本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种sars-cov-2冠状病毒抗体轻链全长序列的扩增方法。
背景技术：
冠状病毒是一类可感染人及多种脊椎动物的单股正链rna病毒，是引起人普通感冒以及上呼吸道感染的重要病原体，严重威胁人类健康。2019年底流行的sars-cov-2冠状病毒具有传播快、疫情重、进展迅速特点。在部分患者中导致呼吸功能进行性障碍并引起死亡。目前对sars-cov-2冠状病毒的药物研究包括疫苗、抗体等。1年多时间内，全球对抗体的研究越来越重视，然而最新发表的研究中对抗体的研发都是基于cdr3片段进行的，这也是抗体有效性弱、研发进展缓慢的一大原因。
因此，亟需一种简单高效的扩增方法能够快速扩增出sars-cov-2冠状病毒抗体轻链全长序列。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种快速、简单、高效的sars-cov-2冠状病毒抗体轻链全长序列的扩增方法。
为实现上述目的，本发明提供一种sars-cov-2冠状病毒抗体轻链全长序列的扩增方法，包括以下步骤：
s1、提取总rna：在sars-cov-2冠状病毒患者或康复患者血液中提取总rna；
s2、反转录反应制备cdna：在该反转录反应中，使用3’端恒定区特异性引物进行反转录，得到包含完整可变区的全长转录本cdna，并且是抗sars-cov-2冠状病毒抗体轻链全长cdna序列；
s3、sars-cov-2冠状病毒抗体轻链全长序列扩增：使用5’端可变区特异性上游引物和3’端恒定区特异性下游引物对上述反转录制备的cdna进行pcr扩增，即获得全长轻链序列。
进一步地，在所述步骤s2中，反转录反应中3’端恒定区特异性引物设计模板sars-cov-2冠状病毒抗体轻链全长核苷酸序列如seqidno：1所示。
进一步地，在所述步骤s2中，反转录反应中sars-cov-2冠状病毒抗体轻链3’端恒定区特异性引物核苷酸序列p1为gggtgaggtgaaagatgagc。
进一步地，在所述步骤s3，sars-cov-2冠状病毒抗体轻链全长序列扩增过程中，使用的5’端可变区特异性上游引物核苷酸序列p2为gtcaggacacagcatggaca。
进一步地，在所述步骤s3，sars-cov-2冠状病毒抗体轻链全长序列扩增过程中，使用的3’端恒定区特异性下游引物核苷酸序列p3为tccctctaacactctcccct。
本发明在反转录过程中，使用3’端恒定区特异性引物进行反转录，获得包含完整可变区的全长转录本cdna。然后，使用5’端可变区特异性上游引物和3’端恒定区特异性下游引物对上述反转录制备的cdna进行pcr扩增，即获得全长轻链序列。
本发明的有益效果：提供了快速、简单、高效的sars-cov-2冠状病毒抗体轻链全长序列的扩增方法，为冠状病毒抗体的深入研究奠定了基础。
附图说明
图1为全长轻链pcr产物琼脂糖电泳图。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
实施例1：
1、sars-cov-2冠状病毒患者或康复患者血液中总rna提取。
取1.0ml全血加入红细胞裂解液，离心去除上清，加入1ml裂解液trizol,室温放置5分钟。加入200µl氯仿震荡15秒，室温放置2分钟后4℃12000rpm离心5分钟。吸取上层澄清液体至一干净无rna酶的离心管，加入等体积异丙醇混匀，室温放置5分钟，4℃12000rpm离心5分钟。丢弃上清加入1ml75%乙醇，上下颠倒lmin,4℃12000rpm离心5分钟。丢弃上清室温干燥5分钟，加入40ul无rna酶水充分溶解rna,获得rna冻存于-80℃待用。
2、反转录反应制备cdna。
在该反转录反应中，使用3’端恒定区特异性引物进行反转录，3’端恒定区特异性引物核苷酸序列p1为gggtgaggtgaaagatgagc，得到包含完整可变区的全长转录本cdna，并且是抗sars-cov-2冠状病毒抗体轻链全长cdna序列。反转录使用smarterpcrcdnasynthesiskit（clontech）试剂盒，反应体系按照试剂盒说明书配置，反应条件为42℃孵育90分钟，在70℃下10分钟终止反应，然后加入90μlelutionbuffer(eb)稀释。
3、sars-cov-2冠状病毒抗体轻链全长序列扩增。
使用5’端可变区特异性上游引物和3’端恒定区特异性下游引物对上述反转录制备的cdna进行pcr扩增，即获得全长轻链序列。使用的5’端可变区特异性上游引物核苷酸序列p2为gtcaggacacagcatggaca。使用的3’端恒定区特异性下游引物核苷酸序列p3为tccctctaacactctcccct。
使用的pcr酶为primestargxldnapolymerase（clontech），反应条件
●初始变性：
-98°c30秒
●在以下温度和时间下进行10次循环：
-98°c10秒
-65°c，持续15秒
-68°c，10分钟
●最终延期：
-68°c，5分钟
如图1所示，pcr产物金1%琼脂糖电泳显示，成功扩增出全长轻链基因。
seqidno：1
atgggggtccccgctcagctcctggggctcctgctgctctggctccccggtgccagatgtgacatccagatgacccagtctccttcgaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggccagtcacagcgttgatacctggttggcctggtatcaacacagaccagggaaggcccctaagcccctgatctataaggcatctaaattagaacctggggtcccaccgaggttcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttattactgccaacaatatagtactttttggacgttcggccaagggactaaagtagaagtcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明做任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下，还有其他的变体和改型。
1.一种sars-cov-2冠状病毒抗体轻链全长序列的扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1、提取总rna：在sars-cov-2冠状病毒患者或康复患者血液中提取总rna；
s2、反转录反应制备cdna：在该反转录反应中，使用3’端恒定区特异性引物进行反转录，得到包含完整可变区的全长转录本cdna，并且是抗sars-cov-2冠状病毒抗体轻链全长cdna序列；
s3、sars-cov-2冠状病毒抗体轻链全长序列扩增：使用5’端可变区特异性上游引物和3’端恒定区特异性下游引物对上述反转录制备的cdna进行pcr扩增，即获得全长轻链序列。
2.根据权利要求1所述的sars-cov-2冠状病毒抗体轻链全长序列的扩增方法，其特征在于：在所述步骤s2中，反转录反应中3’端恒定区特异性引物设计模板sars-cov-2冠状病毒抗体轻链全长核苷酸序列如seqidno：1所示。
3.根据权利要求1所述的sars-cov-2冠状病毒抗体轻链全长序列的扩增方法，其特征在于：在所述步骤s2中，反转录反应中sars-cov-2冠状病毒抗体轻链3’端恒定区特异性引物核苷酸序列p1为gggtgaggtgaaagatgagc。
4.根据权利要求1所述的sars-cov-2冠状病毒抗体轻链全长序列的扩增方法，其特征在于：在所述步骤s3，sars-cov-2冠状病毒抗体轻链全长序列扩增过程中，使用的5’端可变区特异性上游引物核苷酸序列p2为gtcaggacacagcatggaca。
5.根据权利要求1所述的sars-cov-2冠状病毒抗体轻链全长序列的扩增方法，其特征在于：在所述步骤s3，sars-cov-2冠状病毒抗体轻链全长序列扩增过程中，使用的3’端恒定区特异性下游引物核苷酸序列p3为tccctctaacactctcccct。
技术总结