本发明涉及一种抑制鸭rig-ⅰ基因表达的sirna。
背景技术：
宿主的模式识别受体在抗病毒天然免疫中发挥重要作用。宿主细胞产生抗病毒天然免疫的过程主要依赖于模式识别受体识别病原微生物的保守结构，继而在细胞内通过一系列信号转导通路产生级联反应，诱导宿主细胞分泌抗病毒蛋白进入抗病毒免疫状态。tlr家族和rlr家族是识别rna病毒的两大主要受体家族，其中rlr家族主要参与识别细胞内的病毒核酸组分。rig-i是rlrs受体家族的代表性成员，是比较关键的细胞质内病原相关分子模式的识别受体，可识别细胞内的单、双链等rna病毒成分。
rig-ⅰ基因在2000年被首次报道，至2004年该基因被研究发现可以识别胞质内病毒rna，介导宿主的抗病毒天然免疫。2010年barber等人证实了鸡体内没有rig-ⅰ基因，并且通过westernblot和rt-pcr技术首次在鸭脾脏内分离鉴定了rig-ⅰ基因，目前对人、小鼠、猪等哺乳动物的rig-ⅰ基因的功能性研究较深入，而在家禽方面的研究起步较晚。经研究发现鸭rig-ⅰ基因能够识别禽流感病毒，通过细胞转染技术证实了鸭rig-ⅰ基因能在鸡源细胞系中表达，并能够显著抑制流感病毒的复制，据研究推测鸭rig-ⅰ基因可能在多种禽类病毒感染的过程中发挥抗病毒作用。rig-ⅰ基因由n端2个串联的效应结构域（card）、中间的dexd/h解旋酶区和c端抑制区（rd）组成。rd区的c端结构域（ctd）能够结合病毒产生的双链rna、5，三磷酸单链rna或rna/dna杂合体，激活dexh/h解旋酶区的atp酶活性，使得card暴露出来，card负责和下游接头蛋白结合，继而持续激活下游信号通路，并诱导干扰素的表达介导抗病毒天然免疫应答。
rna干扰技术是指通过引入外源性双链rna至细胞内，而引起与其同源性的mrna特异性降解，以达到沉默特定基因在rna水平上的表达，即转录后基因沉默。rna干扰特异性极强，据报道19个的核苷酸序列的双链rna就能对基因的表达产生显著抑制，而一个核苷酸序列的改变，就能解除基因的沉默状态。rna干扰技术高效、特异性强、作用迅速且副作用小，现已广泛应用于基因功能的探索和生物医学领域，该项技术的发现者mello和fire被授予了2006年的诺贝尔生理奖。
技术实现要素：
在前期的研究中，我们将鸭短喙矮小综合征病毒（sbdsv）经体外感染鸭胚成纤维细胞，通过qrt-pcr技术验证了鸭rig-ⅰ基因在sbdsv感染的过程中表达量显著升高，推测鸭rig-ⅰ基因在抗sbdsv感染的过程中发挥了一定的作用。本发明的目的旨在提供一种有效干扰鸭rig-ⅰ基因转录表达的sirna，本发明的实现方法如下：
首先通过genebank获得鸭的rig-ⅰ蛋白的cdna序列（nm_001310380.1），以rna干扰技术为基础，按sirna设计的基本原则，根据鸭的rig-ⅰ基因设计了1条21个核苷酸的sirna，其序列对应靶基因mrna序列335-357碱基位点，sirna如下：
sirna正义链：5'-ggauagaggcaacaauguuag-3'
反义链：5'-aacauuguugccucuauccgc-3'
根据本发明的优选实施例，所合成的sirna3'端还添加了两个dtdt，3'端的两个悬垂碱基增强sirna双链复合体稳定性，避免被降解。
根据本发明所述的sirna能有效的抑制鸭rig-ⅰ基因的表达，可用于制备鸭rig-i抑制剂中的应用，也可以应用于鸭rig-i基因沉默时的功能研究。本发明的有效干扰鸭rig-ⅰ基因转录表达的sirna，其核苷酸序列由ggauagaggcaacaauguuag序列或者互补序列的连续核苷酸序列组成，用于探索rig-i基因的功能及其在抗病原微生物感染过程中的作用。
具体如下:
一、合成sirna
据genebank数据库获得鸭rig-ⅰ基因cdna序列后，利用sidirectsirna设计软件，基于同时满足ui-tei、reynolds、amarzguioui等人对sirna有效选择的三种算法的sirna作为候选，然后从中挑选出gc含量在35-50%的sirna，再将所挑选的sirna通过ncbiblast功能genebank数据库收录的鸭基因组序列进行比对，排除具有同源性的sirna，设计出如下sirna，其中正义链序列与靶基因上设计的靶点序列相同（u取代t），反义链序列与靶点序列完全互补（u取代t）：
sirna正义链：5'-ggauagaggcaacaauguuag-3'
反义链：5'-aacauuguugccucuauccgc-3'
通过化学合成sirna序列，并于3'末端加两个悬垂dtdt，以增强sirna的稳定性。据鸭rig-ⅰ基因序列，设计rig-ⅰ基因引物用于qrt-pcr实验检测rig-ⅰ基因的表达;，
二、细胞转染、rna提取及反转录
atccmem（含10%胎牛血清）完全培养基用于细胞培养，在转染前天将atccdef（永生化的鸭胚成纤维细胞）传代铺于6孔板内，每孔2ml。待第二天细胞生长至40-60%密度时，将培养基换为不含抗生素及血清的atccmem，将事先合成的sirna通过脂质体转染试剂lipofectamine2000（invitrogen）转染至生长细胞内，sirna100nm/孔。转染后12h将培养基换成含10%胎牛血清的atccmem，在37℃6%co2湿度90%恒温箱中继续培养24h，之后每孔接种鸭短喙矮小综合征病毒sbdsvm15300μl/孔，接毒24h后用trizol法（全式金总rna提取试剂盒）提取转染后的def细胞rna，提取总rna用dnaaseⅰ彻底消化残留基因组dna，纯化后的rna经hifairⅲ1ststrandcdnasynthesis（yeason公司）逆转录为cdna。以上各实验具体操作均按照产品说明书进行。该实验共设计了以下分组：正常生长的def细胞、仅加入lipofectamine2000转染试剂的def细胞、sirna通用阴性对照（sirnanctl）、sirnafam-通用阴性对照(sirnafam-nctl)和rig-ⅰsirna。
三、qrt-pcr检测
将反转录后的cdna稀释一倍后用transstarttopgreenqpcrsupermix（全式金）进行qpcr反应。反应条件如下：20μl反应体系，每个体系加1μlcdna模板。
qpcr反应程序（以两步法为例）：94℃预变性30sec；94℃变性5sec，60℃退火-延伸30sec，40个循环；60-95℃溶解曲线阶段。
以gapdh为内参，以下为qpcr反应所用的鸭源gapdh和rig-i引物序列：
图1为qrt-pcr对各实验组rig-ⅰ基因表达情况的检测结果。由图1可知，转染rig-ⅰsirna的defs细胞与未转染组以及转染的n-ctl对照组相比，其rig-ⅰ基因的mrna表达水平显著下降，说明合成的rig-ⅰsirna能够高效特异的抑制鸭rig-ⅰ基因的表达。
图2为各组pcr产物经１％琼脂糖凝胶电泳图，所用引物为以上rig-ⅰ基因的qrcr引物，由图2可见，该产物片段大约90bp与预期的产物大小相符（92bp），且rig-i基因sirna处理组扩增产物的电泳条带显著弱于对照组，这与qrt-pcr结果相互印证。
根据本发明所述的sirna能有效的抑制鸭rig-i基因的表达，可用于制备鸭rig-i抑制剂中的应用，也可以应用于鸭rig-i基因沉默时的功能研究。
上述所有实施例所涉及到的分子生物技术包括细胞的培养、pcr、电泳、细胞转染、rna提取与逆转录等均为本领域研究人员所知的常规技术，所涉及的有关设备及仪器也均为从事本领域研究人员可通过公共途径获取。
与现有技术比较,本发明的特点在于率先发现能显著抑制鸭rig-i基因的sirna，并用于开展rig-i相关功能研究。
附图说明
图1为本发明经qrt-pcr检测各处理组的rig-i基因表达情况图。
图2为各处理组的核酸凝胶电泳图。
1.抑制鸭rig-i基因表达的sirna,其特征在于,
首先通过genebank获得鸭的rig-ⅰ蛋白的cdna序列（nm_001310380.1），以rna干扰技术为基础，按sirna设计的基本原则，根据鸭的rig-ⅰ基因设计了1条21个核苷酸的sirna，其序列对应靶基因mrna序列335-357碱基位点，sirna如下：
sirna正义链：5'-ggauagaggcaacaauguuag-3';
反义链：5'-aacauuguugccucuauccgc-3';
所合成的sirna3'端还添加了两个dtdt，3'端的两个悬垂碱基增强sirna双链复合体稳定性，避免被降解;有效干扰鸭rig-i基因转录表达的sirna，其核苷酸序列由ggauagaggcaacaauguuag序列或者互补序列的连续核苷酸序列组成；
合成sirna:
据genebank数据库获得鸭rig-ⅰ基因cdna序列后，利用sidirectsirna设计软件，基于同时满足ui-tei、reynolds、amarzguioui等人对sirna有效选择的三种算法的sirna作为候选，然后从中挑选出gc含量在35-50%的sirna，再将所挑选的sirna通过ncbiblast功能genebank数据库收录的鸭基因组序列进行比对，排除具有同源性的sirna，设计出如下sirna，其中正义链序列与靶基因上设计的靶点序列相同,u取代t，反义链序列与靶点序列完全互补（u取代t）：
sirna正义链：5'-ggauagaggcaacaauguuag-3';
反义链：5'-aacauuguugccucuauccgc-3';
通过化学合成sirna序列，并于3'末端加两个悬垂dtdt，以增强sirna的稳定性;
细胞转染、rna提取及反转录:
atccmem（含10%胎牛血清）完全培养基用于细胞培养，在转染前天将atccdef（永生化的鸭胚成纤维细胞）传代铺于6孔板内，每孔2ml;待第二天细胞生长至40-60%密度时，将培养基换为不含抗生素及血清的atccmem，将事先合成的sirna通过脂质体转染试剂lipofectamine2000（invitrogen）转染至生长细胞内，sirna100nm/孔;转染后12h将培养基换成含10%胎牛血清的atccmem，在37℃6%co2湿度90%恒温箱中继续培养24h，之后每孔接种鸭短喙矮小综合征病毒sbdsvm15300μl/孔，接毒24h后用trizol法（全式金总rna提取试剂盒）提取转染后的def细胞rna，提取总rna用dnaaseⅰ彻底消化残留基因组dna，纯化后的rna经hifairⅲ1ststrandcdnasynthesis逆转录为cdna;
qrt-pcr检测:
将反转录后的cdna稀释一倍后用transstarttopgreenqpcrsupermix（全式金）进行qpcr反应;反应条件如下：20μl反应体系，每个体系加1μlcdna模板;
qpcr反应程序：94℃预变性30sec；94℃变性5sec，60℃退火-延伸30sec，40个循环；60-95℃溶解曲线阶段。
技术总结