敏度。
本发明实现了宿主dna游离和降解一步反应完成。一定浓度的去污剂溶液(洋地黄皂苷)能有效裂解宿主细胞，同时，在消化缓冲液中的特定组分(包括一价阳离子、磷酸盐、tris、dtt、镁离子等)作用下，宿主dna能更有效游离于溶液中，且该特定离子环境下，dna酶具有较大的活性，宿主dna游离和降解得以一步反应完成。而去宿主dna的过程中，微生物因为细胞壁、体积小等特点，其自身结构不易被破坏，从而达到高效富集微生物的目的。该方法具备快速、高效、无需离心、可实现全自动化的特点，具有巨大的商业推广价值。
进一步地，所述细胞裂解液添加至待测样本中的终浓度为0.01-1％。
进一步地，所述turbodnase或benzonase在待测样本中的终浓度是5-100u/ml。
进一步地，所述消化缓冲液各组分添加至待测样本中的终浓度是：1～10mmmgcl2、5～50mmtris，0.1～5mmmnso4，0.1-0.5％bsa，0.1-300mmnacl，0.1-300mmkcl，0.1-100mmmg3(po4)2，0.1～5mmcacl2，0.1-300mmnh4so4，0.1～3mmdtt，消化缓冲液ph值为6～9。
进一步地，所述edta溶液添加至待测样本中的终浓度是20mm。
进一步地，在待检测样本中同时加入细胞裂解液、dna酶和消化缓冲液后，37℃孵育15min。
进一步地，所述样本为人源或动物源样本，包括但不限于肺泡灌洗液、脑脊液、胸腹水、全血或痰液。
在一些具体实施方式中，所述样本为感染样本，包括优选为呼吸系统感染样本，所述感染包括8大类微生物：细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体、螺旋体。
在一些具体实施方式中，可选地，所述样本来源于人或动物体。
在一些具体的实施方式中，起始样本用量：取100-200μl的样本于2.0ml离心管底部，不足200μl的样本，用pbs缓冲液补至200μl，待后续处理。
在一些具体实施方式中，去宿主快速流程包括：在200μl的样本溶液中，加入终浓度0.1-1％细胞裂解液，加入16μlbenzonase，248μl消化酶缓冲液，5μlturbodnase，涡旋混匀，将离心管放金属浴，37℃条件反应15分钟。最后加入终浓度20mm的edta溶液，涡旋混匀，将离心管放金属浴，70℃加热5分钟，灭活dna酶。反应终溶液全部用于核酸提取。
在一些具体的实施方式中，所述建库采用以采用杰毅生物公司的宏基因组dna建库试剂盒(可逆末端终止测序法)，货号md001t，核酸纯化试剂盒(磁珠法)md012t。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明方法从样本开始到去宿主dna结束，宿主dna游离和降解一步反应完成，无需离心，无需pbs清洗等复杂操作，在加入edta溶液灭活后，终溶液直接用于提取核酸。操作简单，在20分钟即可完成样本的去宿主dna，提升了效率，并能满足自动化处理的要求。
2、本发明对宿主dna的降解效果彻底，同时还能够降低宿主的rna，在使用宏基因组测序技术进行rna病原体检测时也能提升rna病毒体的检出灵敏度。
3、去宿主dna的过程中，微生物自身结构不易被破坏，能够达到高效富集微生物的目的。
附图说明
图1是传统去除宿主dna的流程图。
图2是本发明一步法去宿主dna并富集微生物的流程图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，下列实施例仅用于说明本发明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
下述实施例和实验例涉及的仪器包括：生物安全柜、illumina二代测序仪、奥盛核酸提取仪、qubit3.0、震荡金属浴、移液器、磁力架、冰箱等。
涉及的试剂包括：digitonin(洋地黄皂苷)溶液、pbs缓冲液、宏基因组dna建库试剂盒(可逆末端终止测序法)、核酸提取试剂盒(磁珠法，室温保存)、核酸纯化试剂盒(磁珠法)md012t、qubittm检测试剂盒、illumina测序芯片等。
具体实施方法步骤如下：
1.去宿主dna步骤
1.1.取200μl混匀的样本于2.0ml离心管底部；
1.2.吸取20μl10％digitonin(洋地黄皂苷)溶液，加入样本溶液中，吸取248μl消化缓冲液，加入样本溶液中，使消化缓冲液各组分的终浓度为：5mmgcl2、15mmtris，2.5mmmnso4，0.5％bsa，100mmnacl，50mmkcl，2.5mmmg3(po4)2，2.5mmcacl2，50mmnh4so4，1.5mmdtt。再依次向样本溶液中加入16μlbenzonase，5μlturbodnase酶，涡旋混匀，将离心管放金属浴，37℃条件反应15分钟；
1.3.吸取20μl0.5medta缓冲液，加入样本溶液中，涡旋混匀，将离心管放金属浴，70℃加热5分钟，待提取核酸；
2.核酸提取
2.1.取auto-pure20b试剂盒放置于试剂盒架上并在7号孔右侧标记标本编号。
2.2.在1号孔中依次加入蛋白酶k溶液20μl、预处理后的样本溶液1ml、裂解液1.5ml及提取磁珠30μl
2.3.(提取磁珠使用前需震荡混匀30s)。注：标本加样请在生物安全柜中进行。
2.4.在2号孔中加入500μl清洗液ⅰ；
2.5.在3号孔中加入500μl清洗液ⅱ；
2.6.在4号孔中加入550μl清洗液ⅲ；
2.7.在7号孔中加入58μl洗脱液(将洗脱液加在孔底，切勿加在孔壁上)；
2.8.将加好试剂的auto-pure20b试剂盒放入奥盛核酸提取仪中，并插入
auto-pure20b磁棒套，关好舱门，运行以下程序；
2.9.待程序结束后，用移液器吸取7号孔中液体至1.5ml离心管中并标记，于4℃暂存待用或于-20±5℃保存以下条件保存。
3.二代pcr-free测序文库制备
3.1.根据下表在管内依次加入试剂。涡旋振荡混匀，瞬离。
3.2.将装有上述反应液的pcr管放入pcr仪中按以下程序进行反应：37℃10分钟，75℃10分钟后反应结束4℃暂存。
3.3.接头连接
各pcr管中分别加入5μl连接酶。再向各pcr管中分别加入30μl接头dna。
将上述混匀后的pcr管放入pcr仪中按以下程序进行反应：20℃15分钟，75℃5分钟后反应结束4℃暂存。
3.4.纯化
吸取40μl平衡后的纯化磁珠至接头连接产物溶液中，充分震荡混匀。室温孵育5～10min。将反应管静置于磁力架上，待溶液澄清后，用移液器小心吸弃上清液体。样品始终置于磁力架上，向反应管中远离磁珠方向加入200μl纯化清洗液，室温孵育30s，用移液器小心吸弃上清。从磁力架上取下pcr管，加入22μlnuclease-freeh2o或纯化洗脱液至离心管中。充分震荡混匀，室温静置5min。将反应管置于磁力架上，待溶液澄清后，转移20μl上清至新的pcr管中，用于后续测序。
4.测序
5.测序数据生信分析
实施例1
随机选取14例临床肺泡灌洗液样本，按照本发明方法和采用皂苷(saponin)去宿主方法进行宏基因组建库和二代测序，以未去宿主处理样本的二代测序结果作为对照。结果如下表。
表1.本发明去宿主方法，saponin去宿主方法，与未去宿主的二代宏基因组测序结果对比表：
表1结果说明：采用本发明的去宿主流程，相比较saponin的去宿主流程能有效富集样本中疱疹病毒、肺炎支原体、肺炎链球菌、鹦鹉热衣原体等各种微生物菌体，且整体微生物丰度提升效果明显。
实施例2
随机收取3例胸腹水临床样本，3例脑脊液临床样本，2例痰液临床样本，按照本发明方法进行宏基因组建库和二代测序，以未去宿主处理样本的二代测序结果作为对照，结果如下表。
表2.本发明流程去宿主方法与未去宿主的二代宏基因组测序结果比较表
结论：本发明的去宿主方法适用于多种类型样本，对人源的肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液、痰液等各种复杂样本均能适用，且能有效富集样本中细菌、病毒、衣原体、支原体等多种微生物菌体，提高测序平台的病原微生物阳性检出率。
1.一种用于去宿主dna并富集微生物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括细胞裂解液、dna酶、消化缓冲液和edta溶液；所述细胞裂解液为洋地黄皂苷溶液；所述dna酶为turbodnase和benzonase；所述消化缓冲液包括mgcl2、tris，mnso4、bsa、nacl、kcl，mg3(po4)2、cacl2、nh4so4和dtt。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，洋地黄皂苷溶液的质量百分比浓度10％。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述消化缓冲液ph值为6～9。
4.一种一步法去宿主dna并富集微生物的方法，其特征在于，所述方法如下：在待检测样本中同时加入细胞裂解液、dna酶和消化缓冲液；所述细胞裂解液为洋地黄皂苷溶液；所述dna酶为turbodnase或benzonase；所述消化缓冲液包括mgcl2、tris，mnso4、bsa、nacl、kcl，mg3(po4)2、cacl2、nh4so4和dtt；37℃孵育5～30min后加edta溶液灭活；所述方法无需离心和pbs清洗。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述细胞裂解液添加至待测样本中的终浓度为0.01-1％。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述turbodnase和benzonase在待测样本中的终浓度是5-100u/ml。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述消化缓冲液各组分添加至待测样本中的终浓度是：1～10mmmgcl2、5～50mmtris，0.1～5mmmnso4，0.1-0.5％bsa，0.1-300mmnacl，0.1-300mmkcl，0.1-100mmmg3(po4)2，0.1～5mmcacl2，0.1-300mmnh4so4，0.1～3mmdtt，消化缓冲液ph值为6～9。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述edta溶液添加至待测样本中的终浓度是20mm。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在待检测样本中同时加入细胞裂解液、dna酶和消化缓冲液后，37℃孵育15min。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述样本为人源或动物源样本，包括但不限于肺泡灌洗液、脑脊液、胸腹水、全血或痰液。
技术总结