本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及用于提高腺相关病毒反向末端重复序列复制效率的试剂、腺相关病毒dna复制方法、应用。
背景技术：
腺相关病毒(adeno-associatedvirus,aav)是一种复制缺陷性dna病毒，仅由3种包被蛋白和一条dna单链构成。它的复制需要辅助病毒如腺病毒或疱疹病毒的协助。aav基因组为线型单链dna，每条单链dna由4680个碱基构成，包括两端各145nt的反向末端重复(invertedterminalrepeat，itr)序列和中间的2个开放性阅读框(openreadingframe)。两端的itr是aav复制、包装所必需的起顺式作用的病毒元件。itr序列中cg含量达70％以上。itr序列中与内部开放性阅读框相邻的是长20nt的非互补配对序列，其后的125nt形成三段回文结构，共同形成t形发夹结构。itr序列内部的两个开放性阅读框为rep基因和cap基因，分别编码与aav复制相关的rep蛋白和病毒外壳蛋白cap蛋白。切除rep和cap基因序列后插入其它目的基因dna构成的重组aav(raav)表达载体已广泛应用于生命科学和临床医学的研究。raav载体具有安全性高、免疫原性低、物理性质稳定、感染细胞谱广等优点，因此被认为是最有发展潜力的基因治疗载体之一。
在实际的研究工作中，raav载体需要以dna质粒的形式在大肠杆菌等宿主细胞中进行复制扩增。然而特殊的具有很高热稳定性的t形发夹结构使itr序列在复制过程中出现点突变或缺失的错误率大幅提高。由于itr在raav病毒颗粒的包装过程中所起的关键作用，存在突变或缺失的itr会增加带有缺陷的病毒颗粒的产生(包括未包装dna的空病毒颗粒、带有宿主细胞蛋白的病毒颗粒以及包装了非raavdna的病毒颗粒等)，进而降低所生产的病毒颗粒的质量和产量。特别是将raav载体作为基因治疗药物或者核酸疫苗时，为了保障此类直接用于人体的医用产品的安全性，必须确保作为活性药物成分的raavdna在不同批次的产品中完全一致。
目前，鉴定raav载体中itr的准确性的主要方法是限制性内切酶酶切法，通过酶切片段的大小和数量来判断。但是由于凝胶电泳的分辨率较低，很难检测到点突变或小缺失，因此不能充分保证鉴定的准确性。而直接对itr区域进行测序可以提供足够的分辨率，但是具有超高热稳定性的t形发夹结构对常规sanger测序具有很强的抑制作用，往往会导致测序失败。同时，t形发夹结构还会抑制以itr为靶序列的pcr反应(如在raav载体的生产流程中对raavdna的精确定量等)，造成pcr反应效率的大幅降低甚至扩增失败，进而影响后续工作。t形发夹结构对itr的测序和pcr反应的不利影响是由于在反应的退火阶段，温度快速降低，t形发夹结构由于动力学优势先于引物与模板的杂交产物形成。该t形发夹结构在引物延伸阶段会阻碍核酸聚合酶对引物的延伸，造成反应的提前终止或反应效率的降低。为了克服上述困难，目前的常用方法有两种。一种是大幅提高测序或pcr反应的模板用量，但在很多场景下，raav模板非常珍贵，提高模板用量难以实现。另一种方法是向测序或pcr反应体系中加入能够降低分子内二级结构稳定性的添加剂，如二甲基亚砜(dmso)或甜菜碱(betaine)等化合物，但是此类化合物本身会提高测序和pcr扩增的错误率，使得最终难以保证所得结果如实反映原始模板的序列。此外，上述两种方法均会大大提高实验成本。因此，开发一种本身不提高错误率、成本低、能够有效解决itr序列在测序和pcr反应中遇到的困难的实验方法对推广raav载体在生命科学的基础研究和临床医学领域的应用具有重大意义。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明提供用于提高腺相关病毒itr序列的复制效率的试剂，破坏腺相关病毒单链模板中t形发夹结构的热稳定性，消除t形发夹结构对腺相关病毒相应分子生物学技术产生的不利影响。
为了实现以上目的，本发明通过以下技术方案实现。
本发明提供提高腺相关病毒itr序列的复制效率的试剂，所述试剂为寡聚核苷酸链，依次包括：
特异性序列，至少包括用以与itr序列t形发夹结构长茎回文靠近5’端的第一侧茎的部分或全部序列段互补配对的第一序列，及用以与t形发夹结构第一侧茎相邻的部分第一非互补配对序列段互补配对的第二序列；第一序列与第二序列相邻；
末端修饰结构，用以阻止所述特异性序列的3’端通过核酸聚合酶而延伸。
优选地，所述特异性序列还包括与所述t形发夹结构短茎回文靠近所述第一侧茎的第二侧茎的部分或全部序列段互补配对的第三序列。
优选地，所述末端修饰结构包括小沟结合物、倒置dna核苷酸、c3间隔区、及不与腺相关病毒模板杂交的寡聚核苷酸链。
优选地，所述试剂合成单体包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、锁定的核苷酸、非天然核苷酸；若干单体间连接方式包括磷酸二酯键连接或肽键连接。
优选地，所述第一序列与所述第三序列的总长度为4～46nt；所述第二序列长度为4～46nt。
本发明的第二个目的是提供一种腺相关病毒dna复制方法，在腺相关病毒dna的复制体系中添加如上所述的用于提高腺相关病毒itr序列的复制效率的试剂，通过试剂破坏所述腺相关病毒dna单链itr序列形成的t形发夹结构内的碱基配对，以消减分子内t形发夹结构对核酸聚合酶的阻碍作用。
优选地，具体包括步骤：在腺相关病毒dna的复制反应开始前，向反应体系中加入所述试剂；所述试剂的反应起始浓度为0.01μm～5μm。
优选地，当复制反应体系中包括两种互补配对的模板时，添加两种分别与两互补配对的模板相匹配的试剂或添加一种与一所述模板相匹配的试剂。
优选地，还包括步骤：改变试剂特异性序列总长度以调整所述试剂消减t形发夹结构对核酸聚合酶的阻碍作用。
本发明的第三个目的是提供如上所述的用于提高腺相关病毒itr序列的复制效率的试剂或如上所述的腺相关病毒dna复制方法在以腺相关病毒为模板的pcr反应或测序反应中的应用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明提供的用于提高腺相关病毒itr序列的复制效率的试剂，包括特异性序列与末端修饰结构。特异性序列至少包括第一序列、第二序列，用以与腺相关病毒itr序列的t形发夹结构相竞争，形成特异性序列与腺相关病毒单链dna模板的杂交产物，同时解链该模板中t形发夹结构，以在引物延伸过程中消除模板中t形发夹结构对核酸聚合酶的阻碍作用，使得通过聚合酶合成新的腺相关病毒核酸分子的分子生物学技术工作得以顺利开展。此外，解链剂结构简单、制造成本低、解链效率高。
本上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明一实施例中raav的itr序列与解链剂的匹配关系示意图；
图2为本发明一实施例中raav的itr序列为模板在解链剂下的pcr反应流程图；
图3为本发明一实施例中raav载体质粒中包含itr序列区间的两条互补链的结构示意图；
图4为本发明一实施例中raav载体质粒两条互补单链分别与正向disruptorf5、反向disruptorr5的匹配关系示意图；
图5为本发明一实施例中加入不同浓度的实验组5解链剂对时，以某市售raav载体质粒为模板、扩增其itr序列的荧光定量pcr反应结果；
图6为本发明一实施例中对图5实验的荧光定量pcr终产物进行3％琼脂糖凝胶电泳实验的结果；
图7为本发明一实施例中不加解链剂及加入第一序列和第二序列长度相同的6对解链剂的raav-itr荧光定量pcr实验结果；
图8对图7实验的荧光定量pcr终产物进行3％琼脂糖凝胶电泳实验的结果；
图9为本发明一实施例中raav载体质粒两条互补单链分别与正向disruptorf12、反向disruptorr12的匹配关系示意图；
图10为本发明一实施例中不加解链剂及加入第一序列长度为20nt、第二序列长度不同的10对解链剂的raav-itr荧光定量pcr实验结果；
图11对图10实验的荧光定量pcr终产物进行3％琼脂糖凝胶电泳实验的结果。
图中：11、长茎回文；111、第一侧茎；12、第一短茎回文；121、第二侧茎；13、第二短茎回文；14、第一非互补配对序列；
20、解链剂；21、第一序列；22、第二序列；23、末端修饰结构。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，本发明的前述和其它目的、特征、方面和优点将变得更加明显，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。在附图中，为清晰起见，可对形状和尺寸进行放大，并将在所有图中使用相同的附图标记来指示相同或相似的部件。在下列描述中，诸如中心、厚度、高度、长度、前部、背部、后部、左边、右边、顶部、底部、上部、下部等用词为基于附图所示的方位或位置关系。特别地，“高度”相当于从顶部到底部的尺寸，“宽度”相当于从左边到右边的尺寸，“深度”相当于从前到后的尺寸。这些相对术语是为了说明方便起见并且通常并不旨在需要具体取向。涉及附接、联接等的术语(例如，“连接”和“附接”)是指这些结构通过中间结构彼此直接或间接固定或附接的关系、以及可动或刚性附接或关系，除非以其他方式明确地说明。
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
在pcr或测序反应的退火阶段，温度快速降低，raav的itr序列的t形发夹结构由于动力学优势先于引物与模板的杂交产物形成。该t形发夹结构的热稳定性很高，在延伸阶段会阻碍核酸聚合酶对引物的延伸，造成反应的提前终止或反应效率的降低。
本发明提供用于提高腺相关病毒itr序列的复制效率的试剂，所述试剂(解链剂，英文disruptor)为寡聚核苷酸链，依次包括：
特异性序列，至少包括用以与itr序列t形发夹结构长茎回文靠近5’端的第一侧茎的部分或全部序列段互补配对的第一序列，及用以与t形发夹结构中与所述第一侧茎相邻的部分第一非互补配对序列段互补配对的第二序列；且第一序列与第二序列相邻；具体地，如图1所示，itr序列由145个碱基构成，其中125nt形成双链的长发卡-回文结构，该长发卡-回文结构由一个长茎回文11和两个短茎回文(第一短茎回文12和第二短茎回文13)组成，剩余20nt未形成互补配对结构，共同形成了t形发夹结构；t形发夹结构的长茎回文11靠近itr序列5’端的侧茎为第一侧茎111，t形发夹结构中靠近itr序列5’端的一短茎回文为第一短茎回文12，t形发夹结构中靠近itr序列3’端的一短茎回文为第二短茎回文13；第一短茎回文靠近第一侧茎的侧茎为第二侧茎121；与第一侧茎111的5’端相邻的非互补配对序列段，记为第一非互补配对序列14；解链剂20的特异性序列至少包括第一序列21、第二序列22，第一序列21用以与t形发夹结构的长茎回文相竞争，第一序列21与长茎回文的第一侧茎111互补配对，进而破坏了原先t形发夹结构中的长茎回文11双链；第二序列22与第一非互补配对序列14部分序列互补配对，形成的碱基对结构使得解链剂与itr序列形成的杂交产物更稳定；即特异性序列可以解开腺相关病毒itr序列的t形发夹结构的局部互补配对结构，命名该试剂为解链剂；下文均以解链剂来阐述本发明所述试剂，但不可因解链剂的文字描述来限定本发明的试剂的用途。通过延长解链剂中第二序列的长度，增加解链剂与腺相关病毒dna第一非互补配对序列14的互补配对长度，以提高解链剂与腺相关病毒dna单链杂交形成的双链产物的热稳定性，进而增加解链剂与itr序列t形发夹结构的竞争能力，以免逆反应重新形成t形发夹结构。当解链剂与itr序列t形发夹结构竞争并形成相应的杂交产物，腺相关病毒dna单链还剩下12和13两个短茎回文，这两个短茎回文的热稳定性已不足以阻碍核酸聚合酶的进一步延伸。
末端修饰结构，用以阻止所述特异性序列的3’端通过核酸聚合酶而延伸。具体地，在退火阶段，引物与模板互补结合形成杂交链，然后在核酸聚合酶作用下以互补配对的方式依次将dntp加至引物的3’端，使杂交双链不断延伸以形成新的dna双链，在延伸过程中，解链剂的末端修饰结构能够防止特异性序列的3’端在核酸聚合酶作用下继续延伸。如图1所示，为一实施例中raav的itr与解链剂匹配示意图，解链剂包括第一序列21、第二序列22、末端修饰结构23。
在一实施例中，所述特异性序列还包括与所述t形发夹结构短茎回文靠近所述第一侧茎的第二侧茎的部分或全部序列段互补配对的第三序列，即特异性序列还包括与第一短茎回文12的第二侧茎121的部分或全部序列段互补配对的第三序列(图中未示出)，以提高对t形发夹结构的解链程度，缩小解链后腺相关病毒dna单链上的短茎回文结构或消除整个t形发夹结构双链区域。
在一实施例中，所述末端修饰结构包括小沟结合物(minorgroovebinder)、倒置dna核苷酸(inverteddnanucleotide)、c3间隔区(c3spacer)、与所述模板不杂交的寡聚核苷酸链等可以阻止单链核酸的3’端通过核酸聚合酶而延伸的化学修饰基团。具体地，在一实施例中，小沟结合物是一种可以非共价结合到双链dna小沟中的化学基团，可以阻止所述特异性序列的3’端通过核酸聚合酶而延伸。在又一实施例中，c3间隔区即3-碳间隔区，通过在解链剂中引进一个间隔区从而阻止所述特异性序列的3’端通过核酸聚合酶而延伸。在又一实施例中，通过在特异性序列的3’端设置与腺相关病毒模板不互补配对的寡聚核苷酸链，以防止核酸聚合酶延伸。
在一实施例中，所述试剂合成单体包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、非天然核苷酸。其中，非天然核苷酸表示人工合成的、非天然存在的核苷酸，包括但不限于化学修饰的核苷酸，如锁定的核苷酸(lockednucleotide)、吗啉代核苷酸(morpholinonucleotide)、己糖醇核苷酸(hexitolnucleotide)、核酮糖核苷酸(ribulosenucleotide)、氟代核苷酸(fluorinatednucleotide)、烷基核苷酸(alkylatednucleotide)、硫代磷酸核苷酸(phosphorothioatenucleotide)等。若干单体间连接方式包括但不限于磷酸二酯键或肽键，其中，磷酸二酯键和肽键包括天然的或人工合成的。
在一实施例中，所述第一序列与所述第三序列的总长度为4～46nt。在一实施例中，所述第二序列长度为4～46nt。通过限定第一序列与第三序列的总长度、及第二序列长度，以保证解链剂解链itr序列t形发夹结构双链区域的效率及与腺相关病毒dna单链杂交产物的稳定性。
实施例2
本发明提供一种腺相关病毒dna复制方法，在腺相关病毒dna复制体系中添加如上所述的用于破坏腺相关病毒itr序列t形发夹结构的试剂，通过该试剂破坏所述腺相关病毒dna单链itr序列t形发夹结构内的碱基配对，以避免在延伸阶段itr序列t形发夹结构阻碍核酸聚合酶对引物的延伸，即消减分子内t形发夹结构对核酸聚合酶的阻碍作用，以提高核酸片段复制效率。
在一实施例中，具体包括步骤：在腺相关病毒dna复制反应开始前，向反应体系中加入所述试剂；所述试剂的反应起始浓度为0.01μm～5μm。
进一步地，还包括步骤：改变试剂特异性序列总长度以调整所述试剂消减t形发夹结构对核酸聚合酶的阻碍作用。具体地，通过增减解链剂的特异性序列总长度，找出对相应腺相关病毒dna单链模板匹配的解链剂的最佳长度，以提高解链剂解链相应单链核酸模板分子内t形发夹结构的程度。
当复制反应体系中包括两种互补配对的模板时，添加两种分别与两互补配对的模板相匹配的试剂或添加一种与一所述模板相匹配的试剂。当添加两种分别与两互补配对的模板相匹配的试剂时，可同时提高两种模板核酸复制效率；当添加一种与一所述模板相匹配的试剂时，可提高该模板核酸复制效率。具体地，当反应体系中存在两种互补dna单链模板，即可只添加与一种dna单链模板相匹配的解链剂，也可同时添加两种分别与两条互补配对的模板单链相匹配的解链剂，如pcr反应。当反应体系中仅有一种dna单链模板时，添加一种相匹配的解链剂，如测序反应。
在一实施例中，以荧光定量pcr反应为例，具体包括以下步骤：
(1)准备所需试剂，室温融化后充分混匀；
(2)配置反应溶液，包括聚合酶、四种dntp混合物、正向引物、反向引物、正向解链剂、反向解链剂、某市售raav载体质粒dna模板以及pcr缓冲液；
(3)开启pcr反应。其中，正向解链剂、反向解链剂分别用于两条互补单链模板的匹配。
具体地，包括步骤：提前将所需试剂取出，室温融化后充分混匀。按照已经确定的反应体系配制反应溶液：1xpcr缓冲液，4mmmg2 ，0.06u/μltaq聚合酶，0.3mm四种dntp混合物，0.2μm正向引物，0.2μm反向引物，0.1μm荧光探针，0.2至5μm正向disruptor和相同浓度的反向disruptor，以及3000拷贝/反应某市售raav载体质粒dna。不加disruptor的实验作为对照。pcr的反应程序为：95℃15分钟激活taq聚合酶，45个循环的95℃变性10秒、54℃退火30秒并读取荧光和72℃延伸20秒，4℃降温1分钟。其中，在一实施例中，图3为某市售raav载体质粒dna结构，图4为总长度为36nt的正向disruptor、反向disruptor分别与某市售raav载体质粒dna匹配关系图。正向引物序列为seqidno：1；反向引物序列为seqidno：2；荧光探针序列为seqidno：3；正向disruptor序列为seqidno：4；反向disruptor序列为seqidno：5。所述seqidno：1具体为gtaaccacgtgcggaccgag。所述seqidno：2具体为tgtcgagactgcaggctctag。所述seqidno：3具体为tcgaaagcggccgcgactagt。所述seqidno：4具体为gagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactcataa。所述seqidno：5具体为gagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggggccctaaaaa。正向disruptor及反向disruptor的末端修饰结构为四个不与模板互补的碱基以阻碍相应解链剂被dna聚合酶延伸，该方法简单有效、成本低。正向disruptor及反向disruptor的特异性序列总长度均为36nt，且相应特异性序列的第一序列、第二序列长度均为18nt，相应解链剂与相应模板的itr序列的第一侧茎部分序列、第一非互补配对序列部分序列段互补配对。
pcr反应原理如图2所示，以某市售raav载体质粒的单链dna模板为例，在反应体系中加入一种解链剂。在降温和退火阶段，引物与某市售raav载体质粒的单链dna模板的3’端互补配对；同时，解链剂与raav的itr序列中的t形发夹结构相竞争，形成特异性序列与模板的杂交产物同时解链模板中t形发夹结构，在聚合酶作用下，引物继续延伸合成双链产物。引物继续延伸过程中，不同核酸聚合酶抵达disruptor和模板的配对区域时，可通过不同机制(如taq聚合酶可以通过其5’-3’外切酶活性逐步降解disruptor)打破这一配对结构，进而完成完整的双链产物的合成。图2中，解链剂的第一序列为第一侧茎的下部分序列，第二序列为第一非互补配对序列靠近第一侧茎的部分序列，解链剂与dna单链模板杂交后，剩下第一短茎回文12和第二短茎回文13两个短茎回文，两个短茎回文的热稳定性已不足以阻碍核酸聚合酶的进一步延伸。
实施例3
本发明提供如上所述的用于提高腺相关病毒itr序列的复制效率的试剂或如上所述的腺相关病毒dna复制方法在以腺相关病毒为模板的pcr反应或测序反应中的应用。由核酸聚合酶合成新的核酸分子的分子生物学方法中均可应用上述解链剂或如上所述的腺相关病毒dna复制方法，通过解链剂解链腺相关病毒dna单链模板中t形发夹结构，消除因高热稳定性的t形发夹结构对延伸过程中的核酸聚合酶的阻碍作用。
为了阐述本文的发明，以下以具体实施例进行阐述。应当理解这些实施例仅用于说明性目的并且不应被理解为以任何方式限制本发明。
实施例4
加入解链剂可以提高扩增raav载体质粒的itr(raav-itr)序列的pcr反应效率
(1)根据某市售raav载体质粒的itr序列经mfold软件预测的t形发夹结构设计荧光定量pcr反应的引物、探针和disruptor。其中，图4为某市售raav载体质粒两条单链中itr及其周边序列经mfold软件预测的t形发夹结构及正向解链剂、反向解链剂的匹配关系图。实线标记正向和反向引物的互补配对序列；虚线标记荧光探针的互补配对序列；模板中灰色字体标记相应模板序列中与相应解链剂互补配对的序列。
具体地，荧光定量pcr反应中各反应物的序列如下：正向引物的序列为seqidno：1；反向引物的序列为seqidno：2；荧光探针在5’端标记fam荧光基团，在3’端标记bhq1淬灭基团，序列为seqidno：3；正向disruptor的序列为seqidno：4；反向disruptor的序列为seqidno：5。在实施案例中，disruptor的3’端增加了四个不与靶序列互补的碱基以阻碍其被dna聚合酶延伸，这种方法简单经济有效。正向disruptor及反向disruptor的特异性序列总长度均为36nt，相应解链剂与相应模板的itr序列的第一侧茎部分序列、第一非互补配对序列部分序列互补配对。
(2)荧光定量pcr反应：提前将所需试剂取出，室温融化后充分混匀。按照已经确定的反应体系配制反应溶液：1xpcr缓冲液，4mmmg2 ，0.06u/μltaq聚合酶，0.3mm四种dntp混合物，0.2μm正向引物(seqidno：1)，0.2μm反向引物(seqidno：2)，0.1μm荧光探针(seqidno：3)，正向disruptor(seqidno：4)和相同浓度的反向disruptor(seqidno：5)，以及3000拷贝/反应某市售raav载体质粒dna。分别配置六个实验组，六个实验组中正向disruptor初始反应浓度分别为0.2μm、0.5μm、1μm、2μm、3μm、5μm。另外不加disruptor的实验作为对照。pcr的反应程序为：95℃15分钟激活taq聚合酶，45个循环的95℃变性10秒、54℃退火30秒并读取荧光和72℃延伸20秒，4℃降温1分钟。
(3)荧光定量pcr产物的电泳分析：混匀10μlpcr产物和1.5μl加样缓冲液，在3％的琼脂糖凝胶上于90v电压下电泳50分钟。
(4)图5为在反应体系中加入不同浓度的特异性序列长36nt的一对disruptor的情况下，以某市售raav载体质粒为模板、扩增其itr序列的荧光定量pcr反应结果。图6为对图5实验的荧光定量pcr终产物进行3％琼脂糖凝胶电泳实验的结果。在disruptor浓度为5μm时，由于反应体系中寡聚核苷酸浓度过高，寡聚核苷酸之间形成了二聚体，反而对pcr反应产生了一定的抑制作用。如图5、图6所示，某市售raav载体质粒itr序列的pcr扩增反应在没有disruptor的条件下，pcr反应效果很差，定量pcr结果ct值很高，达到42.3，在凝胶电泳实验中则观测不到产物条带。当向反应体系中加入不同浓度的同一对特异性序列长为36nt的disruptor时，随着disruptor浓度逐步升高至3μm，pcr反应检出的ct值逐步降低至33.9，凝胶电泳实验中的产物条带亮度也逐步加强。但当disruptor浓度达到5μm时，与3μmdisruptor浓度的实验条件比，ct值反而升高至36.8，凝胶电泳实验中的产物条带亮度也有所变暗。这一结果表明对于itr序列的t形发夹结构来说，在一定范围内，添加的disruptor浓度越高，pcr反应的检测效果越好。但当disruptor浓度过高时，由于反应体系中寡聚核苷酸的总浓度过高形成的寡聚核苷酸二聚体反而会抑制pcr反应。因此，利用disruptor消除t形发夹结构对raav-itr的pcr反应的抑制作用时，加入的disruptor存在一个最佳的浓度区间，并不是disruptor浓度越高效果越好。
实施例5
不同长度的解链剂对raav-itr的pcr反应的影响
(1)根据mfold软件预测的某市售raav载体质粒的t形发夹结构设计一组不同长度的disruptor，本实施例中以解链剂的特异性序列包括第一序列、第二序列的解链剂为例，其中每一个disruptor的特异性序列由等长的两个部分组成，即解链剂的第一序列与第二序列长度相等。图4是以第一序列和第二序列长度均为18nt的正向解链剂和反向解链剂(即相应disruptor长度为18 18)为例，某市售raav载体质粒两条单链中itr及其周边序列经mfold软件预测的t形发夹结构与正向解链剂和反向解链剂的匹配关系图。
具体地，在一实施例中，正向disruptorf1、反向disruptorr1中相应的第一序列、第二序列长度均为10nt(即相应disruptor长度为10 10)，作为实验组1的解链剂对。正向disruptorf1序列为seqidno：6；反向disruptorr1序列为seqidno：11。
seqidno：6具体为gagcgcgcagagagggagtgaaat；
seqidno：11具体为gagcgcgcagctgcctgcagaaaa。
在又一实施例中，正向disruptorf2、反向disruptorr2中相应的第一序列、第二序列长度均为12nt(即相应disruptor长度为12 12)，作为实验组2的解链剂对。正向disruptorf2序列为seqidno：7；反向disruptorr2序列为seqidno：12。
seqidno：7具体为gcgagcgcgcagagagggagtggcatta；
seqidno：12具体为gcgagcgcgcagctgcctgcagggaaaa。
在又一实施例中，正向disruptorf3、反向disruptorr3中相应的第一序列、第二序列长度均为14nt(即相应disruptor长度为14 14)，作为实验组3的解链剂对。正向disruptorf3序列为seqidno：8；反向disruptorr3序列为seqidno：13。
seqidno：8具体为gagcgagcgcgcagagagggagtggccataaa；
seqidno：13具体为gagcgagcgcgcagctgcctgcaggggcaaat。
在又一实施例中，正向disruptorf4、反向disruptorr4中相应的第一序列、第二序列长度均为16nt(即相应disruptor长度为16 16)，作为实验组4的解链剂对。正向disruptorf4序列为seqidno：9；反向disruptorr4序列为seqidno：14。
seqidno：9具体为gcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaacaaat；
seqidno：14具体为gcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggggcccataa。
在又一实施例中，正向disruptorf5、反向disruptorr5中相应的第一序列、第二序列长度均为18nt(即相应disruptor长度为18 18)，作为实验组5的解链剂对。正向disruptorf5序列为seqidno：4；反向disruptorr5序列为seqidno：5。
seqidno：4具体为gagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactcataa；
seqidno：5具体为gagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggggccctaaaaa。
在又一实施例中，正向disruptorf6、反向disruptorr6中相应的第一序列、第二序列长度均为20nt(即相应disruptor长度为20 20)，作为实验组6的解链剂对。正向disruptorf6序列为seqidno：10；反向disruptorr6序列为seqidno：15。
seqidno：10具体为gtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccaaata；seqidno：15具体为gtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggggccctacgaaat。
在上述实施例中，每个disruptor的3’端增加了四个不与靶序列互补配对的碱基以阻碍其被dna聚合酶延伸，这种方法简单经济有效。
(2)荧光定量pcr反应：提前将所需试剂取出，室温融化后充分混匀。按照已经确定的反应体系配制反应溶液：1xpcr缓冲液，4mmmg2 ，0.06u/μltaq聚合酶，0.3mm四种dntp混合物，0.2μm正向引物(seqidno：1)，0.2μm反向引物(seqidno：2)，0.1μm荧光探针(seqidno：3)；正向disruptor(seqidno：4和seqidno：6至10中的一个)和相匹配的反向disruptor各2μm，以分别形成实验组1至实验组6六个组别的解链剂对；以及3000拷贝/反应某市售raav载体质粒dna。不加disruptor的实验作为对照。pcr的反应程序为：95℃15分钟激活taq聚合酶，45个循环的95℃变性10秒、54℃退火30秒并读取荧光和72℃延伸20秒，4℃降温1分钟。
(3)荧光定量pcr产物的电泳分析：混匀10μlpcr产物和1.5μl加样缓冲液，在3％的琼脂糖凝胶上于90v电压下电泳50分钟。
(4)图7为在反应体系中加入2μm不同长度disruptor对的raav-itr荧光定量pcr实验结果与不加disruptor的实验结果对比。图8为对图7实验的荧光定量pcr终产物进行3％琼脂糖凝胶电泳实验的结果。在没有disruptor的反应条件下，pcr反应效果很差，定量pcr结果ct值很高，达到43.6，在凝胶电泳实验中则观测不到产物条带。向反应体系中加入2μm的第一序列和第二序列长度均为10nt(即相应disruptor长度为10 10)的disruptor对时，pcr反应效果没有明显改观，定量pcr结果ct值仅降至43.0，在凝胶电泳实验中仍观测不到产物条带。但随着disruptor对的长度进一步加长，pcr反应检出的ct值大幅度降低，凝胶电泳实验中观测到的产物条带亮度也逐步加强。当向反应体系中加入正向disruptor、反向disruptor中相应的第一序列、第二序列长度均为18nt(即相应disruptor长度为18 18)及均为20nt(即相应disruptor长度为20 20)的解链剂对时，定量pcr结果ct值依次降至34.8和34.5，显示出趋于稳定的趋势，且在凝胶电泳实验中观测到的产物条带的亮度也基本保持不变。这一结果表明，对于第一序列与第二序列长度相等的解链剂对，并不是越长越好，在本实验条件下，正向disruptor、反向disruptor中相应的第一序列、第二序列长度均为20nt(即相应disruptor长度为20 20)时对提高raav-itrpcr反应效率的作用基本上已经达到了最大。
实施例6
仅改变解链剂第二序列长度对raav-itr的pcr反应的影响
(1)根据mfold软件预测的某市售raav载体质粒的t形发夹结构设计一组不同长度的disruptor。每一个disruptor序列由两个部分组成：第一序列长度固定为20nt，第二序列长度不定。图9是以第一序列长度为20nt、第二序列长度为12nt的正向解链剂和反向解链剂(即相应disruptor长度为20 12)为例，某市售raav载体质粒两条单链中itr及其周边序列经mfold软件预测的t形发夹结构与正向解链剂和反向解链剂的匹配关系图。
具体地，在一实施例中，正向disruptorf7、反向disruptorr7中相应的第一序列均为20nt，正向disruptorf7、反向disruptorr7中相应的第二序列长度均为4nt(即相应disruptor长度为20 4)，作为实验组7的解链剂对。正向disruptorf7序列为seqidno：16；反向disruptorr7序列为seqidno：25。
seqidno：16具体为gtgagcgagcgagcgcgcagagagtaaa；
seqidno：25具体为gtgagcgagcgagcgcgcagctgcaaaa。
在又一实施例中，正向disruptorf8、反向disruptorr8中相应的第一序列均为20nt，正向disruptorf8、反向disruptorr8中相应的第二序列长度均为6nt(即相应disruptor长度为20 6)，作为实验组8的解链剂对。正向disruptorf8序列为seqidno：17；反向disruptorr8序列为seqidno：26。
seqidno：17具体为gtgagcgagcgagcgcgcagagagggtaaa；
seqidno：26具体为gtgagcgagcgagcgcgcagctgcctaata。
在又一实施例中，正向disruptorf9、反向disruptorr9中相应的第一序列均为20nt，正向disruptorf9、反向disruptorr9中相应的第二序列长度均为8nt(即相应disruptor长度为20 8)，作为实验组9的解链剂对。正向disruptorf9序列为seqidno：18；反向disruptorr9序列为seqidno：27。
seqidno：18具体为gtgagcgagcgagcgcgcagagagggagaata；
seqidno：27具体为gtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgctaaa。
在又一实施例中，正向disruptorf10、反向disruptorr10中相应的第一序列均为20nt，正向disruptorf10、反向disruptorr10中相应的第二序列长度均为10nt(即相应disruptor长度为20 10)，作为实验组10的解链剂对。正向disruptorf10序列为seqidno：19；反向disruptorr10序列为seqidno：28。
seqidno：19具体为gtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtgaata；
seqidno：28具体为gtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcagaaaa。
在又一实施例中，正向disruptorf11、反向disruptorr11中相应的第一序列均为20nt，正向disruptorf11、反向disruptorr11中相应的第二序列长度均为11nt(即相应disruptor长度为20 11)，作为实验组11的解链剂对。正向disruptorf11序列为seqidno：20；反向disruptorr11序列为seqidno：29。
seqidno：20具体为gtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggaatt；
seqidno：29具体为gtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggaaaa。
在又一实施例中，正向disruptorf12、反向disruptorr12中相应的第一序列均为20nt，正向disruptorf12、反向disruptorr12中相应的第二序列长度均为12nt(即相应disruptor长度为20 12)，作为实验组12的解链剂对。正向disruptorf12序列为seqidno：21；反向disruptorr12序列为seqidno：30。
seqidno：21具体为gtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggcatta；
seqidno：30具体为gtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcagggaaaa。
在又一实施例中，正向disruptorf13、反向disruptorr13中相应的第一序列均为20nt，正向disruptorf13、反向disruptorr13中相应的第二序列长度均为14nt(即相应disruptor长度为20 14)，作为实验组13的解链剂对。正向disruptorf13序列为seqidno：22；反向disruptorr13序列为seqidno：31。
seqidno：22具体为gtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccataaa；
seqidno：31具体为gtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggggcaaat。
在又一实施例中，正向disruptorf14、反向disruptorr14中相应的第一序列均为20nt，正向disruptorf14、反向disruptorr14中相应的第二序列长度均为16nt(即相应disruptor长度为20 16)，作为实验组14的解链剂对。正向disruptorf14序列为seqidno：23；反向disruptorr14序列为seqidno：32。
seqidno：23具体为gtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaacaaat；
seqidno：32具体为gtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggggcccataa。
在又一实施例中，正向disruptorf15、反向disruptorr15中相应的第一序列均为20nt，正向disruptorf15、反向disruptorr15中相应的第二序列长度均为18nt(即相应disruptor长度为20 18)，作为实验组15的解链剂对。正向disruptorf15序列为seqidno：24；反向disruptorr15序列为seqidno：33。
seqidno：24具体为gtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactcataa；
seqidno：33具体为gtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggggccctaaaaa。
在上述实施例中，每个disruptor的3’端增加了四个不与靶序列互补配对的碱基以阻碍其被dna聚合酶延伸，这种方法简单经济有效。
(2)荧光定量pcr反应：提前将所需试剂取出，室温融化后充分混匀。按照已经确定的反应体系配制反应溶液：1xpcr缓冲液，4mmmg2 ，0.06u/μltaq聚合酶，0.3mm四种dntp混合物，0.2μm正向引物(seqidno：1)，0.2μm反向引物(seqidno：2)，0.1μm荧光探针(seqidno：3)，正向disruptor(seqidno：10和seqidno：16至24中的一个)和相匹配的反向disruptor各2μm，以分别形成实验组6至实验组15十个组别的解链剂对；以及3000拷贝/反应某市售raav载体质粒dna。另外不加disruptor的实验作为对照。pcr的反应程序为：95℃15分钟激活taq聚合酶，45个循环的95℃变性10秒、54℃退火30秒并读取荧光和72℃延伸20秒，4℃降温1分钟。
(3)荧光定量pcr产物的电泳分析：混匀10μlpcr产物和1.5μl加样缓冲液，在3％的琼脂糖凝胶上于90v电压下电泳50分钟。
(4)图10为在反应体系中加入上述十个实验组不同解链剂对时，raav-itr荧光定量pcr实验结果与不加disruptor的实验结果对比。图11为对图10实验的荧光定量pcr终产物进行3％琼脂糖凝胶电泳实验的结果。在没有disruptor的反应条件下，pcr反应效果很差，定量pcr反应未检出扩增信号，在凝胶电泳实验中则观测不到产物条带。向反应体系中加入2μm的实验组7解链剂对和加入2μm的实验组8解链剂对时，定量pcr结果ct值分别为43.5和43.9，在凝胶电泳实验中仍观测不到产物条带。向反应体系中加入2μm的实验组9、实验组10、实验组11解链剂对时，pcr反应效果没有明显改观：定量pcr结果ct值仅仅降至约42.0、42.3和41.0，凝胶电泳实验中仅观测到亮度非常弱的产物条带。然而，向反应体系中加入2μm的实验组12解链剂对时，pcr反应效果得到显著改善：定量pcr结果ct值大幅度降至36.8，在凝胶电泳实验中观测到的产物条带的亮度也显著增强。随着disruptor的第二序列长度进一步加长，pcr反应检出的ct值进一步降低，凝胶电泳实验中观测到的产物条带亮度也进一步加强。当向反应体系中加入实验组14、实验组15和实验组6解链剂对时，定量pcr结果ct值依次降至34.6、34.6和34.9，且在凝胶电泳实验中观测到的产物条带的亮度也基本保持不变。这一结果表明解链剂中第二序列长度同样不是越长越好，在本次实验条件下，解链剂对中各解链剂的第二序列长度为16nt时对提高raav-itrpcr反应效率的作用已经达到了最大，进一步加长第二序列长度并不能进一步增强其提高raav-itrpcr反应效率的能力。
本发明中涉及的序列如表一所示。
表一
以上，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡本行业的普通技术人员均可按说明书附图所示和以上而顺畅地实施本发明；但是,凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时,凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。
1.用于提高腺相关病毒反向末端重复序列复制效率的试剂，其特征在于，所述试剂为寡聚核苷酸链，依次包括：
特异性序列，至少包括用以与itr序列t形发夹结构长茎回文靠近5’端的第一侧茎的部分或全部序列段互补配对的第一序列，及用以与所述t形发夹结构第一侧茎相邻的部分第一非互补配对序列段互补配对的第二序列；第一序列与第二序列相邻；
末端修饰结构，用以阻止所述特异性序列的3’端通过核酸聚合酶而延伸。
2.根据权利要求1所述的用于提高腺相关病毒反向末端重复序列复制效率的试剂，其特征在于，所述特异性序列还包括与所述t形发夹结构短茎回文靠近所述第一侧茎的第二侧茎的部分或全部序列段互补配对的第三序列。
3.根据权利要求1所述的用于提高腺相关病毒反向末端重复序列复制效率的试剂，其特征在于，所述末端修饰结构包括小沟结合物、倒置dna核苷酸、c3间隔区、及不与腺相关病毒模板杂交的寡聚核苷酸链。
4.根据权利要求1所述的用于提高腺相关病毒反向末端重复序列复制效率的试剂，其特征在于，所述试剂合成单体包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、非天然核苷酸；若干单体间连接方式包括磷酸二酯键连接或肽键连接。
5.根据权利要求2所述的用于提高腺相关病毒反向末端重复序列复制效率的试剂，其特征在于，所述第一序列与所述第三序列的总长度为4～46nt；所述第二序列长度为4～46nt。
6.一种腺相关病毒dna复制方法，其特征在于，在腺相关病毒dna复制体系中添加如权利要求1-5任意一项所述的用于提高腺相关病毒反向末端重复序列复制效率的试剂，通过试剂破坏所述腺相关病毒dna单链itr序列形成的t形发夹结构内的碱基配对，以消减t形发夹结构对核酸聚合酶的阻碍作用。
7.根据权利要求6所述的一种腺相关病毒dna复制方法，其特征在于，具体包括步骤：在腺相关病毒dna复制反应开始前，向反应体系中加入所述试剂；所述试剂的反应起始浓度为0.01μm～5μm。
8.根据权利要求6所述的一种腺相关病毒dna复制方法，其特征在于，当复制反应体系中包括两种互补配对的模板时，添加两种分别与两互补配对的模板相匹配的试剂或添加一种与一所述模板相匹配的试剂。
9.根据权利要求6所述的一种腺相关病毒dna复制方法，其特征在于，还包括步骤：改变试剂特异性序列总长度以调整所述试剂消减t形发夹结构对核酸聚合酶的阻碍作用。
10.如权利要求1-5任意一项所述的用于提高腺相关病毒反向末端重复序列复制效率的试剂或如权利要求6-9任意一项所述的腺相关病毒dna复制方法在以腺相关病毒为模板的pcr反应或测序反应中的应用。
技术总结